本發(fā)明涉及中藥，具體涉及中藥提取，尤其涉及一種利用萃取廢液制備高含量銀杏總黃酮的方法。
背景技術(shù)：
銀杏，又名白果樹、公孫樹,是我國特有樹種。銀杏的葉、果、樹皮均可入藥,尤以葉的藥用價值最高。銀杏葉的化學成分較為復雜，其提取物中主要含有黃酮類化合物和二萜類化合物，銀杏黃酮能夠增加腦血管血液流量，改善腦血管血液循環(huán)功能，保護腦細胞，擴張冠狀動脈，預防心絞痛及心肌梗塞，預防血栓形成，提高機體免疫能力。
CN 102138945 A《一種自銀杏葉中提取高黃酮含量活性物質(zhì)的方法》，該技術(shù)方案涉及一種黃酮活性物質(zhì)的分離方法，其操作步驟繁瑣、過程復雜，且在收率25％的情況下，其黃酮含量僅達22％，黃酮類有效成分損失較大，造成浪費。
CN 102078341 A《高純度銀杏黃酮及組合物》中提到一種高純度銀杏黃酮的制備方法，其通過大孔樹脂柱分離時，為了得到高純度黃酮，只收集50％-70％乙醇高黃酮含量部位的洗脫液，致使其收率大大下降，不足20％，造成了極大的資源浪費；其次，該工藝分離后只得到了弱極性和中等極性銀杏黃酮，其所含的黃酮成分，與標準銀杏葉提取物相比，種類差異較大，難以和銀杏葉提取物相比較。
銀杏葉中主要成分為銀杏內(nèi)酯及銀杏總黃酮類成分，目前銀杏內(nèi)酯類成分已被開發(fā)成為新藥上市，但是大量銀杏總黃酮類有效成分被丟棄，造成資源浪費，而有機溶劑萃取技術(shù)作為工業(yè)上從銀杏葉中提取富集銀杏內(nèi)酯的主要技術(shù)手段，萃余廢液中含有大量的銀杏總黃酮類成分，同時也含有大量的有機溶劑。通常情況下，20℃時正丁醇在水中的溶解度7.7％(重量)，乙酸乙酯在水中的溶解度為10％(體積)。如何從該廢液中回收富集銀杏總黃酮的同時控制有機溶劑的殘留，并最終得到溶劑殘留符合要求和含量高的銀杏總黃酮，對于提高產(chǎn)品質(zhì)量，減少資源浪費，降低生產(chǎn)成本，環(huán)境保護等方面，具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計既不影響銀杏內(nèi)酯及其他有效部位，又能提高銀杏總黃酮收率與含量，并減少有機溶劑的殘留，且適于工業(yè)化生產(chǎn)中回收銀杏總黃酮的方法。
本發(fā)明提供了一種利用萃取廢液制備高含量銀杏總黃酮的方法，該方法包括下列步驟：
(1)將銀杏葉提取物加入4-5倍提取物重量的50℃-80℃水中，攪拌至完全溶解后，加入等體積的乙酸乙酯萃取2-4次，分別收集萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；
(2)萃取廢液加入水稀釋，通過保溫處理后的聚酰胺樹脂富集，水或含量≤10％的乙醇水溶液除雜2BV-4BV，再用50％-70％的乙醇溶液洗脫，并接取乙醇洗脫液，真空減壓60-80℃減壓濃縮至干，50-80℃減壓干燥2-4h，粉碎過80目篩，即可。
經(jīng)檢測，用本發(fā)明方法對萃取廢液處理后制得的產(chǎn)品，其中銀杏總黃酮含量≥80％，乙酸乙酯和正丁醇溶劑殘留為≤10ppm，銀杏總黃酮回收率≥65％。
本發(fā)明方法所述步驟(1)溶解銀杏葉提取物的水溶液溫度為60℃-70℃，銀杏葉提取物與稀釋所用的水的質(zhì)量體積比為1∶4-5(m/V)，每次乙酸乙酯用量為0.8-1.2倍量銀杏葉提取物溶液體積(V/V)，優(yōu)選為1.0倍量體積(V/V)。
所述步驟(2)萃取廢液與稀釋所用的水的體積比為1∶30-40(V/V)。
所述步驟(2)聚酰胺樹脂選自30-60目；保溫處理聚酰胺樹脂的溫度為40-45℃，保溫1-3h。
所述步驟(2)，除雜液為水或含量≤10％的乙醇水溶液，體積為2-4BV，洗脫溶劑為50-70％乙醇水溶液。
所述步驟(2)減壓濃縮真空度為-0.09至-0.1MPa，溫度為60-70℃，時間為3-4h，減壓干燥溫度為50-80℃，時間2-4h。
本發(fā)明方法不僅可用于處理以市售銀杏葉提取物(即符合銀杏內(nèi)酯6％和銀杏黃酮24％的銀杏葉標準提取物)為起始原料所產(chǎn)生的有機溶劑萃取廢液，還可以用于處理在制備銀杏內(nèi)酯工藝過程中產(chǎn)生的含有銀杏黃酮的廢液如銀杏內(nèi)酯結(jié)晶后的母液，因為該廢液在除去大部分有機溶劑(通常為甲醇或乙醇)后可以與有機溶劑萃取廢液進行合并處理。另外，由于銀杏葉的提取工藝有多種，在提取過程中可能用到的有機溶劑不限于乙酸乙酯和正丁醇兩種，還可能用到如丙酮、乙醚、除乙酸乙酯外的乙酸酯類、正己烷等有機溶劑，工藝中產(chǎn)生的含有這些有機溶劑和銀杏黃酮的廢液，也可參考上述工藝技術(shù)方案進行回收銀杏黃酮的制備。
本發(fā)明所得銀杏總黃酮中銀杏總黃酮含量≥80％，乙酸乙酯和正丁醇溶劑殘留為≤10ppm，銀杏總黃酮回收率≥65％，其中銀杏總黃酮回收率為萃取廢液中銀杏總黃酮的黃酮率，計算公式為C1×m1/C2×m2×100％
C1：銀杏總黃酮富集物總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/g)
m1：銀杏總黃酮富集物的總重量(g)
C2：萃取廢液中銀杏總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/g)
