本發(fā)明涉及細(xì)胞因子的用途技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及重組的人源Ang-1在制備保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞免于人抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

人類器官供體的缺乏是器官移植的最主要的限制之一。豬器官被認(rèn)為是解決這個(gè)問(wèn)題的最適宜的供體來(lái)源?？墒?，在豬器官移植到靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，凝血調(diào)節(jié)紊亂和炎癥反應(yīng)仍然是一個(gè)問(wèn)題。血管內(nèi)皮細(xì)胞，這類細(xì)胞與人類免疫細(xì)胞的相互作用在異種移植中具有重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能性失調(diào)在炎癥與凝血反應(yīng)的發(fā)展中具有重要的影響因素，并且在靈長(zhǎng)類動(dòng)物或者人類受體中，能夠影響后來(lái)豬異種移植后的存活時(shí)間。在血清中，異源抗體，例如，Gal抗體和Neu5Gc抗體，能夠誘導(dǎo)由抗體介導(dǎo)的依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。在炎癥反應(yīng)中，細(xì)胞因子起重要的作用。在以前的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)人源IL-4和IL-13，而不是IL-11，TGF-β₂或者IL-10，保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞防止通過(guò)激活的PI3K/AKT信號(hào)途徑而進(jìn)行的人類抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性(CDC)。可是，這些細(xì)胞因子抑制或者促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞毒性，是否是通過(guò)人類抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性，人們?nèi)匀皇遣磺宄?。在血管發(fā)育中血管生成素具有重要的作用并且它們可以穩(wěn)定其整體性。血管生成素1(Ang-1)是一種對(duì)內(nèi)皮血管特異性受體酪氨酸激酶2的特異配體，這個(gè)激酶在血管成熟和血管重塑中具有重要的意義。Ang-1/Tie2途徑能夠增強(qiáng)血管的整體性和通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)途徑的從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活時(shí)間。Ang-2與Ang1共用Tie2受體，在與Ang1共通作用下，同樣的被認(rèn)為在血管增長(zhǎng)和血管重塑過(guò)程具有重要的作用。對(duì)于Tie2，Ang-1被認(rèn)為是一種激動(dòng)劑，而Ang-2被認(rèn)為是拮抗劑，起相反的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1和Ang-2保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞防止通過(guò)激活的PI3K/AKT信號(hào)途徑而進(jìn)行的人類抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性。Ang-1和Ang-2不能改變IgM或者IgG對(duì)于PIECs的結(jié)合，以及在Ang-1和Ang-2處理下不能上調(diào)表達(dá)PIECs補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子(CD46、CD55和CD59)。

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種重組的人源Ang-1在制備保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞免于人抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性的藥物中的用途。

進(jìn)一步地，上述豬內(nèi)皮細(xì)胞是豬髂骨動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。

進(jìn)一步地，上述重組的人源Ang-1是通過(guò)腺病毒介導(dǎo)表達(dá)的人源Ang-1。

進(jìn)一步地，上述腺病毒介導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和/或半定量PCR檢測(cè)人源Ang-1的mRNA的表達(dá)水平。

進(jìn)一步地，上述實(shí)時(shí)定量PCR和/或半定量PCR所使用的用于檢測(cè)人源Ang-1的引物對(duì)是：

5’-aaacatgaagtcggagatgg-3’(SEQ ID NO:1)和

5’-ttctccagcagctgtatctc-3’(SEQ ID NO:2)。

進(jìn)一步地，上述實(shí)時(shí)定量PCR和/或半定量PCR以GAPDH作為內(nèi)參，用于檢測(cè)上述內(nèi)參的引物對(duì)是：

5’-acagacagccgtgtgttcc-3’(SEQ ID NO:5)和

5’-accttcaccatcgtgtctca-3’(SEQ ID NO:6)。

進(jìn)一步地，上述重組的人源Ang-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路來(lái)保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞免于人抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性。

基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，Ang-1和Ang-2保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC，因此Ang-1和Ang-2可以作為制備保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞免于人抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性的藥物的重要活性成分。

