本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程與生物醫(yī)藥應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及APO-E蛋白及其多肽在治療與預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％，在很多地區(qū)已經(jīng)超過子宮癌，成為嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的腫瘤之一。乳腺癌的發(fā)病與患者的遺傳基因、生活習(xí)慣、常用食物、生育狀況等緊密相關(guān)，不同人種、地域的乳腺癌發(fā)病率有著明顯的區(qū)別。乳腺癌的高發(fā)地區(qū)，主要集中在北美、北歐和大洋洲，尤其白種女性居多。乳腺癌的中發(fā)地區(qū)，集中在南美、南歐和以色列。亞洲則是乳腺癌的低發(fā)地區(qū)。舉例來說，美國(guó)白種女性一生乳腺癌發(fā)病率為13.1％，即平均每8-9人就有1人可能會(huì)患上乳腺癌，而亞洲女性的乳腺癌發(fā)病率為4-7％。WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)乳腺癌達(dá)130萬人左右，死亡50萬人左右。在我國(guó)北京、上海、天津等大城市的乳腺癌發(fā)病已躍居女性各種癌瘤首位,而且有明顯上升的趨勢(shì)。肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種。原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)男性癌癥患者中，肝癌比例排第六，死亡率排在第二；在女性癌癥患者中，肝癌比例排第七，死亡率排第六。2008年，全世界共有748,300個(gè)新增肝癌病例，有695,900例肝癌患者死亡。而這些新增肝癌病例和死亡病例中有一半在中國(guó)。肝癌發(fā)生率最高的區(qū)域主要在東亞，東南亞，中非和西非國(guó)家。亞洲部分地區(qū)和非洲撒哈拉以南地區(qū)之所以肝癌發(fā)生率較高，可能是因?yàn)檫@些地區(qū)HBV盛行，因?yàn)檫@些地區(qū)8％的居民慢性感染HBV，在發(fā)展中國(guó)家60％的肝癌患者感染過HBV。載脂蛋白(apolipoprotein，apo)是血漿脂蛋白的主要組分，其中脂蛋白E(apoE)是載脂蛋白家族成員中重要的一種。血漿中60％-80％的apoE主要由肝臟分泌。apo作為一種多功能的血漿脂蛋白，在維持脂蛋白的結(jié)構(gòu)，脂類代謝調(diào)節(jié)以及神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要的作用。此外，研究顯示apoE在免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤發(fā)生中也起到關(guān)鍵作用。某些癌癥組織，如肝癌組織中apoE的表達(dá)明顯升高，此外apoE的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后有著密切的聯(lián)系。熱休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)是一類在生物進(jìn)化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。HSP根據(jù)同源程度和分子量大小可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多個(gè)亞家族。熱休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)gp96屬于HSP90亞家族的成員，該蛋白是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上含量最豐富的熱休克蛋白。熱休克蛋白gp96蛋白具有多肽結(jié)合特性，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)其能接受來自TAP復(fù)合體的多肽片段，協(xié)助將其組裝至MHCI類分子，遞呈于細(xì)胞膜上。不同組織來源的熱休克蛋白gp96能攜帶有其來源組織內(nèi)特異性表達(dá)的多肽片段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防及治療癌癥的靶標(biāo)蛋白及其多肽的應(yīng)用方法。本發(fā)明首先提供了一種APO-E蛋白，所述APO-E蛋白的氨基酸序列含有如下：i)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或ii)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列自N端起第2位至最后一位氨基酸序列；或iii)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。本發(fā)明提供了上述APO-E蛋白在制備預(yù)防和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了編碼APO-E蛋白的基因，該基因的核苷酸序列含有如下：i)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或iii)與SEQIDNO.1所示的核苷酸具有75％及以上同源性的核苷酸序列；或iv)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO.1所示序列雜交的核苷酸序列；所述嚴(yán)格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。本發(fā)明提供了編碼APO-E蛋白的基因在制備預(yù)防和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了含有編碼APO-E蛋白的基因的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、工程菌、昆蟲或酵母。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述生物材料在制備預(yù)防和/或治療癌癥藥物中的應(yīng)用。所述藥物為治療或預(yù)防乳腺癌或肝癌的藥物，具有以下至少一種的功能：(1)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)生率；(2)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生率；(3)減緩或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的生長(zhǎng)；(4)減緩或停止已建立的肝癌腫瘤灶的生長(zhǎng)；(5)減少或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(6)減少或停止已建立的肝癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(7)誘導(dǎo)產(chǎn)生乳腺癌特異性的CTL細(xì)胞并對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷；(8)誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌特異性的CTL細(xì)胞并對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷。本發(fā)明提供了含有APO-E蛋白或其多肽的藥物。本發(fā)明提供了含有APO-E蛋白與熱休克蛋白gp96組成的復(fù)合物或含有APO-E蛋白的多肽與熱休克蛋白gp96組成的復(fù)合物的藥物。所述熱休克蛋白gp96的氨基酸序列含有SEQIDNO.4所述的序列或SEQIDNO.4所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。所述熱休克蛋白gp96的獲得方式為以下任一：(1)從離體哺乳動(dòng)物的胎盤組織中提取；(2)將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)，包括利用酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)，純化得到。所述離體哺乳動(dòng)物可為人、鼠來源。所述鼠包括但不限于C57BL/6及BALB/c小鼠。