本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
腎纖維化(包括腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化)是各種原因引起的腎臟損害最后階段的主要病理基礎(chǔ)，腎纖維化發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，其中主要與細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞的增殖和活化，血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換失衡有關(guān)，腎間質(zhì)纖維化幾乎是所以原發(fā)或繼發(fā)腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑。急需研發(fā)高效低毒的抗腎纖維化藥物。
腎纖維化的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的化合物，我們對化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗腎纖維化活性進(jìn)行了評價，其具有抗腎纖維化活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為95％和5％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
藥效學(xué)實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗腎纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽具有同樣的藥效。
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1 化合物Atropurpuran的制備
化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照Pei Tang等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Pei Tang et al.,2009.Atropurpuran,a novel diterpene with an unprecedented pentacyclic cage skeleton,from Aconitum hemsleyanum var.atropurpureum.Tetrahedron Letters 50(2009)460–462)的方法。
實施例2 Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏度攪拌6h。6h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg，74％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J＝6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J＝35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C22H28BrO3:419.1222；found 419.1226.
實施例3 Atropurpuran的O-(二乙胺基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于10mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙胺(2920mg，40mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.4，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的棕色固體(152mg,74％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.34(s,1H),5.12(s,1H),4.77(s,1H),4.72(s,1H),4.43(s,1H),3.74(s,1H),3.47(s,2H),2.91(s,1H),2.82(s,4H),2.57(s,2H),2.16(s,1H),2.04(s,1H),1.98–1.84(m,5H),1.74–1.68(m,4H),1.24(s,2H),1.07(s,6H),0.88(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.41(s),203.13(s),150.80(s),125.13(s),111.52(s),78.60(s),66.92(s),57.74(s),52.16(s),47.59(s),47.36(s),40.76(s),34.44(s),32.55(s),29.22(s),28.98(s),26.38(s),24.20(s),22.16(s),20.61(s),11.96(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H38N1O3:412.2852；found:412.2849。
實施例4 Atropurpuran的O-(二(2-甲硫基乙基))乙基衍生物的合成
1、Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成
將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙醇胺(1051mg，10mmol)，混合物加熱回流1h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集淺棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的黃色固體(159.5mg,72％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),5.13(s,1H),4.61(d,J＝10.5Hz,2H),4.25(s,1H),3.75(s,1H),3.54(s,2H),3.36(s,4H),2.89(s,1H),2.62(s,2H),2.51(s,4H),2.32(s,2H),2.17(s,1H),2.05(s,1H),1.95(dd,J＝13.4,11.6Hz,4H),1.78(s,1H),1.76–1.69(m,4H),1.44(s,2H),0.89(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.46(s),203.18(s),150.85(s),125.18(s),111.57(s),78.65(s),67.01(s),58.86(s),57.79(s),56.41(s),53.21(s),47.64(s),40.81(s),34.49(s),32.60(s),29.27(s),29.03(s),26.43(s),24.25(s),22.21(s),20.66(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H38N1O5:444.2750；found:444.2744。
Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物
2、Atropurpuran的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的合成