附圖說(shuō)明

圖1顯示Ang-1和Ang-2誘導(dǎo)保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC。(A)PIECs用重組人EGF(100ng/ml)、bFGF(50ng/ml)、VEGF₁₆₅(100ng/ml)、IL-33(40ng/ml)、IL-17(100ng/ml)、Ang-1(500ng/ml)、IL-4(20ng/ml)或作為陰性對(duì)照(NC)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，然后暴露于人血清以誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。(B)PIECs用不同濃度的rhAng-1(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時(shí)，然后暴露于人血清誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。(C)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)或培養(yǎng)基作為NC處理0、24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)，然后暴露于人血清以誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。(D-E)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理0、24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)，然后暴露于人血清誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。通過(guò)CCK8(D)或中性紅(E)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的程度。(F)PIEC用不同濃度的rhAng-2(200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時(shí)，然后暴露于人血清誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。(G)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)、rhAng-1加rhAng-2或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時(shí)，然后暴露于人血清誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(平均值±SEM)。通過(guò)Student's t檢驗(yàn)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖2顯示利用腺病毒系統(tǒng)在PIECs中異位表達(dá)Ang-1和Ang-2保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC。(A)使用腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建人Ang-1或Ang-2基因。包裝腺病毒。PIECs用ADV-Ang-1，ADV-Ang-2或ADV-EV(空載體)感染72小時(shí)，然后暴露于人血清誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。(B-C)PIECs用ADV-Ang-1(B)，ADV-Ang-2(C)或ADV-EV感染72小時(shí)。收集總RNA用于RT-PCR分析。用人Ang-1引物(B)或Ang-2引物(C)評(píng)估m(xù)RNA水平，并標(biāo)準(zhǔn)化至豬GAPDH。(D)如(B-C)中所述收集RNA，并使用人Ang-1、Ang-2或豬GAPDH引物通過(guò)半定量PCR評(píng)估m(xù)RNA水平(N.D.＝未測(cè)定)。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(平均值±SEM)。通過(guò)Student's t檢驗(yàn)，***p<0.001。

圖3顯示在PIEC中，rhAng-1或rhAng-2不上調(diào)CD46、CD55或CD59的表達(dá)。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)(A)或rhAng-2(500ng/ml)(B)處理0、2h、6h或12h。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)CD46、CD55或CD59的mRNA水平。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(平均值±SEM)。

圖4顯示人IgG或IgM與PIECs的結(jié)合程度不受rhAng-1或rhAng-2影響。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)、rhAng-2(500ng/ml)或作為NC的培養(yǎng)基處理48小時(shí)，然后與熱滅活的人血清溫育30分鐘。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(A)檢測(cè)人IgM和IgG與PIEC的結(jié)合。通過(guò)幾何平均熒光強(qiáng)度(Gmean)(B)評(píng)價(jià)人IgM或IgG與PIEC的結(jié)合程度。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(平均值±SEM)。通過(guò)Student's t檢驗(yàn)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

圖5顯示rhAng-1或rhAng-2需要PI3K/AKT途徑以誘導(dǎo)保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC。(A-B)PIECs用rhAng-1(500ng/ml)(A)或rhAng-2(500ng/ml)(B)處理0、15分鐘、30分鐘或60分鐘。使用針對(duì)p-AKT和肌動(dòng)蛋白的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析裂解物。(C-D)PIECs用渥曼青霉素(wortmannin)(100ng/ml)或DMSO處理3小時(shí)，然后暴露于rhAng-1(500ng/ml)(C)或rhAng-2(500ng/ml)(D)0或15分鐘。通過(guò)用針對(duì)p-AKT和肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行western印跡分析裂解物。(E-F)PIECs用渥曼青霉素(100ng/ml)或DMSO處理3小時(shí)，然后暴露于rhAng-1(500ng/ml)(E)、rhAng-2(500ng/ml)(F)或作為NC的培養(yǎng)基48小時(shí)，然后暴露于人血清以誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的CDC。數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(平均值±SEM)。通過(guò)Student's t檢驗(yàn)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞系

實(shí)驗(yàn)中主要培養(yǎng)的細(xì)胞系是豬髂骨動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PIECs)。

1.2細(xì)胞因子

重組人的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、VEGF₁₆₅、IL-33、IL-17、Ang-1、Ang-2和IL-4均購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.3抗體

肌動(dòng)蛋白(Actin)和p-AKT購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.4實(shí)驗(yàn)試劑

渥曼青霉素(Wortmannin)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。其它試劑為常規(guī)試劑。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的細(xì)胞系用含10％胎牛血清、1％P/S，DMEM培養(yǎng)基。溫度37℃，5％二氧化碳飽和濕度。