所述復(fù)合物是通過以下方式獲得：(1)將APO-E蛋白或其多肽與熱休克蛋白gp96在體外以自然吸附或熱擊方式形成復(fù)合物；或(2)將編碼APO-E蛋白或其多肽與編碼熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中，培養(yǎng)、純化獲得復(fù)合物。所述“將編碼APO-E蛋白或其多肽與編碼熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中”可通過漢遜酵母表達(dá)。所述“將編碼所述熱休克蛋白gp96的核酸分子導(dǎo)入受體中”可通過向受體中導(dǎo)入重組載體實(shí)現(xiàn)；所述重組載體可為將所述熱休克蛋白gp96的編碼基因插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96。所述重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96具體可為在質(zhì)粒pFastBac1的多克隆位點(diǎn)插入序列表中SEQIDNO.3所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96具體可為將質(zhì)粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pFastBac1被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為SEQIDNO.1所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述受體可為Sf9細(xì)胞。本發(fā)明提供了上述APO-E蛋白及其多肽與熱休克蛋白gp96組成的復(fù)合物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物中的應(yīng)用。所述藥物為治療或預(yù)防乳腺癌或肝癌的藥物，具有以下至少一種的功能：(1)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)生率；(2)降低化學(xué)物誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生率；(3)減緩或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的生長(zhǎng)；(4)減緩或停止已建立的肝癌腫瘤灶的生長(zhǎng)；(5)減少或停止已建立的乳腺癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(6)減少或停止已建立的肝癌腫瘤灶的轉(zhuǎn)移；(7)誘導(dǎo)產(chǎn)生乳腺癌特異性的CTL細(xì)胞并對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷；(8)誘導(dǎo)產(chǎn)生肝癌特異性的CTL細(xì)胞并對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷。應(yīng)用本發(fā)明的上述藥物，針對(duì)免疫對(duì)象，免疫劑量為每次不少于10μg，總共不少于3次，采取皮下注射、皮內(nèi)注射或腹腔注射方式進(jìn)行免疫。本發(fā)明的藥物(疫苗)免疫數(shù)周后，可引發(fā)機(jī)體的特異免疫反應(yīng)，清除體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞和/或腫瘤休眠細(xì)胞，以及癌變的細(xì)胞，從而達(dá)到預(yù)防和治療癌癥的目的。本發(fā)明可作為腫瘤預(yù)防性疫苗，用于自體或異體腫瘤防治，降低健康人群中癌癥的發(fā)生率，也可作為腫瘤治療性疫苗，患者術(shù)后即時(shí)施治能有效防轉(zhuǎn)移防復(fù)發(fā)，或作為化學(xué)療法的輔助治療。本發(fā)明的也可以用于異體腫瘤的免疫防治。附圖說明圖1為胎盤gp96的SDS-PAGE和Westernblot鑒定結(jié)果。圖2為酵母表達(dá)gp96的SDS-PAGE和WesternBlot鑒定結(jié)果，圖中，1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：步驟2的發(fā)酵液；3：親和層析后的洗脫液；4：離子交換層析后的洗脫液；5：westernblot鑒定圖。。圖3為昆蟲表達(dá)gp96的SDS-PAGE和WesternBlot的鑒定結(jié)果。圖4為多肽-gp96復(fù)合物對(duì)乳腺癌的治療作用(腫瘤體積)。圖5為多肽-gp96復(fù)合物對(duì)肝癌的治療作用(腫瘤體積)。圖6為多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞殺傷作用。圖7位多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)于人乳肝癌細(xì)胞殺傷作用。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。雌性C57BL/6與雌性BALB/C小鼠為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司產(chǎn)品；在下文中簡(jiǎn)稱小鼠。多肽由上海吉爾生化有限公司合成。HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)為ATCC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為HB-8065TM。MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)為ATCC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為HTB-22TM。H22及HHCC細(xì)胞購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，資源號(hào)分別為3111C0001CCC000309、3111C0002000000069。Sf9細(xì)胞為Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為11496-015。CellfectinIIreagent為L(zhǎng)ifetechnologies公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10362-100。質(zhì)粒pFastBacTM1為Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為10359-016。gp96單克隆抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為sc-56399。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為ZB-2307。HiTrap-QSepharose離子交換層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5053-01。Superdex20010/300GL分子篩層析柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17517501。大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為CL108-01。Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine為L(zhǎng)ONZA公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為12-730Q。BSA、PMSF、NaHCO3、MnCl2、CaCl2、NaCl2、Tris、甲基α-D-吡喃甘露糖苷均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為V900933、P7626、792519、V900197、793639、746398、T1378、M6882。溶液A：溶質(zhì)及其濃度為PMSF1mM和NaHCO330mM；溶劑為蒸餾水；pH值為7.4。溶液B：溶質(zhì)及其濃度為2mMMnCl2、2mMCaCl2、500mMNaCl和PMSF1mM；溶劑為pH7.4、20mMTris-HCl緩沖液。溶液C：溶質(zhì)及其濃度為10％(質(zhì)量體積比)甲基α-D-吡喃甘露糖苷、500mMNaCl和1mMPMSF；溶劑為pH7.4、20mMTris-HCl緩沖液。