本發(fā)明涉及中藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種具二肽基肽酶4(DPP-4)活性抑制作用的化合物地骨皮乙素，以及該化合物在制備治療Ⅱ型糖尿病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病、肥胖癥和高脂血癥在世界范圍人口中的發(fā)病頻率很高并且持續(xù)增加。在一般人群中，糖尿病是慢性疾病之一，其隨著肥胖和年齡的增多而發(fā)生，伴隨著病程的延長(zhǎng)，各種代謝紊亂能導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害和功能障礙，由此引發(fā)的心腦血管病變、腎功能衰竭、失明、下肢壞疽等成為糖尿病致殘致死的主要原因。另外，餐后高血糖癥和高胰島素血癥是發(fā)生糖尿病大血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

雖然有用于治療糖尿病綜合癥所開(kāi)發(fā)的藥物，但是今天在對(duì)糖尿病病人的治療中最具有挑戰(zhàn)的目標(biāo)仍然是使血糖水平盡可能地接近正常。糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病，其主要的干預(yù)方法是控制飲食、減少攝入性碳水化合物的含量、藥物治療等。

目前，西格列汀、阿格列汀等DPP-4抑制劑可以抑制DPP-4活性，成為一類(lèi)臨床常用的糖尿病治療藥物。該類(lèi)藥物的作用機(jī)理：人體攝入的碳水化合物經(jīng)過(guò)小腸上皮細(xì)胞的酶(如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收進(jìn)入血液循環(huán)。而DPP-4(二肽基肽酶4)作為一種絲氨酸蛋白酶，在腸道中高表達(dá)，它能夠分解腸道細(xì)胞分泌的腸促胰島素(GLP-1)。通過(guò)抑制DPP-4活性，而阻斷其分解GLP-1，使GLP-1能夠持續(xù)發(fā)揮刺激胰島素分泌、抑制升糖素、抑制胃排空和讓胰島細(xì)胞重生等作用，從而降低血糖。

現(xiàn)有的DPP-4抑制劑大多為化學(xué)合成小分子，源于中藥的DPP-4抑制劑還少見(jiàn)報(bào)道。如何從中藥材中開(kāi)發(fā)出具有DPP-4抑制作用的中藥化合物及其制劑，是今后研究的方向。

地骨皮(Lycium chinense Mill.)為茄科(Solanaceae)枸杞屬植物枸杞的干燥根皮?！爆F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有降血壓、調(diào)血脂、解熱等作用。現(xiàn)有研究報(bào)道認(rèn)為地骨皮中的有機(jī)酸、生物堿等成分具有降血糖作用，但是其具體作用成分及機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了地骨皮乙素作為DPP-4抑制劑的用途，通過(guò)抑制二肽基肽酶4(DPP-4)活性，進(jìn)而發(fā)揮降血糖的作用，因此可將其應(yīng)用于制備治療糖尿病的藥物中。

地骨皮乙素在制備DPP-4抑制劑中的應(yīng)用。

地骨皮乙素是地骨皮中分離得到的一種精胺化合物。研究發(fā)現(xiàn)，該化合物能夠有效抑制DPP-4的活性，地骨皮乙素在50μmol/L濃度條件下對(duì)DPP-4活性的抑制率達(dá)到87.71％。

地骨皮乙素在制備前脂肪細(xì)胞分化抑制劑中的應(yīng)用。

研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮乙素在細(xì)胞水平上能夠抑制前脂肪細(xì)胞分化。

地骨皮乙素在制備調(diào)節(jié)糖代謝藥物中的應(yīng)用。

研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮乙素作用于胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞后，葡萄糖消耗量增加，與模型組相比具有顯著性差異，表明地骨皮乙素能夠改善胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖吸收和攝??；結(jié)合其調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞糖脂代謝能力，達(dá)到控制血糖，預(yù)防和治療糖尿病的目的。

地骨皮乙素在制備治療Ⅱ型糖尿病藥物中的應(yīng)用。

一種藥物組合物，包括作為有效成分的地骨皮乙素。

地骨皮乙素的有效作用濃度為10～50μmol/L，作為優(yōu)選，所述藥物組合物中地骨皮乙素的質(zhì)量百分比為5％～20％。

作為優(yōu)選，所述藥物組合物中還包括藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體。藥物輔料可以賦予藥物一定劑型，有效保證藥物有效成分的釋放和吸收。