2.2抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

在96孔板中培養(yǎng)PIECs，每孔4×10³個(gè)細(xì)胞，用重組細(xì)胞因子刺激0、24h、48h、72h(圖1C)，所有其他實(shí)驗(yàn)延長(zhǎng)48h。細(xì)胞因子刺激后棄培養(yǎng)基，加入含20％混合的多名健康人的血清(n＝20，含ABO血型)孵育2h，以熱滅活的人血清作為對(duì)照。2h后，用CCK8檢測(cè)PIECs的活性(圖1D)，棄培養(yǎng)基并加入含10％CCK8的RPMI-1640孵育2h。采用multiscan GO分光光度計(jì)測(cè)OD450吸光度。細(xì)胞死亡率(細(xì)胞毒性)按以下公式計(jì)算：

％細(xì)胞性＝(對(duì)照毒組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD×100

細(xì)胞存活性亦采用中性紅色染色方法檢測(cè)(圖1E)，細(xì)胞毒性百分率采用與CCK8同樣的計(jì)算方法計(jì)算。

2.3腺病毒介導(dǎo)的Ang-1和Ang-2在PIECs中的表達(dá)

按照文獻(xiàn)Song X,H Gao,Y Lin,et al.Alterations in the microbiota drive interleukin-17C production from intestine epithelial cells to promote tumorigenesis[J].Immunity,2014,40(1):140-152構(gòu)建腺病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建ADV-Ang-1和ADV-Ang-2質(zhì)粒后，將ADV-Ang-1、ADV-Ang-2及空載體ADV-EV轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝腺病毒。對(duì)重組腺病毒進(jìn)行擴(kuò)增、純化、滴度檢測(cè)及稀釋，終濃度為10¹⁰至10¹¹/mlPBS。ADV-Ang-1、ADV-Ang-2、ADV-EV感染PIECs72h，然后暴露于人血清誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)CDC。

2.4實(shí)時(shí)定量PCR和半定量PCR檢測(cè)人Ang-1和Ang-2的mRNA水平

采用提取總RNA，用Transcript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(中國(guó)北京TransGene Biotech公司)合成cDNA。采用SYBRPremix Ex Taq試劑盒(中國(guó)大連Takara公司)檢測(cè)人的Ang-1和Ang-2基因水平。這兩種基因的表達(dá)以均以GAPDH作為內(nèi)參，以2^-ΔΔct方法計(jì)算。在ViiA7實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)上進(jìn)cDNA的擴(kuò)增，對(duì)于半定量PCR，使用人Ang-1、Ang-2或豬GAPDH引物通過(guò)PCR擴(kuò)增cDNA，PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳

核苷酸引物的序列如下：

人的Ang-1：5’-aaacatgaagtcggagatgg-3’(SEQ ID NO：1)和

5’-ttctccagcagctgtatctc-3’(SEQ ID NO：2)。

人的Ang-2：5’-agaaccagacggctgtgatg-3’(SEQ ID NO：3)和

5’-gaagttcaagtctcgtggtct-3’(SEQ ID NO：4)。

豬的GAPDH：5’-acagacagccgtgtgttcc-3’(SEQ ID NO：5)和

5’-accttcaccatcgtgtctca-3’(SEQ ID NO：6)。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IgG、IgM的結(jié)合

混合多名健康人的血清在56℃中加熱滅活30min。取1×10⁶個(gè)PIECs細(xì)胞，用20％滅活的人血清在37℃孵育30min。PBS洗一次后，加入10％山羊血清避免非特異性結(jié)合，再加入FITC標(biāo)記的山羊抗人IgM和IgG抗體，避光4℃條件下孵育30min，以不加人血清的細(xì)胞作為對(duì)照組。清洗之后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，IgG、IgM與PIECs的結(jié)合程度以幾何平均熒光強(qiáng)度表示。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1Ang-1和Ang-2保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC

重組的人源Ang-1(rhAng-1)保護(hù)PIECs免于人抗體介導(dǎo)的CDC，殺傷效率從65％下降到25％(圖1A)。rhAng-1的保護(hù)效果優(yōu)于rhIL-4(圖1A)。然而，在這個(gè)模型中，人源EGF、bFGF、VEGF₁₆₅、IL-33和IL-17對(duì)于PIECs并沒(méi)有顯示出保護(hù)效應(yīng)(圖1A)。劑量依賴的實(shí)驗(yàn)表明rhAng-1保護(hù)PIECs免于人抗體介導(dǎo)的CDC是劑量依賴的(圖1B)。rhAng-1預(yù)處理PIECs48h或者72h比24h的保護(hù)效果更好(圖1C)。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們利用500ng/ml的rh-Ang-1處理PIECs48h。