清洗液：用蒸餾水將溶液B稀釋至10倍體積。ConA瓊脂糖凝膠柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-0440-01，該柱的規(guī)格為1.6×2.5cm，填充介質(zhì)為ConA-Sepharose4B。HitrapQ陰離子交換柱為GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-1153-01，該柱的規(guī)格為0.7×2.5cm。HRP標(biāo)記的IgG抗體為SEROTEC公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為STAR117P。1×洗滌液為含0.1％(體積百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/LPBS緩沖液。50kD與3kD超濾管為MerckMillipore公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為UFC905096、UFC500324。實(shí)施例1胎盤中g(shù)p96的提取組織中熱休克蛋白gp96(以下簡(jiǎn)稱pgp96)的提取步驟如下：(1)分離分娩前的小鼠的胎盤組織，得到小鼠離體胎盤組織。取小鼠離體胎盤組織或人離體胎盤組織，剪碎，按質(zhì)量體積比1g：4mL加入溶液A，然后用玻璃勻漿器磨碎。(2)完成步驟(1)后，16500g離心1h，得到上清液甲。(3)完成步驟(2)后，取上清液甲，16500g離心50min，得到上清液乙。(4)完成步驟(3)后，取上清液乙，按體積比9：1加入溶液B，混勻后得到上樣液。(5)完成步驟(4)后，將上樣液上樣至ConA瓊脂糖凝膠柱。(6)完成步驟(5)后，用清洗液洗脫所述ConA瓊脂糖凝膠柱，洗脫過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)紫外吸收值，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，直至洗脫產(chǎn)物的紫外吸收值低于0.01。(7)完成步驟(6)后，用溶液C洗脫所述ConA瓊脂糖凝膠柱，棄去首先流出的過柱后溶液0.5個(gè)柱體積，然后收集之后流出的過柱后溶液1個(gè)柱體積；將所述ConA瓊脂糖凝膠柱孵育50min后，再收集過柱后溶液1.5個(gè)柱體積。將兩次收集的過柱后溶液合并，即為ConA洗脫液。(8)完成步驟(7)后，將ConA洗脫液上樣至HitrapQ陰離子交換柱。(9)完成步驟(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1mL/min。梯度洗脫程序：在pH7.412mM的PBS緩沖液中使NaCl含量由300mM勻速增至800mM，線性梯度洗脫20個(gè)柱體積。收集合并NaCl含量為400～450mM的洗脫液，即為洗脫液甲。(10)完成步驟(9)后，取洗脫液甲，用超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96濃度為5mg/mL。將pgp96的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的IgG抗體作為二抗)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1(箭頭所指為pgp96)。結(jié)果表明，pgp96的溶液顯示單一分子量條帶，對(duì)應(yīng)的分子量為96kDa。實(shí)施例2利用漢遜酵母表達(dá)的重組gp96蛋白制備一、重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的構(gòu)建1、提取人肝癌細(xì)胞HepG2的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。2、以步驟1的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR引物如下：Fp(5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3')Rp(5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3')3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pHFMDZ-R1A(購自Invitrogen公司，產(chǎn)品號(hào)為V20520)，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架載體為pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了gp96蛋白的編碼序列。二、gp96蛋白的表達(dá)1、采用電轉(zhuǎn)化法將步驟1得到的重組質(zhì)粒pHFMDZ-R1-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購自ATCC，產(chǎn)品號(hào)為MYA-335)細(xì)胞，得到重組菌。2、將重組菌接種于5mLSD液體培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為GMS12117.7)，37℃培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到100mLSYN6培養(yǎng)基(購自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào)為GMS12116.1)，30℃培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。3、將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2LSYN6培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30℃培養(yǎng)。使用氨水控制pH維持在5.5，每4h檢測(cè)1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補(bǔ)加甘油，控制甘油終濃度在0.5％左右，同時(shí)控制溶氧在20％以上。根據(jù)菌體的生成情況檢測(cè)菌體濕重，等菌體濕重達(dá)到180-200g/L的時(shí)候停止補(bǔ)加甘油，開始誘導(dǎo)重組gp96蛋白產(chǎn)生(補(bǔ)加甲醇，使甲醇濃度維持在0.5-0.8％左右)，誘導(dǎo)開始72小時(shí)后停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液。三、gp96蛋白的分離純化將步驟2得到的發(fā)酵液離心，收集菌體。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在球磨機(jī)(DYNO-MILLmodelKDL)中，按照廠家提供的操作手冊(cè)使用玻璃珠球磨的方法破碎細(xì)胞，破碎后的細(xì)胞12000rpm/min離心20min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜進(jìn)行過濾，得到濾液。將濾液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。將濾液進(jìn)行親和層析，具體步驟如下：采用英俊公司(InvitrogenCorporation)的Ni-NTAPurificationSystem進(jìn)行親和層析，主要步驟為：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h。將濃縮液用PBS(含20mM咪唑)稀釋后上樣，用PBS(含20mM咪唑)沖洗柱子至OD值<0.01，用PBS(含200mM咪唑)洗脫1.5h，收集洗脫液。所有操作均在4℃下進(jìn)行，流速為0.5mL/min。每升步驟2得到的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液再進(jìn)行離子交換層析，主要步驟為：200mMNaCl的PBS液平衡柱子，上樣，300mMNaCl的PBS液洗雜質(zhì)，800mMNaCl的PBS液洗脫目的蛋白。將步驟2的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液和離子交換層析后的洗脫液進(jìn)行10％SDS-PAGE，然后考馬斯亮藍(lán)染色。