本發(fā)明涉及藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來說是一種用于防治肺纖維化的隱丹參酮類及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺纖維化（pulmonaryfibrosis，PF）是病因未明的慢性、進(jìn)展性間質(zhì)型肺炎的一種特殊類型。發(fā)病人群為50～70歲，男性多發(fā)于女性。生存率低，早期癥狀不明顯，目前治療主要是以緩解病情為主。肺組織分實(shí)質(zhì)和間質(zhì)兩部分，實(shí)質(zhì)是進(jìn)行氣體交換的場(chǎng)所，而間質(zhì)則是肺纖維化的發(fā)生部位。過敏反應(yīng)、環(huán)境顆粒、感染或機(jī)械性的損傷均可導(dǎo)致正常組織結(jié)構(gòu)的破壞。急性受損的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)釋放炎癥因子和啟動(dòng)抗纖溶系統(tǒng)凝集。同時(shí)血小板在受損部位大量聚集，形成富含纖維的凝塊。在炎癥階段，趨化因子梯度會(huì)招募大量的炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，它們分泌大量的細(xì)胞因子，如白介素IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TGF-β，促進(jìn)上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，最終產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)。在纖維化階段，細(xì)胞外基質(zhì)如膠原、纖連蛋白通過整合素等細(xì)胞表面受體，介導(dǎo)下游信號(hào)的發(fā)生，導(dǎo)致肺組織的正常結(jié)構(gòu)被增厚的纖維組織所填充，氣體交換功能喪失和呼吸衰竭。成纖維細(xì)胞異?；罨只杉〕衫w維細(xì)胞，是肺纖維化合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的來源。目前可能導(dǎo)致肺纖維化的因素主要包括自身免疫性疾病、抗腫瘤藥物的使用、誤服農(nóng)藥、各種病毒感染以及長(zhǎng)期吸入粉塵、長(zhǎng)期吸煙等。肺動(dòng)脈高壓、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、胃食管反流病和缺血性心臟病，是肺纖維化常見的合并癥。迄今為止，治療肺纖維化的方法主要有肺移植，去除長(zhǎng)期抗原刺激，和藥物治療。其中肺移植是終末肺階段唯一有效的治療方法，但由于缺乏適當(dāng)?shù)墓w及免疫排斥反應(yīng)，其開展受到很大的限制。而在藥物治療方面，糖皮質(zhì)激素可以減輕炎癥反應(yīng)、抑制免疫過程，對(duì)以肺泡炎癥為主的肺纖維化有著一定的幫助；但是對(duì)彌漫性肺纖維化病人療效甚差，且長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素副作用太大。中藥理肺化纖方等還處于初步發(fā)展階段。吡啡尼酮是目前新的一種對(duì)抗纖維化治療效果比較好的口服藥物，但因其價(jià)格不菲，臨床應(yīng)用受限。丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根及根莖，是最常用的活血化瘀中藥之一，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有去瘀止痛、養(yǎng)血安神的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善微循環(huán)、保護(hù)心肌、抑制和解除血小板聚集、增加冠脈流量，提高機(jī)體耐缺氧能力，抑制膠原纖維的產(chǎn)生和促進(jìn)纖維蛋白的降解，抗炎，抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基，以及保護(hù)肝細(xì)胞、抗肺纖維化等作用。隱丹參酮是一種從中藥丹參中提取的有效成分，IUPAC命名（R）-1，2，6，7，8，9-Hexahydro-1，6，6-trimethyl-phenanthro（1，2-b）furan-10，11-dione，英文名稱Cryptotanshinone，分子式C19H2003，分子量294.33；CAS號(hào)35825-57-1，物理性質(zhì)：橙色粉末。溶于甲醇、乙醇、苯、乙醚，易溶于丙酮、氯仿；與濃硫酸作用顯紅色，在避光及非溶液狀態(tài)下最穩(wěn)定。熔點(diǎn)184-185℃，易溶于氯仿，溶于甲醇等有機(jī)溶劑，微溶于水。隱丹參酮是從植物丹參根部提取的醌類二萜，現(xiàn)代藥理研究表明隱丹參酮具有抑菌作用、抗炎作用、類激素樣藥理作用，臨床用于治療心肌纖維化、肺部急性損傷、關(guān)節(jié)炎。迄今為止，未見隱丹參酮作為治療肺纖維化的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供隱丹參酮在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中的用途，隱丹參酮通過抑制肺成纖維細(xì)胞增殖、抑制肺成纖維細(xì)胞活化、降低肺纖維化組織內(nèi)羥脯氨酸含量、降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，具有防治肺纖維化的新用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種隱丹參酮（Ⅰ）或其藥學(xué)上可接受鹽或含有它們中任何一種藥物組合物在制備藥物中的應(yīng)用；（Ⅰ）。