Ang-2是血管生成素家族的另一個(gè)成員，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其與Ang-1存在拮抗效應(yīng)。我們利用這個(gè)模型探究Ang-2的作用。令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)Ang-2與Ang-1的效應(yīng)相似(圖1D-E)。我們利用中性紅和CCK-8兩種試劑評(píng)估殺傷效率得出相似的結(jié)果(圖1D-E)。500ng/ml的rhAng-2預(yù)處理PIECs的保護(hù)效果更好(圖1F)。rhAng-1和rhAng-2共同處理PIECs所顯現(xiàn)的保護(hù)效果與Ang-1、Ang-2單獨(dú)處理效果相似(圖1G)。因此Ang-2并沒(méi)有抑制Ang-1介導(dǎo)的PIECs的保護(hù)效應(yīng)，這兩個(gè)細(xì)胞因子對(duì)于PIECs的保護(hù)也沒(méi)顯示出協(xié)同效應(yīng)。

3.2在PIECs中，腺病毒介導(dǎo)的Ang-1、Ang-2過(guò)表達(dá)保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC

我們利用腺病毒系統(tǒng)在PIECs中異位表達(dá)Ang-1和Ang-2。ADV-Ang-1或者ADV-Ang-2感染過(guò)的PIECs顯著的保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC(圖2A)。ADV-Ang-1或ADV-Ang-2的保護(hù)效果與rhAng-1或rhAng-2的保護(hù)效果很接近。實(shí)時(shí)定量PCR和半定量PCR的結(jié)果表明感染ADV-Ang-1或ADV-Ang-2的PIECs中Ang-1或Ang-2的表達(dá)水平很高。

3.3 Ang-1或Ang-2并沒(méi)有影響補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的表達(dá)以及人源抗體結(jié)合PIECs的水平

接下來(lái)，我們?nèi)ヌ骄科渲械臋C(jī)制，我們首先想到Ang-1或Ang-2是否增加了補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)或者減少了結(jié)合到PIECs的人源IgM或IgG。我們發(fā)現(xiàn)，Ang-1或Ang-2并沒(méi)有上調(diào)CD46和CD55、CD59的mRNA水平反而有一定的下調(diào)，雖然這下調(diào)并不顯著(圖3A-B)。

我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析IgG或IgM結(jié)合PIECs的水平，發(fā)現(xiàn)Ang-1、Ang-2處理組和對(duì)照組并沒(méi)有明顯差別(圖4A；統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示在4B)。

Ang-1還具有下調(diào)一些連接蛋白的表達(dá)水平，例如Zo-1、Occludin和VE-cadherin，進(jìn)而達(dá)到抗?jié)B的作用。先前有報(bào)道顯示連接蛋白Claudin 5上調(diào)可以保護(hù)豬的內(nèi)皮細(xì)胞免于人源抗體介導(dǎo)的CDC，所以我們利用Ang-1處理PIECs并檢測(cè)了Claudin-5、Zo-1和Occludin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因并沒(méi)有上調(diào)(數(shù)據(jù)沒(méi)顯示)。

3.4 PI3K/AKT通路對(duì)于Ang-1或Ang-2介導(dǎo)的PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC的保護(hù)效應(yīng)是必需的

先前的報(bào)道表明IL-4通過(guò)激活PI3K/AKT通路保護(hù)豬的內(nèi)皮細(xì)胞免于人源抗體介導(dǎo)的CDC。Ang-1或Ang-2能夠激活PI3K/AKT通路促進(jìn)ECs的存活。我們探究Ang-1或Ang-2是否通過(guò)激活PI3K/AKT通路保護(hù)PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC。

我們發(fā)現(xiàn)，在PIECs中，rhAng-1或rhAng-2激活了p-AKT(圖5A-B)。我們利用PI3K的特異性抑制劑-wortmannin處理PIECs，發(fā)現(xiàn)wortmannin抑制了Ang-1或者Ang-2誘導(dǎo)了p-AKT的激活(圖5C-D)。Wortmannin抑制了Ang-1或Ang-2介導(dǎo)的PIECs的保護(hù)效應(yīng)(圖5E-F)。我們也檢測(cè)了下游促凋亡和抑凋亡基因是否受到調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在在Ang-1或Ang-2處理的PIECs中抑凋亡基因Bcl-2，Bcl-xl和促凋亡基因Bad的水平并沒(méi)有明顯變化(數(shù)據(jù)沒(méi)顯示)。這些數(shù)據(jù)表明PI3K/AKT通路對(duì)于Ang-1或Ang-2介導(dǎo)的PIECs免于人源抗體介導(dǎo)的CDC是必需的，下游調(diào)控的基因仍然有待于進(jìn)一步研究。