m2：萃取廢液的總重量(g)
本技術(shù)方案具有以下優(yōu)點：
①本方法以銀杏葉提取物萃取廢液為原料，萃取制備銀杏內(nèi)酯類成分，回收富集銀杏總黃酮，所有有效成分可以完全提取，并提高銀杏總黃酮有效成分利用率，節(jié)省成本。
②銀杏葉提取物通過有機溶劑萃取后，萃取廢液一次過柱即可回收富集銀杏總黃酮，操作簡便，且總黃酮含量高，收率高，最大程度降低有機溶劑殘留量。
本方法用銀杏葉提取物有機溶劑萃取廢液為原料，工藝簡單，回收富集萃取廢液中的銀杏總黃酮，全過程除乙醇和乙酸乙酯/正丁醇外，不用其它有機溶劑，可實現(xiàn)溶劑回收利用的綠色生產(chǎn)。產(chǎn)品含量高，收率高，適于工業(yè)化生產(chǎn)，有較大的應(yīng)用價值。
具體實施方式
為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
參考下列實施例將更易于理解本發(fā)明，給出實施例是為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
銀杏黃酮醇苷含量檢測方法參考藥典銀杏葉提取物項下總黃酮醇苷含量測定方法；銀杏總黃酮含量測定方法參考文獻(張國勇,梁曉美,方壘.銀杏葉片和銀杏酮酯片的質(zhì)量比較和用藥成本分析，中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學,2014,(9):1136-1140)。
實施例1
取銀杏葉提取物1kg，加入5L 85℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯萃取3次，每次5L，分別收集萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入450L 30℃水溶液稀釋，通過10L聚酰胺樹脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度40℃，用30L水洗至流出液近無色后，再用70％乙醇洗脫30L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)濃縮至浸膏(含水量為15％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥4h，最終得到銀杏總黃酮147.71g，經(jīng)檢測，銀杏黃酮醇苷含量為61.66％，銀杏總黃酮含量為81.20％，總黃酮回收率為66.63％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
實施例2
取銀杏葉提取物2kg，加入10L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入正丁醇萃取3次，每次10L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入900L 30℃水溶液稀釋，通過20L聚酰胺樹脂(30-60目)保溫吸附3h，溫度45℃，用60L水洗至流出液近無色后，再用75％乙醇洗脫60L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)濃縮至浸膏(含水量為15％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下70℃減壓干燥3h，最終得到銀杏總黃酮298.87g，經(jīng)檢測，銀杏黃酮醇苷含量為60.58％，銀杏總黃酮含量為82.21％，總黃酮回收率為68.25％，正丁醇含量≤10ppm。
實施例3
取銀杏葉提取物0.5kg，加入2.5L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯與正丁醇混合溶劑(1：1)萃取3次，每次2.5L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入80L 30℃水溶液稀釋，通過5L聚酰胺樹脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度45℃，用20L水洗至流出液近無色后，再用70％乙醇洗脫20L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)濃縮至浸膏(含水量為18％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥2h，最終得到銀杏總黃酮74.76g，經(jīng)檢測，銀杏黃酮醇苷含量為58.22％，銀杏總黃酮含量為79.63％，總黃酮回收率為65.88％，乙酸乙酯含量≤10ppm，正丁醇含量≤10ppm。
實施例4