將gp96蛋白進(jìn)行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購自santacruz，產(chǎn)品號(hào)為sc-56399)，結(jié)果見圖2。圖2顯示，離子交換層析后的洗脫液中的gp96蛋白純度很高。實(shí)施例3昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組熱休克蛋白gp96的制備一、重組質(zhì)粒pFastBacTM1-gp96的構(gòu)建1、采用Trizol法提取HepG2細(xì)胞的RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。2、根據(jù)人gp96基因(GenBank號(hào)為AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ識(shí)別序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下劃線為限制性內(nèi)切酶XbaⅠ識(shí)別序列)。3、完成步驟1和2后，以步驟1獲得的cDNA為模板，以步驟2合成的F1和R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒pFastBacTM1，回收約4700bp的載體骨架。6、將酶切產(chǎn)物與載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。7、將步驟6獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌，然后提取該重組大腸桿菌的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pFastBac1被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為序列表中SEQIDNO.3所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96表達(dá)重組熱休克蛋白gp96(以下簡(jiǎn)稱rgp96)，rgp96的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。二、rgp96的表達(dá)1、將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞(每1×106個(gè)Sf9細(xì)胞約轉(zhuǎn)染4μg重組質(zhì)粒pFastBac1-gp96；共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為CellfectinIIreagent，培養(yǎng)基為Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine，27℃孵育72h，離心，上清液即為P1代病毒。2、將Sf9細(xì)胞懸浮液1(含1×108個(gè)Sf9細(xì)胞)27℃培養(yǎng)8～10h，得到培養(yǎng)細(xì)胞；然后向所述培養(yǎng)細(xì)胞中加入P1代病毒(劑量為0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm離心5min，上清液即為P2代病毒。3、向Sf9細(xì)胞懸浮液2(含1.6×108個(gè)Sf9細(xì)胞)中加入P2代病毒(劑量為0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，上清液即為P3代病毒。以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗，對(duì)P3代病毒進(jìn)行western雜交，western雜交具體步驟參考如下文獻(xiàn)：張悅鳴，段躍強(qiáng)，羅德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受體在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達(dá)及其鑒定[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2013，26：5。western雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rgp96在Sf9細(xì)胞中表達(dá)。三、rgp96的純化1、向300ml的Sf9細(xì)胞懸浮液3(含4.5×108個(gè)Sf9細(xì)胞)中加入P3代病毒(劑量為5MOI)，27℃、100～120rpm培養(yǎng)72h，得到懸浮液。2、取所述懸浮液，7000rpm離心20min，獲得上清液1。3、取所述上清液1，經(jīng)0.22mm濾膜過濾，獲得上樣液。4、將所述上樣液上樣于HiTrap-QSepharose離子交換層析柱(流速為1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS緩沖液沖洗(流速為1mL/min)，收集過柱后溶液并采用截留分子量為50KD的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到1mL左右的濃縮液。所述濃縮液即含有rgp96。5、將步驟4得到的濃縮液上樣于Superdex20010/300GL分子篩層析柱(流速為0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS緩沖液洗滌(流速為0.25mL/min)，收集為9～12mL處的穿透液，進(jìn)一步采用截留分子量為50KD的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到rgp96的溶液。采用BCA法測(cè)定rgp96的溶液中的蛋白濃度，最后分裝，貯存于-80℃。將步驟5得到的rgp96的溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2中左圖(泳道1為高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，泳道2為rgp96，箭頭為rgp96)。將步驟5得到的重組熱休克蛋白gp96的溶液進(jìn)行Westernblot(以gp96單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠的單克隆抗體作為二抗)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，rgp96的溶液顯示單一分子量條帶，對(duì)應(yīng)的分子量與預(yù)期一致。實(shí)施例4APO-E多肽與胎盤gp96結(jié)合的復(fù)合物制備與鑒定一、小鼠胎盤gp96結(jié)合的多肽鑒定1、多肽洗脫：取5mg實(shí)施例1提取的濃度為10mg/mL小鼠胎盤pgp96，加入5μL含有20％(體積比)三氟乙酸的水溶液，4℃中孵育1h。2、將步驟1中的孵育液加入3kD超濾管中，12,000rpm離心30min，取穿透液。3、將步驟2中的穿透液注入Agilent1200高壓液相色譜儀進(jìn)行脫鹽純化(色譜柱型號(hào)SB-C182.1mm×250mm)，程序如下：A相：5％(體積比)乙腈水溶液，含0.1％三氟乙酸；B相：乙腈，含0.1％三氟乙酸；0-30min100％A，30-70min100％B。4、收集步驟3中30-70分鐘的洗脫液，凍干。5、將步驟4的凍干粉末用0.1％(體積比)的甲酸水溶液重溶，注入OrbitrapFusion高分辨率質(zhì)譜儀，分析多肽序列，并從數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行匹配。匹配結(jié)果見表1。表1與小鼠胎盤gp96結(jié)合的蛋白多肽匹配結(jié)果二、APOE多肽-gp96復(fù)合物制備1、將表1得到的APO-E蛋白結(jié)果氨基酸序列輸入該網(wǎng)址http://tools.immuneepitope.org/mhci/進(jìn)行MHCI類分子的表位預(yù)測(cè)，分別選取最優(yōu)的H-2Kd、H-2Kb及HLA-A2限制性表位并化學(xué)合成，預(yù)測(cè)HLA-A2表位時(shí)所選用的氨基酸序列應(yīng)為人類中的同源蛋白。表位篩選結(jié)果見表2。