4討論

在免疫調(diào)控中，細(xì)胞因子扮演著重要的角色，但是在異種移植中它們的功能是不清楚的。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，Ang-1和Ang-2保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞防止通過(guò)激活的PI3K/AKT信號(hào)途徑而進(jìn)行的人源抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性。在PIECs中，重組細(xì)胞因子和重組腺病毒過(guò)量表達(dá)Ang-1或者Ang-2人源抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)人源Ang-1和Ang-2不能上調(diào)表達(dá)PIECs補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子(CD46、CD55和CD59)。并且在Ang-1和Ang-2處理下，人類IgM或者IgG對(duì)PIECs結(jié)合時(shí)沒(méi)有改變的。這些結(jié)果說(shuō)明Ang-1和Ang-2在保護(hù)PIECs防止人源抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性的功能上具有相似性。在豬－非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物異種移植的模型中，Ang-1和Ang-2促進(jìn)了異種移植的存活時(shí)間。由于腺病毒過(guò)來(lái)表達(dá)Ang-1或者Ang-2模擬轉(zhuǎn)基因豬種所達(dá)到的表達(dá)量，我們推測(cè)在異種移植中，Ang-1轉(zhuǎn)基因豬能夠保護(hù)器官的存活。由于在胚胎期，Ang-2轉(zhuǎn)基因小鼠中顯示出干擾血管形成，所以Ang-2轉(zhuǎn)基因豬仔血管生成的過(guò)程中有一定的缺陷。

血管生成素，結(jié)合Tie2受體的一類糖蛋白，包括Ang-1、Ang-2和Ang-3/Ang-4。Ang-1是一個(gè)通過(guò)它對(duì)Tie2包外的高親和性結(jié)合第一個(gè)被鑒定出來(lái)的。通過(guò)同源性比對(duì)，Ang-2氨基酸相似性達(dá)到60％。Ang-1在血管生成和血管重塑上具有重要作用，它對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有抗炎反應(yīng)，增加存活時(shí)間和抗?jié)B透作用。Ang-1通過(guò)影響交界基因的表達(dá)，例如Zo-1、Occludin和VE-cadherin，來(lái)抑制滲透作用。此前的報(bào)道顯示，連接蛋白Claudin-5的上調(diào)表達(dá)防止人類抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性來(lái)保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞?？墒?，我們發(fā)現(xiàn)Ang-1不能增加Claudin-5、Zo-1和Occludin的mRNA水平，這就說(shuō)明在PIECs中，Claudin-5不是主要因素對(duì)于Ang-1調(diào)節(jié)保護(hù)。當(dāng)PIECs暴露在人血清CDC中，在PI3K抑制劑，wortmannin，能夠抑制Ang-1/Ang-2調(diào)節(jié)的防護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明PI3K/AKT介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的存活是Ang-1/Ang-2介導(dǎo)對(duì)PIECs防護(hù)作用的主要因素。但是在Ang-1/Ang-2處理PIECs后，抗凋亡下游基因的表達(dá)，Bcl-2和Bcl-xl沒(méi)有增加，促凋亡基因Bad也沒(méi)有下降。這些結(jié)果說(shuō)明，由Ang-1/Ang-2調(diào)節(jié)的PI3K/AKT調(diào)控其他保護(hù)PIECs的基因來(lái)抑制人類抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)Ang-1和Ang-2，通過(guò)相似的機(jī)制，防止人類抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴型細(xì)胞毒性來(lái)保護(hù)豬內(nèi)皮細(xì)胞，以及通過(guò)激活PI3K/AKT途徑促進(jìn)PIECs的存活。Ang-1和Ang-2是異種移植潛在的研究目標(biāo)。Ang-1和Ang-2對(duì)于靈長(zhǎng)類的調(diào)控可能對(duì)異種移植具有防護(hù)作用，以免受到補(bǔ)體的損傷和提升起存活時(shí)間。Ang-1轉(zhuǎn)基因豬對(duì)異種移植有重要的使用價(jià)值。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民醫(yī)院

<120> 重組的人源Ang-1在制備藥物中的用途

<130> 17I23950

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<170> PatentIn version 3.3

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