作為優(yōu)選，藥物組合物的制劑形式為液體制劑或固體制劑。各劑型均可以藥學(xué)常規(guī)方法制備而成。

更為優(yōu)選，所述藥物組合物為口服給藥的劑型。口服給藥方式簡(jiǎn)便，不直接損傷皮膚或黏膜，減少感染風(fēng)險(xiǎn)。由于糖尿病患者需要長(zhǎng)期用藥，故口服給藥是一種經(jīng)濟(jì)安全的方式。

本發(fā)明的藥物組合物可以制成滴丸，具體制備方法為：0.5g地骨皮乙素與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴罐中，藥液滴至6～8℃液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。

本發(fā)明具備的有益效果：

本發(fā)明首次提供了地骨皮乙素作為DPP-4抑制劑在調(diào)節(jié)糖代謝中的用途，以地骨皮乙素為有效成分的藥物組合物可有效改善胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗水平，為糖尿病的防治提供新的藥物選擇。

附圖說(shuō)明

圖1為地骨皮乙素對(duì)DPP-4的抑制作用。

圖2為地骨皮乙素抑制DPP-4的量效關(guān)系。

圖3為地骨皮乙素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。

圖4為地骨皮乙素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞總膽固醇含量的影響，圖中**表示與模型組相比P<0.01。

圖5為地骨皮乙素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的影響，圖中**表示與模型組相比P<0.01。

圖6為地骨皮乙素對(duì)胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞葡萄糖消耗作用的影響，圖中**表示與模型組相比P<0.01。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，該實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例一

DPP-4抑制活性的測(cè)定

采用DPP-4抑制劑篩選方法，將地骨皮乙素制成1mmol/L濃度的溶液；將陽(yáng)性藥抑二肽素A制成1mmol/L濃度的溶液。取96孔板，加50μmol/L特異性DPP-4酶活性檢測(cè)熒光探針2-[4-(1,2,2-三苯基乙烯)苯氧基]-乙酸-賴(lài)氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酸(TPE-KFPE)20μL，地骨皮乙素溶液5μL，0.1U/mL DPP-4酶溶液5μL，混勻后37℃下孵育30min，在激發(fā)波長(zhǎng)320nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm處測(cè)定其熒光強(qiáng)度值。計(jì)算地骨皮乙素對(duì)DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，樣品溶液，反應(yīng)底物溶液均以0.5mmol/L，pH 7.0HEPES緩沖液配制。

I_給藥組：含底物和酶，并且加入待測(cè)樣品反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度值；

I_{給藥空白組}：含底物和待測(cè)樣品，不加酶的熒光強(qiáng)度值；

I_{對(duì)照組}：含底物和酶，但不加入待測(cè)樣品反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度值；

I_空白組：只含有底物，不含酶和待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。

如圖1所示，地骨皮乙素在50μmol/L濃度下抑制率為87.71％。相同條件下，陽(yáng)性藥物抑二肽素A在5μmol/L濃度下抑制率為51.09％。

實(shí)施例二

中藥活性化合物制劑

取實(shí)施例一的中藥活性化合物0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴罐中，藥液滴至6～8℃液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。

實(shí)施例三

中藥活性化合物制劑

取實(shí)施例一的中藥活性化合物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水1L，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。

實(shí)施例四

地骨皮乙素對(duì)DPP-4抑制活性的量效考察

取96孔板，加50μmol/L特異性DPP-4酶活性檢測(cè)熒光探針2-[4-(1,2,2-三苯基乙烯)苯氧基]-乙酸-賴(lài)氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酸(TPE-KFPE)20μL，0.1U/mL DPP-4酶溶液5μL以及一定體積濃度為1mmol/L地骨皮乙素溶液，使得地骨皮乙素終濃度分別為5、10、25、35、50μmol/L，反應(yīng)總體積為100μL?；靹蚝?7℃下孵育30min，在激發(fā)波長(zhǎng)320nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm處測(cè)定其熒光強(qiáng)度值。計(jì)算地骨皮乙素各濃度對(duì)DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，樣品溶液，反應(yīng)底物溶液均以0.5mmol/L，pH 7.0HEPES緩沖液配制。

如圖2所示，地骨皮乙素在5、10、25、35、50μmol/L濃度下抑制率分別為19.91％、70.43％、93.75％、89.32％、96.26％，呈良好量效關(guān)系，表明地骨皮乙素能抑制DPP-4活性。