表2APO-E蛋白多肽的表位篩選結(jié)果MHCI限制型多肽序列多肽位置H-2KdVYKAGAREGAERGV171-184H-2KbTMLGQSTEEIRARL134-147HLA-A2FLAGCQAKV12-202、分別化學(xué)合成以上多肽(上海吉爾生化有限公司)，將合成的多肽用細(xì)胞級(jí)DMSO(Sigma-Aldrich公司，目錄號(hào)D2650)復(fù)溶為20mg/mL濃度，分別取1mg多肽與1mg實(shí)施例3中制備的重組rgp96，用pH7.40.01mol/LPBS緩沖液稀釋至4mL體積。55℃熱擊10分鐘，在室溫冷卻30分鐘。然后采用50kD超濾管洗去未結(jié)合的多肽，分別制備獲得不同限制性表位的APOE多肽-gp96復(fù)合物。實(shí)施例5APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)乳腺癌的預(yù)防與治療作用一、APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)原發(fā)性乳腺癌的預(yù)防作用取8周齡C57BL/6小鼠20只分成兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)施例4制備的APOE多肽H-2Kb-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施例3制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：實(shí)驗(yàn)第1天進(jìn)行第一次免疫；第8天進(jìn)行第二次免疫；第22天進(jìn)行第三次免疫。免疫完成后1周開始每只小鼠按50mg/kg劑量口服灌胃食用橄欖油配制的DMBA(Sigma-Aldrich公司，目錄號(hào)D3254)溶液，每周1次，連續(xù)5周，誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)病。自有小鼠產(chǎn)生乳腺癌腫瘤開始(約造模后14周左右)每周檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)腫瘤發(fā)生率與計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積計(jì)算公式V＝ab2/2(V—體積,a—腫瘤長(zhǎng)徑,b—腫瘤短徑)。一直觀察到34周，計(jì)算腫瘤發(fā)生率、腫瘤個(gè)數(shù)與平均腫瘤大小。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)DMBA誘導(dǎo)的乳腺癌有明顯的預(yù)防作用。免疫APOE多肽-gp96復(fù)合物后乳腺癌的發(fā)病率明顯降低，發(fā)病時(shí)間推遲，腫瘤個(gè)數(shù)及腫瘤體積均減小。表3DMBA誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌腫瘤統(tǒng)計(jì)結(jié)果二、APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)誘導(dǎo)乳腺癌模型的治療作用取20只6-8周的雌性Balb/c小鼠，每只皮下分別接種6×105TUBO細(xì)胞，第2天將小鼠分成兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)施例4制備的APOE多肽(H-2Kd)-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施例3制備的gp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：接種腫瘤細(xì)胞后第2天進(jìn)行第一次免疫；第5天進(jìn)行第二次免疫；第8天進(jìn)行第三次免疫。從第一天免疫開始，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄腫瘤大小，按以下公式計(jì)算腫瘤體積：V＝ab2/2(V—體積,a—腫瘤長(zhǎng)徑,b—腫瘤短徑)。腫瘤體積變化見圖4。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)皮下接種的誘導(dǎo)型乳腺癌模型有明顯的治療作用。APOE多肽-gp96復(fù)合物治療后皮下腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢，腫瘤體積變小。實(shí)施例6APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)肝癌的預(yù)防與治療作用一、多肽-gp96復(fù)合物對(duì)原發(fā)性肝癌的預(yù)防作用取20只6周齡雌性C57BL/6小鼠，平均分為兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)施例4制備的APOE多肽(H-2Kb)-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施例3制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：實(shí)驗(yàn)第1天進(jìn)行第一次免疫；第8天進(jìn)行第二次免疫；第22天進(jìn)行第三次免疫。最后一次免疫結(jié)束后1周，將兩組小鼠每日飲水換為含30μg/mLDEN(Sigma-Aldrich公司，目錄號(hào)73861)的無菌蒸餾水，連續(xù)飼養(yǎng)40周，至第40周時(shí)處死小鼠，取出肝臟進(jìn)行比較分析比較。比較結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝癌有明顯的預(yù)防作用。免疫APOE多肽-gp96復(fù)合物后肝癌的發(fā)病率明顯降低，發(fā)病時(shí)間推遲，腫瘤個(gè)數(shù)及腫瘤體積均減小。表4DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌統(tǒng)計(jì)結(jié)果二、APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)誘導(dǎo)肝癌模型的治療作用將液氮凍存的小鼠肝癌H22細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速解凍，細(xì)胞密度調(diào)至1×107/mL，腹腔接種2只BALB/c小鼠，每只0.2mL。待小鼠腹部脹大后，將小鼠頸椎脫臼處死，消毒腹部，抽取腹水合并，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/mL，皮下接種20只BALB/c小鼠，每只0.2mL。12天后將小鼠分成兩組，每組10只，分別進(jìn)行如下處理：第一組：腹部皮下注射實(shí)施例4制備的APOE多肽(H-2Kd)-gp96復(fù)合物，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；第二組：腹部皮下注射實(shí)施例3制備的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，單次免疫劑量為20ug/只；以上兩組中：接種腫瘤細(xì)胞后第12天進(jìn)行第一次免疫；第15天進(jìn)行第二次免疫；第18天進(jìn)行第三次免疫。從第一天免疫開始，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄腫瘤大小，按以下公式計(jì)算腫瘤體積：V＝ab2/2(V—體積,a—腫瘤長(zhǎng)徑,b—腫瘤短徑)。腫瘤體積變化見圖5。從結(jié)果可以看出，APOE多肽-gp96復(fù)合物對(duì)皮下接種的誘導(dǎo)型肝癌模型有明顯的治療作用。APOE多肽-gp96復(fù)合物治療后皮下腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢，腫瘤體積變小。實(shí)施例7APOE多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)一、人源多肽特異性效應(yīng)細(xì)胞的制備1、使用人淋巴細(xì)胞分離液(Cellgro,25-072-CI)分離HLA-A2陽性志愿者的抗凝新鮮全血，獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用含10％胎牛血清(Gibco，10099-141-FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco，12633012)調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0X106/ml，接種于24孔板，每孔1ml。