本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及肌醇作為水產(chǎn)養(yǎng)殖抗菌藥物氟苯尼考增效劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

嗜水氣單胞菌在河流、湖泊、池塘、食物、動(dòng)物及人體等自然環(huán)境中廣泛存在。嗜水氣單胞菌屬于條件性致病菌，可引起多種水生動(dòng)物和陸生動(dòng)物患病，是一種典型的人-畜-魚共患病病原菌，當(dāng)環(huán)境條件惡劣，機(jī)體抵抗力下降可導(dǎo)致魚類、兩棲類、爬行類等冷血?jiǎng)游锖筒溉閯?dòng)物發(fā)病，引發(fā)水生動(dòng)物細(xì)菌性出血病、體表潰瘍癥以及哺乳動(dòng)物腹瀉等，是魚類、爬行類和人類的一種致命傳染源。鏈球菌為典型的條件致病菌，平常生存于養(yǎng)殖水體及底泥中。在富營養(yǎng)化或養(yǎng)殖自身污染較為嚴(yán)重的水域中，此菌能長期生存，當(dāng)養(yǎng)殖魚體抵抗力降低時(shí)，易引起疾病。該病的發(fā)生與養(yǎng)殖密度大、換水率低、餌料鮮度差及投餌量大密切相關(guān)。鏈球菌不僅能影響海水養(yǎng)殖魚類，同時(shí)影響半咸水及淡水養(yǎng)殖鰻鱺、香魚、虹鱒斑點(diǎn)叉尾鮰和羅非魚等，其具有感染宿主廣、傳染性強(qiáng)和死亡率高等特點(diǎn)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。為了預(yù)防和治療病原菌引起的疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中多采用抗生素的治療方法，而長期大量使用或?yàn)E用抗生素導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌多重耐藥、交叉耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，這些耐藥菌的出現(xiàn)給水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治帶來極大的困難，也帶來了更大的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此，針對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中各種病原微生物的爆發(fā)，采用新的策略和方法控制水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的感染十分重要。面對這一形勢，開發(fā)一種新的藥物防治策略，以提高防治效果、降低嗜水氣單胞菌耐藥性和避免抗菌藥物的殘留問題，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展具有極大的應(yīng)用前景。

氟苯尼考（florfenicol）為甲砜霉素的單氟衍生物，又稱氟甲砜霉素，是一種新型廣譜高效抗菌藥物，自20世紀(jì)90年代初開始應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。該藥抗菌譜類似于氯霉素，通過抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶活性而產(chǎn)生廣譜抑菌作用，抗菌譜廣，包括各種革蘭氏陽性、陰性菌和支原體等。氟苯尼考以其廣譜、高效、吸收迅速、分布廣泛、安全和動(dòng)物專用等特點(diǎn)，在國內(nèi)外畜牧和水產(chǎn)上迅速獲得廣泛應(yīng)用。

歐盟和美國應(yīng)用CUAPM-Ⅱ及LC-MS確檢，對氯霉素類藥物（包括氟苯尼考及氟苯尼考胺）的多殘留檢測限可低至0.1ng/g。因此，在具有相同殺菌效果的情況下，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中提高氟苯尼考的抗菌活性，大幅減少藥物使用量，降低藥物殘留，對水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品安全和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有十分重要的意義。

肌醇在化學(xué)上可看作是環(huán)己烷的多元烴基衍生物，廣泛分布在動(dòng)物和植物體內(nèi)，是動(dòng)物、微生物的生長因子。肌醇是一種“生物活素”，參與體內(nèi)的新陳代謝活動(dòng)，具有免疫、預(yù)防和治療某些疾病等多種作用。在發(fā)酵和食品工業(yè)中，可用于多種菌種的培養(yǎng)和促進(jìn)酵母的增長等，許多保健飲料和兒童食品都加有微量肌醇。肌醇還是腸內(nèi)某些微生物的生長因子，在其它維生素缺乏時(shí)，它能刺激所缺乏維生素的微生物合成維生素。實(shí)踐證明，水生動(dòng)物飼料中加入肌醇，可促進(jìn)生長和防止死亡，在對蝦及魚類飼料中，肌醇添加量通常為300-500mg/kg，否則將出現(xiàn)肌醇缺乏癥。肌醇在醫(yī)藥、化工、食品和飼料等領(lǐng)域具有較大的市場開發(fā)潛力。但肌醇作為抗菌藥物增效劑的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了肌醇作為氟苯尼考增效劑的應(yīng)用，肌醇與氟苯尼考聯(lián)合使用能夠大幅度增強(qiáng)氟苯尼考的殺菌效果，提高魚體感染細(xì)菌后的存活率，為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中氟苯尼考的使用提供了一種新方法，肌醇與氟苯尼考的聯(lián)合使用能夠大幅度降低抗生素的使用量，同時(shí)提高魚體對細(xì)菌感染的防治水平。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案：