進(jìn)一步的，隱丹參酮或其藥學(xué)上可接受鹽用于預(yù)防或/和治療肺纖維化疾病藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，所述隱丹參酮在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中時(shí)，抑制肺成纖維細(xì)胞活化或增殖的濃度為5～20μM。進(jìn)一步的，所述隱丹參酮在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病藥物中時(shí)，抑制人胚肺成纖維細(xì)胞纖維蛋白表達(dá)的濃度為10～20μM。進(jìn)一步的，所述隱丹參酮在用于治療SD大鼠肺纖維化時(shí)，其使用劑量范圍是6～60mg/kg。進(jìn)一步的，所述隱丹參酮在制備降低肺纖維化大鼠體重、肺系數(shù)、組織內(nèi)羥脯氨酸含量藥物中的用途。進(jìn)一步的，所述隱丹參酮在制備降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量藥物中的用途。進(jìn)一步的，所述隱丹參酮在制備影響大鼠肺纖維化組織病理結(jié)構(gòu)藥物中的用途。本發(fā)明的有益技術(shù)效果：隱丹參酮是從植物丹參根部提取的醌類二萜，現(xiàn)代藥理研究表明隱丹參酮具有抑菌作用、抗炎作用、類激素樣藥理作用，臨床用于治療心肌纖維化、肺部急性損傷、關(guān)節(jié)炎；可用于用于預(yù)防或/和治療肺纖維化疾病藥物，也可用于制備降低肺纖維化大鼠體重、肺系數(shù)、組織內(nèi)羥脯氨酸含量藥物，可用于制備降低肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量藥物和制備影響大鼠肺纖維化組織病理結(jié)構(gòu)藥物。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為隱丹參酮治療28天對(duì)大鼠肺組織病理形態(tài)變化的影響（HE染色）；圖2為隱丹參酮治療28天對(duì)大鼠肺組織病理形態(tài)變化的影響（MASSON染色）。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)驗(yàn)例1隱丹參酮對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞（HLF）細(xì)胞增殖的影響：（1）實(shí)驗(yàn)材料：HLF細(xì)胞購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）、類胎牛血清（美國Hyclone）、MTT（Sigma）；（2）實(shí)驗(yàn)方法：5.0×103的HLF細(xì)胞加入到96孔板的板孔中，培養(yǎng)24h。吸出原培養(yǎng)液，加入含有不同濃度（2.5μM、5μM、10μM、20μM）的隱丹參酮的完全培養(yǎng)液，以加入不含隱丹參酮的完全培養(yǎng)液作為正常對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48h，向每孔中加入20μL的含有5mg/mLMTT的磷酸鹽緩沖鹽水，培養(yǎng)4h后，吸出每孔的培養(yǎng)液，每孔加入200μL的二甲基亞砜（DMSO）。震蕩15min，在490nm波長(zhǎng)，檢測(cè)各孔吸光度值，檢測(cè)細(xì)胞活力；（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：詳見表1。隱丹參酮在3.125-100μM范圍內(nèi)，沒有明顯細(xì)胞毒性表1隱丹參酮對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞（HLF）增殖的細(xì)胞毒作用（`x±s）。實(shí)驗(yàn)例2隱丹參酮對(duì)TGF-β1刺激人胚肺成纖維細(xì)胞（HLF）細(xì)胞異?；罨挠绊懀海?）實(shí)驗(yàn)材料：HLF細(xì)胞購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）、類胎牛血清（美國Hyclone）、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（HumanTGF-β1，PeproTechInc）；（2）實(shí)驗(yàn)方法：5.0×103的HLF細(xì)胞加入到96孔板的板孔中，培養(yǎng)24小時(shí)。將肺成纖維細(xì)胞分為：TGF-β1處理組（5ng/mL作用時(shí)間48h）；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時(shí)間48h）+隱丹參酮2.5μM；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時(shí)間48h）+隱丹參酮5μM；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時(shí)間48h）+隱丹參酮10μM。TGF-β1處理組（5ng/mL作用時(shí)間48h）+隱丹參酮20μM。48h后BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。以TGF-β1未刺激組作為對(duì)照，分析各組肺成纖維細(xì)胞增殖率的差異；（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2表2隱丹參酮對(duì)TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞增殖的影響（`x±s）#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.