2、次日每組分別加入APOE多肽(HLA-A2)-gp96復(fù)合物至終濃度為10μg/ml。3、第三天每孔加入IL-2(PeproTech公司，目錄號(hào)212-12)至終濃度為50U/ml，每2-3天半量換液并補(bǔ)充IL-2至終濃度為50U/ml。4、分別于第七天、第十四天進(jìn)行第二輪、第三輪APOE多肽-gp96復(fù)合物刺激，次日加入IL-2至終濃度為50U/ml。5、第三輪刺激后3天，得到人源多肽效應(yīng)細(xì)胞CTL。二、靶細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(HLA-A2表達(dá)陽性)，多肽孵育的T2細(xì)胞(HLA-A2表達(dá)陽性)、T2細(xì)胞。三、乳腺癌細(xì)胞特異性殺傷效應(yīng)的檢測(cè)使用非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)(Promega，目錄號(hào)G1780)進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測(cè)，主要步驟如下(詳見試劑盒使用說明書)：1、以MCF-7細(xì)胞、多肽孵育的T2細(xì)胞、Τ2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，接種靶細(xì)胞數(shù)目為5×103/孔，按照效靶比10:1的比例加入上述效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞以50μ1/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積100μ1；此外另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)LDH釋放組，用來校準(zhǔn)效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放出來的LDH(各組效應(yīng)細(xì)胞以50μ1/孔加入96孔板，補(bǔ)充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基至終體積100μ1)。靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放組，用來校正靶細(xì)胞自發(fā)釋放出來的LDH(各組靶細(xì)胞以50μ1/孔加入96孔板，補(bǔ)充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基至終濃度100μ1)。靶細(xì)胞最大LDH釋放組,用來計(jì)算時(shí)作為確定100％的LDH釋放的參照(細(xì)胞上樣同靶細(xì)胞自發(fā)釋放組)。體積校正對(duì)照組，用來校正由于加入裂解液引起的體積變化(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基100μ1)。培養(yǎng)基背景對(duì)照組，用來校正由培養(yǎng)基中血清產(chǎn)生的LDH活性以及酚紅造成的背景吸收(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基100μ1)。2、細(xì)胞接種后，使用250g離心4min，接著于37℃培養(yǎng)箱中孵育4h；在收獲上清前45min，向靶細(xì)胞最大LDH釋放組中加入裂解液(10×)，10μ1/孔；接著使用250g離心4min，收獲上清；3、轉(zhuǎn)移50μ1上清至酶標(biāo)板中，用檢測(cè)緩沖液配制底物，把配好的底物50μ1/孔加到酶標(biāo)板中，蓋好平板，室溫避光反應(yīng)30min，向每空加入50μ1終止液，1h內(nèi)于酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm吸光值OD。4、計(jì)算細(xì)胞殺傷率殺傷率(％)＝[(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組OD值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組OD值)/(靶細(xì)胞最大釋放組OD值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放組OD值)]×100％細(xì)胞殺傷結(jié)果見圖6。結(jié)果表明APOE多肽-gp96復(fù)合物可以從人的外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)出表位特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，該細(xì)胞可對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7殺傷，表明APOE多肽-gp96復(fù)合物有預(yù)防和治療人乳腺癌的能力。實(shí)施例8APOE多肽-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)于人肝癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)一、人源多肽特異性效應(yīng)細(xì)胞的制備APOE多肽(HLA-A2)-gp96復(fù)合物誘導(dǎo)的特異性CTL制備方法同實(shí)施例7，用含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整至適當(dāng)濃度，作為效應(yīng)細(xì)胞。二、靶細(xì)胞人肝癌細(xì)胞HHCC(HLA-A2表達(dá)陽性)，多肽孵育的T2細(xì)胞(HLA-A2表達(dá)陽性)、T2細(xì)胞三、肝癌細(xì)胞特異性殺傷效應(yīng)的檢測(cè)檢測(cè)方法同實(shí)施例7，將靶細(xì)胞換為人肝癌細(xì)胞HHCC，實(shí)驗(yàn)組按效靶比10:1的比例加入效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、背景對(duì)照組、體積校正對(duì)照組。37℃條件下孵育4h后加入細(xì)胞裂解液，收獲上清做LDH檢測(cè)。細(xì)胞殺傷結(jié)果見圖7。結(jié)果表明APOE多肽-gp96復(fù)合物可以從人的外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)出表位特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，該細(xì)胞可對(duì)人肝癌細(xì)胞HHCC殺傷，表明APOE多肽-gp96復(fù)合物有預(yù)防和治療人肝癌的能力。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。SEQUENCELISTING<110>北京熱休生物技術(shù)有限公司<120>APO-E蛋白及其多肽在治療與預(yù)防癌癥中的應(yīng)用<130>KHP171110223.8<160>11<170>PatentInversion3.5<210>1<211>951<212>DNA<213>APO-E蛋白<400>1atgaaggttctgtgggctgcgttgctggtcacattcctggcaggatgccaggccaaggtg60gagcaagcggtggagacagagccggagcccgagctgcgccagcagaccgagtggcagagc120ggccagcgctgggaactggcactgggtcgcttttgggattacctgcgctgggtgcagaca180ctgtctgagcaggtgcaggaggagctgctcagctcccaggtcacccaggaactgagggcg240ctgatggacgagaccatgaaggagttgaaggcctacaaatcggaactggaggaacaactg300accccggtggcggaggagacgcgggcacggctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcc360cggctgggcgcggacatggaggacgtgtgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtg420caggccatgctcggccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgc480aagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgcctggcagtgtac540caggccggggcccgcgagggcgccgagcgcggcctcagcgccatccgcgagcgcctgggg600cccctggtggaacagggccgcgtgcgggccgccactgtgggctccctggccggccagccg660ctacaggagcgggcccaggcctggggcgagcggctgcgcgcgcggatggaggagatgggc720agccggacccgcgaccgcctggacgaggtgaaggagcaggtggcggaggtgcgcgccaag780ctggaggagcaggcccagcagatacgcctgcaggccgaggccttccaggcccgcctcaag840agctggttcgagcccctggtggaagacatgcagcgccagtgggccgggctggtggagaag900gtgcaggctgccgtgggcaccagcgccgcccctgtgcccagcgacaatcac951<210>2<211>317<212>PRT<213>APO-E蛋白<400>2MetLysValLeuTrpAlaAlaLeuLeuValThrPheLeuAlaGlyCys151015GlnAlaLysValGluGlnAlaValGluThrGluProGluProGluLeu202530ArgGlnGlnThrGluTrpGlnSerGlyGlnArgTrpGluLeuAlaLeu354045GlyArgPheTrpAspTyrLeuArgTrpValGlnThrLeuSerGluGln505560ValGlnGluGluLeuLeuSerSerGlnValThrGlnGluLeuArgAla65707580LeuMetAspGluThrMetLysGluLeuLysAlaTyrLysSerGluLeu859095GluGluGlnLeuThrProValAlaGluGluThrArgAlaArgLeuSer100105110LysGluLeuGlnAlaAlaGlnAlaArgLeuGlyAlaAspMetGluAsp115120125ValCysGlyArgLeuValGlnTyrArgGlyGluValGlnAlaMetLeu130135140GlyGlnSerThrGluGluLeuArgValArgLeuAlaSerHisLeuArg145150155160LysLeuArgLysArgLeuLeuArgAspAlaAspAspLeuGlnLysArg165170175LeuAlaValTyrGlnAlaGlyAlaArgGluGlyAlaGluArgGlyLeu180185190SerAlaIleArgGluArgLeuGlyProLeuValGluGlnGlyArgVal195200205ArgAlaAlaThrValGlySerLeuAlaGlyGlnProLeuGlnGluArg210215220AlaGlnAlaTrpGlyGluArgLeuArgAlaArgMetGluGluMetGly225230235240SerArgThrArgAspArgLeuAspGluValLysGluGlnValAlaGlu245250255ValArgAlaLysLeuGluGluGlnAlaGlnGlnIleArgLeuGlnAla260265270GluAlaPheGlnAlaArgLeuLysSerTrpPheGluProLeuValGlu275280285AspMetGlnArgGlnTrpAlaGlyLeuValGluLysValGlnAlaAla290295300ValGlyThrSerAlaAlaProValProSerAspAsnHis305310315<210>3<211>2409<212>DNA<213>熱休克蛋白gp96<400>3atgagggccctgtgggtgctgggcctctgctgcgtcctgctgaccttcgggtcggtcaga60gctgacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa120ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatgga180ttaaatgcatcacaaataagagaacttagagagaagtcggaaaagtttgccttccaagcc240gaagttaacagaatgatgaaacttatcatcaattcattgtataaaaataaagagattttc300ctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagataagataaggctaatatcactg360actgatgaaaatgctctttctggaaatgaggaactaacagtcaaaattaagtgtgataag420gagaagaacctgctgcatgtcacagacaccggtgtaggaatgaccagagaagagttggtt480aaaaaccttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaa540gcacaggaagatggccagtcaacttctgaattgattggccagtttggtgtcggtttctat600tccgccttccttgtagcagataaggttattgtcacttcaaaacacaacaacgatacccag660cacatctgggagtctgactccaatgaattttctgtaattgctgacccaagaggaaacact720ctaggacggggaacgacaattacccttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaa780ttggatacaattaaaaatctcgtcaaaaaatattcacagttcataaactttcctatttat840gtatggagcagcaagactgaaactgttgaggagcccatggaggaagaagaagcagccaaa900gaagagaaagaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaagaagaagaagaaaagaaa960ccaaagactaaaaaagttgaaaaaactgtctgggactgggaacttatgaatgatatcaaa1020ccaatatggcagagaccatcaaaagaagtagaagaagatgaatacaaagctttctacaaa1080tcattttcaaaggaaagtgatgaccccatggcttatattcactttactgctgaaggggaa1140gttaccttcaaatcaattttatttgtacccacatctgctccacgtggtctgtttgacgaa1200tatggatctaaaaagagcgattacattaagctctatgtgcgccgtgtattcatcacagac1260gacttccatgatatgatgcctaaatacctcaattttgtcaagggtgtggtggactcagat1320gatctccccttgaatgtttcccgcgagactcttcagcaacataaactgcttaaggtgatt1380aggaagaagcttgttcgtaaaacgctggacatgatcaagaagattgctgatgataaatac1440aatgatactttttggaaagaatttggtaccaacatcaagcttggtgtgattgaagaccac1500tcgaatcgaacacgtcttgctaaacttcttaggttccagtcttctcatcatccaactgac1560attactagcctagaccagtatgtggaaagaatgaaggaaaaacaagacaaaatctacttc1620atggctgggtccagcagaaaagaggctgaatcttctccatttgttgagcgacttctgaaa1680aagggctatgaagttatttacctcacagaacctgtggatgaatactgtattcaggccctt1740cccgaatttgatgggaagaggttccagaatgttgccaaggaaggagtgaagttcgatgaa1800agtgagaaaactaaggagagtcgtgaagcagttgagaaagaatttgagcctctgctgaat1860tggatgaaagataaagcccttaaggacaagattgaaaaggctgtggtgtctcagcgcctg1920acagaatctccgtgtgctttggtggccagccagtacggatggtctggcaacatggagaga1980atcatgaaagcacaagcgtaccaaacgggcaaggacatctctacaaattactatgcgagt2040