肌醇作為氟苯尼考增效劑的應(yīng)用，其特征在于：通過肌醇與氟苯尼考的聯(lián)合使用以增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖抗菌藥物氟苯尼考的藥效，進(jìn)而減少氟苯尼考的用藥量。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的肌醇與氟苯尼考的重量比為0.56-180:1。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的肌醇作為增效劑用于增加氟苯尼考在體外殺滅細(xì)菌的能力。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的肌醇作為增效劑用于增加氟苯尼考在體內(nèi)清除細(xì)菌的能力。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的肌醇作為增效劑用于與氟苯尼考聯(lián)合使用以提高魚體感染細(xì)菌的存活率。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的細(xì)菌為嗜水氣單胞菌或無乳鏈球菌。

本發(fā)明經(jīng)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肌醇能夠增強(qiáng)氟苯尼考的殺菌效果；其聯(lián)合運(yùn)用能提高魚體嗜水氣單胞菌感染的治療效果，大幅增加魚體存活率。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病原菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，大幅度降低抗菌藥物氟苯尼考的使用量，同時(shí)提高抗菌藥物氟苯尼考的防治效果，有助于無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的推廣。

附圖說明

圖1是肌醇添加前后不同濃度氟苯尼考作用后的細(xì)菌存活率圖；

圖2是不同劑量肌醇聯(lián)合氟苯尼考作用后的細(xì)菌存活率圖；

圖3是肌醇協(xié)同氟苯尼考?xì)⒕饔玫臅r(shí)間依賴關(guān)系圖；

圖4是肌醇聯(lián)合氟苯尼考作用后淇河鯽肝臟、脾和腎臟中嗜水氣單胞菌的含量圖；

圖5是肌醇聯(lián)合氟苯尼考作用后淇河鯽肝臟、脾和腎臟中無乳鏈球菌的含量圖；

圖6是細(xì)菌攻毒后注射肌醇或/和氟苯尼考對魚體的保護(hù)作用對比圖；

圖7是細(xì)菌攻毒后口服肌醇或/和氟苯尼考對魚體的保護(hù)作用對比圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

肌醇增加氟苯尼考在體外殺滅細(xì)菌的能力

1、細(xì)菌培養(yǎng)與生存率體外實(shí)驗(yàn)方法

（1）挑取嗜水氣單胞菌或無乳鏈球菌單菌落接種于100mL LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；

（2）取適量的菌液于12000rpm、5min離心收集菌體，用質(zhì)量濃度為0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次，懸浮于含10mM 乙酸鈉的M9培養(yǎng)基中，調(diào)OD600值至0.6；

（3）加入相應(yīng)的代謝物和適量的抗生素于試管中，加M9培養(yǎng)基至5mL體系，28℃培養(yǎng)6h；

（4）在特定的時(shí)間點(diǎn)，取100uL樣品，采用系列稀釋法，取10uL進(jìn)行點(diǎn)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌cfu/mL（菌落形成單位/毫升）。不經(jīng)過抗生素和代謝物處理的樣品作為起始細(xì)菌數(shù)，細(xì)菌菌落數(shù)在20-200的數(shù)據(jù)可用于統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)菌存活率（percent survival）是抗生素和代謝物處理后的細(xì)菌cfu與起始細(xì)菌cfu的百分比。

2、肌醇在提高氟苯尼考?xì)⒕Ч矫婢哂锌股貪舛纫蕾囆?yīng)

氟苯尼考對嗜水氣單胞菌的MIC值為5μg/mL，設(shè)置抗生素濃度梯度依次為20、40、80、120、160和200μg/mL，生存率試驗(yàn)結(jié)果見圖1。從圖中可以看出氟苯尼考濃度從20μg/mL開始有較明顯殺菌效果，隨著濃度增加殺菌效果越來越明顯，細(xì)菌存活率呈梯度下降。

在上述濃度條件下，添加20mM肌醇協(xié)同抗生素的殺菌有了明顯的增強(qiáng)，細(xì)菌存活率分別為22.1%、7.6%、1.9%、0.57%、0.13%、0.039%，與不添加肌醇的對照組相比，協(xié)同殺菌的倍數(shù)分別為3.6、5.1、12.2、26.5、55.9、146.7倍，說明肌醇能夠作為氟苯尼考的增效劑。

3、肌醇在提高氟苯尼考?xì)⒕Ч矫婢哂形镔|(zhì)劑量依賴效應(yīng)

選擇細(xì)菌存活率在50%左右的抗生素濃度，進(jìn)一步探討肌醇物質(zhì)梯度的作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.625mM的肌醇也明顯提高氟苯尼考的殺菌作用。對嗜水氣單胞菌來說，在40μg/mL氟苯尼考條件下，0.625-20mM的肌醇提高殺菌倍數(shù)為1.2、1.6、3、4.2、8.6和11.8倍。在80μg/mL氟苯尼考條件下，0.625-20mM的肌醇提高殺菌倍數(shù)為1.6、1.9、3.8、5.3、9和14.9倍（圖2）。