合成足夠多的Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，將Atropurpuran的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(0.222g，0.5mmol)溶于6mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(2.38g，20mmol)，反應(yīng)物加熱回流3h。將反應(yīng)物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.5，v/v)，得到化合物Atropurpuran的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的淡黃色固體(143.7mg，60％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.69(s,1H),5.11(s,1H),4.76(s,1H),4.71(s,1H),4.59(s,1H),3.84(s,1H),3.66(s,4H),3.53(s,2H),2.93(s,1H),2.76(s,2H),2.68(s,2H),2.61(s,2H),2.16(s,1H),2.04(s,1H),1.95(dd,J＝21.9,12.0Hz,4H),1.77(s,1H),1.71(d,J＝5.4Hz,2H),1.46(d,J＝17.9Hz,4H),0.89(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.41(s),203.13(s),150.80(s),125.13(s),111.52(s),78.60(s),66.96(s),57.74(s),55.76(s),53.16(s),47.59(s),40.76(s),39.18(s),34.44(s),32.55(s),29.22(s),28.98(s),26.38(s),24.20(s),22.16(s),20.61(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H36Cl2N1O3:480.2072；found:480.2069。
Atropurpuran的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的合成
3、Atropurpuran的O-(二(2-甲硫基乙基))乙基衍生物的合成
制備足夠多的化合物Atropurpuran的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物，將化合物Atropurpuran的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(0.240g，0.5mmol)溶于12mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(2.1g，30mmol)，反應(yīng)物加熱回流2h。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱層析進(jìn)行純化(石油醚/丙酮100:0.5，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.153g，61％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.72(s,1H),5.13(s,1H),4.68–4.58(m,3H),3.84(s,1H),3.54(s,2H),2.94(s,1H),2.64(s,2H),2.58(d,J＝9.4Hz,8H),2.18(s,1H),2.08–1.91(m,11H),1.89–1.62(m,3H),1.48(d,J＝18.3Hz,4H),0.91(s,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.56(s),203.28(s),150.85(s),125.28(s),111.67(s),78.75(s),67.11(s),57.89(s),53.31(s),52.25(s),47.74(s),40.91(s),34.59(s),32.70(s),31.98(s),29.37(s),29.13(s),26.53(s),24.35(s),22.31(s),20.76(s),14.60(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C28H42N1O3S2:504.2606；found:504.2600。
實施例5 組合物對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響
1.1材料
貝那普利，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)；羥脯氨酸(HYP)試劑盒，南京建成生物公司；纖維連結(jié)蛋白(FN)試劑盒購自上海生物制品所。
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的95mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的5mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
實驗動物：普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠。
1.2試驗方法與結(jié)果
大鼠60只，隨機(jī)分6組，即假手術(shù)組、模型組、苯那普利灌胃10mg/kg組、組合物灌胃10mg/kg組、化合物III灌胃10mg/kg組、化合物IV灌胃10mg/kg組，動物喂養(yǎng)1周，各大鼠以10％水合氯醛3.0mL/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠右側(cè)臥位固定與手術(shù)臺上，剪毛后用碘酒、75％酒精消毒手術(shù)區(qū)，行左側(cè)腹切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側(cè)輸尿管，假手術(shù)組僅切開腹腔并游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷，其他各組大鼠用4-0絲線結(jié)扎兩道，上一道結(jié)扎點位于左腎下極水平，然后在兩道結(jié)扎點剪斷輸尿管，逐層縫合，術(shù)后10天10％水合氯醛麻醉后處死各組動物，取血，按纖維連結(jié)蛋白測定說明測定說明纖維聯(lián)接蛋白(FN)。生理鹽水反復(fù)灌洗后留取左側(cè)腎臟，腎組織經(jīng)4％的多聚甲醛緩沖液固定。切取適量腎組織，按羥脯氨酸試劑盒測定說明測定羥脯氨酸。
常規(guī)病理學(xué)檢①肉眼觀察：假手術(shù)組腎臟顏色鮮紅，表明光滑，包膜光澤，無粘連。模型對照組腎臟體積增大，顏色蒼白，表明呈顆粒狀，類似人體大白腎，少數(shù)區(qū)域腎包膜粘連。②光鏡檢查：假手術(shù)組腎單位結(jié)果清晰，腎小球囊無擴(kuò)張或炎細(xì)胞浸潤。模型對照組大片腎小管壞死，腎間質(zhì)纖維細(xì)胞增生，腎小管擴(kuò)張，內(nèi)有大量棕黃色遮光物質(zhì)或壞死脫落的上皮細(xì)胞，腎小球數(shù)目減少，部分腎小球纖維化并與包曼氏囊壁粘連，囊腔消失。組合物給藥組病變與模型對照組類似，但均有不同程度的形態(tài)學(xué)改善，與模型對照組比較有明顯差異。而化合物III給藥組和化合物IV給藥組與模型對照組無顯著性差異。
表1組合物對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響
*p<0.05，與模型組相比較
對各組FN、HYP進(jìn)行T檢驗。結(jié)果見表1，組合物灌胃10mg/kg顯著降低FN、HYP水平(與模型對照組比較，P<0.05)；而化合物III和化合物IV灌胃10mg/kg未能顯著降低FN、HYP水平。
結(jié)論：組合物能夠顯著降低腎間質(zhì)纖維化FN、HYP水平的升高，抑制腎間質(zhì)纖維化，可以用來制備抗腎纖維化藥物。化合物III和化合物IV不能夠顯著降低腎間質(zhì)纖維化FN、HYP水平的升高，不能抑制腎間質(zhì)纖維化，不可以用來制備抗腎纖維化藥物。
實施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
實施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。