表2結(jié)果可以看出，TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞48h，肺成纖維細(xì)胞增殖率明顯增加，說明TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖，而加隱丹參酮后5-20μM48h，明顯抑制肺成纖維細(xì)胞增殖，說明隱丹參酮抑制肺成纖維細(xì)胞異?；罨?。實(shí)驗(yàn)例3隱丹參酮對(duì)TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞纖維蛋白表達(dá)的影響：（1）材料與方法：HLF細(xì)胞購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（HumanTGF-β1，PeproTechInc）、α-SMA抗體（Boster公司）、鼠二抗（美國Thermo）；胰蛋白酶、α-tubulin抗體（美國Sigma）、兔二抗（美國Promega）；（2）試驗(yàn)方法：將細(xì)胞接種于6孔板，胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70～80%，用無血清培養(yǎng)基饑餓24h，換新鮮培養(yǎng)液，將傳代的HLF細(xì)胞分為：對(duì)照組、隱丹參酮組、隱丹參酮25μM，作用時(shí)間48hTGF-β1處理組（5ng/mL作用時(shí)間48h）；TGF-β1處理組（5ng/mL作用時(shí)間48h）+隱丹參酮25μM；48h后收獲并裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。BCA測(cè)定蛋白濃度后，取23μg樣品蛋白進(jìn)行10%的十二烷基磺酸鈉2聚丙烯酞胺（SDS-PAGE）凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)至（PVDF膜，α-tublin作內(nèi)參，Westernblot檢測(cè)細(xì)胞α-SMA的表達(dá)。以TGF-β1未刺激組作為對(duì)照，使用Graphpadprism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間的差異采用one-wayANOVA分析；（3）試驗(yàn)結(jié)果表3隱丹參酮對(duì)TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞的α-SMA表達(dá)影響（n=4）組別COL-I（%）正常組1.00±0.12隱丹參酮組（20μM）1.22±0.21TGF一β1刺激組2.08±0.76##TGF一β1刺激+隱丹參酮組（10μM）1.15±0.17TGF一β1刺激+隱丹參酮組（20μM）0.90±0.64**#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.表3結(jié)果可以看出，TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞48h，纖維蛋白α-SMA表達(dá)明顯下降，說明TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)向肺成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而加隱丹參酮25μM后48h，明顯抑制α-SMA表達(dá)，說明隱丹參酮抑制肺成纖維細(xì)胞向肺成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)例4隱丹參酮對(duì)博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化模型大鼠的影響用博萊霉素制作的肺纖維化模型，其病理組織學(xué)和生理學(xué)改變與人類肺纖維化近似，因此成為肺纖維化造模的常用藥物。博萊霉素經(jīng)氣管滴注給藥可誘導(dǎo)SD大鼠發(fā)生肺纖維化。在博來霉素給藥后，灌胃給予藥物隱丹參酮，劑量分別為6mg/kg、20mg/kg、60mg/kg，對(duì)照組為等劑量的水；（1）實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)SD（Sprague-Dawley）大鼠60只，8周齡，體重180-220g，雌性，購自于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SYXK（粵）2011-0029），動(dòng)物合格證編號(hào):44008500011143，環(huán)境溫度:20～26℃，濕度40～70%，自由攝食飲水；博萊霉素（invitrogen）、吡非尼酮（上海麥克林）、羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、隱丹參酮（中山大學(xué)藥物化學(xué)研究所）；隱丹參酮由中山大學(xué)藥物化學(xué)研究所提供（批號(hào)：20071011，含量：95%），臨用前稱取60mgCTS單體原料藥至10mL0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）中，震蕩混勻制成混懸液，配成濃度為60mg·mL?1的高劑量CTS，依次稀釋得中劑量（20mg·mL?1）、低劑量（6mg·mL?1）。