4、肌醇在提高氟苯尼考?xì)⒕Ч矫婢哂凶饔脮r(shí)間依賴效應(yīng)

進(jìn)一步研究了肌醇協(xié)氟苯尼考?xì)⒕饔门c時(shí)間的關(guān)系。對于嗜水氣單胞菌，用時(shí)間梯度試驗(yàn)進(jìn)行研究，設(shè)置時(shí)間梯度為2-10h，采用20mM肌醇分別與40μg/mL和80μg/mL氟苯尼考協(xié)同殺菌，每隔2h取樣并點(diǎn)板計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖3。從結(jié)果中可以看出，隨著時(shí)間的延長，同時(shí)添加氟苯尼考和肌醇的試驗(yàn)組生存率下降越來越顯著，在6h分別提高氟苯尼考?xì)⒕饔脼?倍和11倍，在10h可以達(dá)到12倍和27倍，說明隨著肌醇作用時(shí)間的延長，其協(xié)同作用越來越明顯。

實(shí)施例2

肌醇增加氟苯尼考在體內(nèi)清除細(xì)菌的能力

1、魚體感染與細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn)：嗜水氣單胞菌Ah-479為高毒力菌株，淇河鯽腹腔注射100μL 1.0×10⁷cfu/mL的細(xì)菌懸液，24h后，淇河鯽隨機(jī)分為4組，每組10尾，分別為：生理鹽水對照組、代謝物組、抗生素組和相應(yīng)濃度的抗生素與代謝物組。肌醇的劑量為50mg/kg，氟苯尼考的使用劑量為25mg/kg。治療24h后，取魚體肝臟、腎臟、脾等組織并稱重，加入1mL生理鹽水充分研磨勻漿，進(jìn)行梯度稀釋并平板計(jì)數(shù)檢測組織中的細(xì)菌含量（cfu/g）。

2、肌醇聯(lián)合氟苯尼考能顯著清除魚體組織中的嗜水氣單胞菌

細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明，單獨(dú)肌醇治療能促進(jìn)魚體對病原菌的清除，特別是肝臟組織中，與對照組相比，細(xì)菌數(shù)下降約10倍。肌醇協(xié)同氟苯尼考組具有最為明顯的作用，在三個(gè)組織中，細(xì)菌數(shù)下降分別為23、7.5、20倍（圖4）。

3、肌醇聯(lián)合氟苯尼考能顯著清除魚體組織中的無乳鏈球菌

細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明，單獨(dú)肌醇治療能促進(jìn)魚體對病原菌的清除，特別是肝臟組織中，與對照組相比，細(xì)菌數(shù)下降約10倍。肌醇協(xié)同氟苯尼考組具有最為明顯的作用，在三個(gè)組織中，細(xì)菌數(shù)下降分別為23、7.5、20倍（圖5）。

實(shí)施例3

肌醇聯(lián)合氟苯尼考提高魚體感染細(xì)菌的存活率

肌醇聯(lián)合氟苯尼考提高魚體治療效果

Ah-479為高毒力菌株，選取120尾健康淇河鯽進(jìn)行攻毒，細(xì)菌攻毒1h后，用注射或口服兩種給藥方式進(jìn)行治療。每種給藥方式分為4個(gè)組：對照組為生理鹽水、肌醇組使用量為50mg/kg、氟苯尼考組使用量為25mg/kg和50mg/kg肌醇+25mg/kg氟苯尼考組同時(shí)使用，所有注射注射或口服用藥均為100μL/尾。藥物保護(hù)率=[1-(給藥組死亡率/對照組死亡率)]×100%。

注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)注射劑量為100μL 5.0×10⁷cfu/mL細(xì)菌時(shí)，魚體死亡率可達(dá)80%；單獨(dú)的抗生素治療效果并不明顯，魚體的累積死亡率仍達(dá)70%；單獨(dú)注射肌醇的保護(hù)作用明顯，魚體的累積死亡率不到30%；肌醇+氟苯尼考聯(lián)合使用時(shí)，魚體的累積死亡率為6.7%（圖6）。

口服實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組72h的累積死亡率86.7%；單獨(dú)口服抗生素效果并不明顯，72h的累積死亡率63.3%；口服肌醇72h的累積死亡率43.3%；口服肌醇+氟苯尼考72h的累積死亡率16.7%，即口服聯(lián)合用藥對魚體的保護(hù)率達(dá)80.7%（圖7）。

以上結(jié)果表明，不論注射和口服肌醇+氟苯尼考，都能極明顯的保護(hù)淇河鯽抵抗嗜水氣單胞菌的感染，即肌醇能作為氟苯尼考增效劑進(jìn)行魚體疾病預(yù)防與治療。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。