實(shí)施例五

對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

3T3-L1前脂肪細(xì)胞以2×10⁴個(gè)/孔接種于24孔板，置于37℃、含5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80％左右時(shí)，將培養(yǎng)液換成3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液1培養(yǎng)48h；隨后，換成3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液2繼續(xù)培養(yǎng)48h；之后將培養(yǎng)液換成3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液3，每48h換液一次，直至模型組約有75％的細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，共誘導(dǎo)分化10-12天。在更換誘導(dǎo)液的同時(shí)加入一定體積含地骨皮乙素的培養(yǎng)液，使得地骨皮乙素濃度為25μmol·L^-1。實(shí)驗(yàn)另設(shè)對(duì)照組(不進(jìn)行誘導(dǎo)分化)、模型組和陽(yáng)性藥組(含有300μmol·L^-1西他列汀)。

誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，4％多聚甲醛固定1h，之后PBS漂洗1次，油紅O染色0.5-1h后，70％乙醇水溶液清洗2次，吸盡液體后，于顯微鏡下拍攝圖片，如圖3所示。

地骨皮乙素在25μmol/L濃度下能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化模式是經(jīng)典的脂肪細(xì)胞分化模型，并廣泛應(yīng)用于抗糖尿病藥物篩選與機(jī)制研究。多種抗糖尿病藥物，如羅格列酮等均具有抑制前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。本研究發(fā)現(xiàn)地骨皮乙素在細(xì)胞水平上抑制前脂肪細(xì)胞分化，表明其具有良好的抗糖尿病應(yīng)用前景。

實(shí)施例六

對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞總膽固醇和甘油三酯含量的影響

誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，吸去原培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，每孔加入250μL細(xì)胞裂解液(所有操作于冰上完成)。反復(fù)吹打細(xì)胞，使得細(xì)胞裂解完全，然后吸出每孔液體，4℃、12000rpm離心10min，取上清用于細(xì)胞蛋白定量及甘油三酯、總膽固醇含量的測(cè)定。

甘油三酯和總膽固醇含量測(cè)定：取100μL細(xì)胞蛋白于96孔板中，加入100μL甘油三酯(或總膽固醇)含量測(cè)定工作液，37℃振搖5min，于550nm處測(cè)定吸光度。

最后結(jié)果以甘油三酯(或總膽固醇)含量除以細(xì)胞蛋白含量表示。

如圖4和圖5所示，25μmol/L地骨皮乙素能顯著降低脂肪細(xì)胞中總膽固醇和甘油三酯含量，使得3T3-L1脂肪細(xì)胞中總膽固醇和甘油三酯含量分別為0.27mmol/g蛋白和0.31mmol/g蛋白，與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。

實(shí)施例七

對(duì)胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞葡萄糖消耗作用的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BNL CL.2細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，2×10⁴個(gè)/孔接種于96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，使細(xì)胞貼壁。24h后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，之后加入一定體積的含胰島素和各藥物的DMEM，總體積為100μL，使得胰島素濃度為1μmol·L^-1、地骨皮乙素濃度為25μmol·L^-1。實(shí)驗(yàn)另設(shè)無(wú)細(xì)胞空白組(不含細(xì)胞)、溶劑對(duì)照組(含0.1％DMSO)、模型組(含1μmol·L^-1胰島素)和陽(yáng)性對(duì)照組(含300μmol·L^-1西他列汀和1μmol·L^-1胰島素)。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h后，取各孔10μL上清于新的96孔板中，用于測(cè)定葡萄糖含量。之后將原96孔板中的培養(yǎng)基吸盡，避光加入100μL含0.5mg·mL^-1MTT的培養(yǎng)液，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4h后，吸去含MTT的培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO，37℃震搖10min后，酶標(biāo)儀580nm處測(cè)定各孔吸光度。本部分實(shí)驗(yàn)使用的DMEM均為不含血清的低糖無(wú)酚紅DMEM。

葡萄糖含量測(cè)定：將葡萄糖測(cè)定試劑盒中的R₁工作液和R₂工作液等體積混合后，取200μL混合液加入含有10μL上清的96孔板中，37℃孵育30min后，酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定各孔吸光度。以無(wú)細(xì)胞空白組的葡萄糖含量減去其他各組葡萄糖含量即為各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量，最后除以各組細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)的吸光度進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量的校正。

如圖6所示，25μmol/L地骨皮乙素作用于胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞后，葡萄糖消耗量增加，且與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果表明，地骨皮乙素可增加胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗量，從而控制血糖，因此地骨皮乙素能夠成為預(yù)防和控制餐后高血糖的藥物。