灌胃給藥體積均為10mL/kg；（2）實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物分組：大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成6組，每組10只，分別為對(duì)照組、模型組、隱丹參酮低、中、高劑量組、吡非尼酮組（60mg/kg）；模型制備：大鼠博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型的建立：10%水合氯醛（3.5ml/kg）麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，局部消毒后，用剪刀剪開喉部皮膚，做頓性分離逐漸使氣管暴露，后用1ml注射器吸取配備好的博萊霉素溶液0.1ml（5mg/kg），向氣管內(nèi)快速注射，后垂直放置大鼠，將其左右旋轉(zhuǎn)3-4周，使博萊霉素溶液均勻分布于肺部，后用針線縫合手術(shù)傷口，讓大鼠自然清醒；給藥方案：各組動(dòng)物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始大鼠每隔一天稱重一次，按照相應(yīng)的體重灌胃給藥，正常組及模型組給予等體積生理鹽水，陽性對(duì)照組給予吡非尼酮，各治療組分別給予不同劑量的隱丹參酮。連續(xù)給藥28天；檢測(cè)指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)第28天為終點(diǎn)，觀察各組大鼠的大體情況并記錄，后在水合氯醛腹腔麻醉的條件下，收集各組大鼠的肺泡灌洗液，稱肺重，取血離心測(cè)定細(xì)胞因子，下半部分福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋切片，做HE染色和Masson染色；（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1）隱丹參酮對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸（HYp）和肺系數(shù)的影響（x士s，n=10～12）造模后給藥28天，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠體重顯著減輕，肺組織中羥脯氨酸含量顯著增加（p<0.05），肺系數(shù)顯著高于正常組（p<0.01）；隱丹參酮各劑量組大鼠體重顯著增加，大鼠肺組織中羥脯氨酸的含量低于模型組，肺系數(shù)均低于模型組。陽性對(duì)照吡非尼酮組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量與模型組相比顯著降低（p<0.01），肺系數(shù)亦有所下降，見表4；表4隱丹參酮對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸（HYP）和肺系數(shù)的影響#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.2）隱丹參酮對(duì)肺纖維化大鼠肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響大鼠博萊霉素造模28天后，肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)較空白對(duì)照組明顯上升（p<0.01）；大鼠灌胃隱丹參酮后，能明顯降低肺組織中以上細(xì)胞因子的表達(dá)），見表5；表5隱丹參酮對(duì)肺纖維化大鼠肺組織中細(xì)胞因子表達(dá)的影響組別劑量（mg/kg）IL-1β（ng/L）IL-6（ng/L）TNF-α（ng/mL）對(duì)照組（10mg/kg）6.75±1.189.31±1.18131.75±25.00模型組（10mg/kg）17.23±3.72##27.91±5.30##341.9±81.23##吡非尼酮組608.64±2.70**9.84±2.31**214.16±60.54*隱丹參酮組低劑量組612.44±1.5612.27±4.07**168.61±16.72**中劑量組2011.53±1.24*11.63±0.20**143.35±38.43**高劑量組604.43±0.43**13.25±0.20**214.16±60.54**注:#p<0.05vsControl;##p<0.01vsControl;*p<0.05，**p<0.01vsmodel.3）隱丹參酮對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)改變的影響HE染色結(jié)果顯示：正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡壁未見增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見明顯滲出，無炎性細(xì)胞浸潤，無成纖維細(xì)胞增生。模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞增生，肺纖維化形成。隱丹參酮各給藥組與模型組比較情況好轉(zhuǎn)，病變范圍明顯減少，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較少。陽性對(duì)照吡非尼酮組病變程度較模型組有所減輕。見附圖1；馬蘇染色結(jié)果顯示：正常對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，纖維化模型組大鼠在肺泡間隔、肺泡壁，以及終末細(xì)支氣管、呼吸性細(xì)支氣管和小支氣管管壁周圍均可見到大量增生的藍(lán)色膠原纖維，隱丹參酮各組與模型組相比纖維化程度輕，膠原總含量較少，表明隱丹參有減輕膠原纖維增生，改善肺間質(zhì)纖維化的作用，陽性對(duì)照吡非尼酮組病變程度較模型組有所減輕，見附圖2。本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語（包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語）具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會(huì)用理想化或過于正式的含義來解釋。最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁1 2 3