cagaagaaaacatttgaaattaatcccagacacccgctgatcagagacatgcttcgacga2100attaaggaagatgaagatgataaaacagttttggatcttgctgtggttttgtttgaaaca2160gcaacgcttcggtcagggtatcttttaccagacactaaagcatatggagatagaatagaa2220agaatgcttcgcctcagtttgaacattgaccctgatgcaaaggtggaagaagagcccgaa2280gaagaacctgaagagacagcagaagacacaacagaagacacagagcaagacgaagatgaa2340gaaatggatgtgggaacagatgaagaagaagaaacagcaaaggaatctacagctgaaaaa2400gatgaattg2409<210>4<211>803<212>PRT<213>熱休克蛋白gp96<400>4MetArgAlaLeuTrpValLeuGlyLeuCysCysValLeuLeuThrPhe151015GlySerValArgAlaAspAspGluValAspValAspGlyThrValGlu202530GluAspLeuGlyLysSerArgGluGlySerArgThrAspAspGluVal354045ValGlnArgGluGluGluAlaIleGlnLeuAspGlyLeuAsnAlaSer505560GlnIleArgGluLeuArgGluLysSerGluLysPheAlaPheGlnAla65707580GluValAsnArgMetMetLysLeuIleIleAsnSerLeuTyrLysAsn859095LysGluIlePheLeuArgGluLeuIleSerAsnAlaSerAspAlaLeu100105110AspLysIleArgLeuIleSerLeuThrAspGluAsnAlaLeuSerGly115120125AsnGluGluLeuThrValLysIleLysCysAspLysGluLysAsnLeu130135140LeuHisValThrAspThrGlyValGlyMetThrArgGluGluLeuVal145150155160LysAsnLeuGlyThrIleAlaLysSerGlyThrSerGluPheLeuAsn165170175LysMetThrGluAlaGlnGluAspGlyGlnSerThrSerGluLeuIle180185190GlyGlnPheGlyValGlyPheTyrSerAlaPheLeuValAlaAspLys195200205ValIleValThrSerLysHisAsnAsnAspThrGlnHisIleTrpGlu210215220SerAspSerAsnGluPheSerValIleAlaAspProArgGlyAsnThr225230235240LeuGlyArgGlyThrThrIleThrLeuValLeuLysGluGluAlaSer245250255AspTyrLeuGluLeuAspThrIleLysAsnLeuValLysLysTyrSer260265270GlnPheIleAsnPheProIleTyrValTrpSerSerLysThrGluThr275280285ValGluGluProMetGluGluGluGluAlaAlaLysGluGluLysGlu290295300GluSerAspAspGluAlaAlaValGluGluGluGluGluGluLysLys305310315320ProLysThrLysLysValGluLysThrValTrpAspTrpGluLeuMet325330335AsnAspIleLysProIleTrpGlnArgProSerLysGluValGluGlu340345350AspGluTyrLysAlaPheTyrLysSerPheSerLysGluSerAspAsp355360365ProMetAlaTyrIleHisPheThrAlaGluGlyGluValThrPheLys370375380SerIleLeuPheValProThrSerAlaProArgGlyLeuPheAspGlu385390395400TyrGlySerLysLysSerAspTyrIleLysLeuTyrValArgArgVal405410415PheIleThrAspAspPheHisAspMetMetProLysTyrLeuAsnPhe420425430ValLysGlyValValAspSerAspAspLeuProLeuAsnValSerArg435440445GluThrLeuGlnGlnHisLysLeuLeuLysValIleArgLysLysLeu450455460ValArgLysThrLeuAspMetIleLysLysIleAlaAspAspLysTyr465470475480AsnAspThrPheTrpLysGluPheGlyThrAsnIleLysLeuGlyVal485490495IleGluAspHisSerAsnArgThrArgLeuAlaLysLeuLeuArgPhe500505510GlnSerSerHisHisProThrAspIleThrSerLeuAspGlnTyrVal515520525GluArgMetLysGluLysGlnAspLysIleTyrPheMetAlaGlySer530535540SerArgLysGluAlaGluSerSerProPheValGluArgLeuLeuLys545550555560LysGlyTyrGluValIleTyrLeuThrGluProValAspGluTyrCys565570575IleGlnAlaLeuProGluPheAspGlyLysArgPheGlnAsnValAla580585590LysGluGlyValLysPheAspGluSerGluLysThrLysGluSerArg595600605GluAlaValGluLysGluPheGluProLeuLeuAsnTrpMetLysAsp610615620LysAlaLeuLysAspLysIleGluLysAlaValValSerGlnArgLeu625630635640ThrGluSerProCysAlaLeuValAlaSerGlnTyrGlyTrpSerGly645650655AsnMetGluArgIleMetLysAlaGlnAlaTyrGlnThrGlyLysAsp660665670IleSerThrAsnTyrTyrAlaSerGlnLysLysThrPheGluIleAsn675680685ProArgHisProLeuIleArgAspMetLeuArgArgIleLysGluAsp690695700GluAspAspLysThrValLeuAspLeuAlaValValLeuPheGluThr705710715720AlaThrLeuArgSerGlyTyrLeuLeuProAspThrLysAlaTyrGly725730735AspArgIleGluArgMetLeuArgLeuSerLeuAsnIleAspProAsp740745750AlaLysValGluGluGluProGluGluGluProGluGluThrAlaGlu755760765AspThrThrGluAspThrGluGlnAspGluAspGluGluMetAspVal770775780GlyThrAspGluGluGluGluThrAlaLysGluSerThrAlaGluLys785790795800AspGluLeu<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>5ccggaattcatggacgatgaagttgatg28<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>6ccgctcgagctattagaattcatctttttcagctgtag38<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7ggaattcatggacgatgaagttgat25<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8gctctagactattagaattcatctttttc29<210>9<211>14<212>PRT<213>H-2Kd<400>9ValTyrLysAlaGlyAlaArgGluGlyAlaGluArgGlyVal1510<210>10<211>14<212>PRT<213>H-2Kb<400>10ThrMetLeuGlyGlnSerThrGluGluIleArgAlaArgLeu1510<210>11<211>9<212>PRT<213>HLA-A2<400>11PheLeuAlaGlyCysGlnAlaLysVal15當(dāng)前第1頁1 2 3