取銀杏葉提取物0.1kg，加入0.5L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯萃取3次，每次0.5L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入45L 30℃水溶液稀釋，通過1L聚酰胺樹脂(30-60目)保溫吸附1h，溫度45℃，用2L水洗至流出液近無色后，再用75％乙醇洗脫4L，洗脫液于60℃減壓濃縮(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(含水量為20％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下75℃減壓干燥4h，最終得到銀杏總黃酮16.26g，經(jīng)檢測，銀杏黃酮醇苷含量為61.42％，銀杏總黃酮含量為79.96％，總黃酮回收率為72.24％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
實施例5
取銀杏葉提取物1.5kg，加入6L 80℃熱水溶解，降溫至40℃，加入乙酸乙酯萃取4次，每次6L，合并萃取液及萃取廢液，萃取液收集待用；萃取廢液加入720L 30℃水溶液稀釋，通過15L聚酰胺樹脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度40℃，用60L水洗至流出液近無色后，再用70％乙醇洗脫45L，洗脫液于60℃減壓(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(含水量為18％)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥5h，最終得到銀杏總黃酮233.19g，經(jīng)檢測，銀杏黃酮醇苷含量為63.06％，銀杏總黃酮含量為81.12％，總黃酮回收率為70.06％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
實施例6
取銀杏葉2kg，加入8L 70％乙醇(m/V)回流提取2次，每次2h，合并乙醇提取液，60℃減壓濃縮(真空度-0.09-0.10MPa)至無醇味(密度1.05g/ml)，通過300ml D-101樹脂吸附洗脫，先用10％乙醇除雜600ml，再用70％乙醇洗脫600ml，洗脫液于60℃減壓濃縮至流浸膏(密度1.05g/ml),加入正丁醇：乙酸乙酯(1:2)混合溶液萃取3次，每次300ml，分別收集萃取液及萃余液，萃取液通過結(jié)晶方法制備銀杏總內(nèi)酯，結(jié)晶后母液濃縮至無乙醇味,與萃余液合并，加入20L 30℃水溶液稀釋，通過6L聚酰胺樹脂(30-60目)保溫吸附2h，溫度40℃，用12L水洗至流出液近無色后，再用70％乙醇洗脫18L，洗脫液于60℃減壓濃縮(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(密度1.10g/ml)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥5h，最終得到銀杏總黃酮47.78g，經(jīng)檢測，銀杏黃酮醇苷含量為61.05％，銀杏總黃酮含量為80.54％，總黃酮回收率為71.16％，乙酸乙酯含量≤10ppm，正丁醇含量≤10ppm。
實施例7
取銀杏葉10kg，加入10倍銀杏葉重量的75％乙醇(m/V)回流提取2次，每次2h，合并乙醇提取液，60℃減壓濃縮(真空度-0.09-0.10MPa)至無醇味(密度1.05g/ml)，通過1.5L D-101樹脂吸附洗脫，先用10％乙醇除雜3L，再用70％乙醇洗脫4.5L，洗脫液于60℃減壓濃縮至流浸膏(密度1.05g/ml),加乙酸乙酯萃取3次，每次1L，分別收集萃取液及萃余液，萃取液通過結(jié)晶方法制備銀杏總內(nèi)酯，結(jié)晶后母液與萃余液合并，加入80L 30℃水溶液稀釋，通30L聚酰胺樹脂(30-60目)保溫吸附1h，溫度45℃，用60L 5％乙醇洗至流出液近無色后，再用70％乙醇洗脫180L，洗脫液于60℃減壓濃縮(真空度為-0.09-0.1Mpa)至浸膏(密度1.10g/ml)，放置于減壓干燥箱中于-0.09至-0.1MPa條件下80℃減壓干燥3h，最終得到銀杏總黃酮241.09g，經(jīng)檢測，銀杏黃酮醇苷含量為62.33％，銀杏總黃酮含量為81.28％，總黃酮回收率為65.04％，乙酸乙酯含量≤10ppm。
本發(fā)明方法研究設(shè)計的難點排除以及工藝設(shè)計試驗：
一、最佳工藝研究設(shè)計：
(一)當采用將萃取廢液直接濃縮，然后真空干燥的方式制備銀杏總黃酮，該方法操作簡便省時，可快速回收得到銀杏總黃酮，且收率高，但是濃縮過程中無法將有機溶劑完全去除，有機溶劑殘留量較大，即使是長時間加熱真空干燥也無法達到控制有機溶劑殘留量的滿意效果，且能耗高，總黃酮含量低，因此，該技術(shù)路線不可取?？傸S酮重量、總黃酮含量、總黃酮回收率、乙酸乙酯和正丁醇殘留量的數(shù)據(jù)見表1。
(二)當采用將萃取廢液直接上大孔吸附樹脂吸附和洗脫，然后減壓濃縮、干燥的方式制備銀杏總黃酮，銀杏總黃酮收率與含量偏低，究其原因是由于萃取廢液中有機溶劑濃度過高，導致上樣吸附不完全，降低收率，另外，由于大孔樹脂選擇性特點，對于銀杏總黃酮無特異性吸附，在富集銀杏總黃酮過程中會同時吸附其它雜質(zhì)成分，最終導致銀杏總黃酮收率與含量同時偏低?？傸S酮重量、總黃酮含量、總黃酮回收率、乙酸乙酯和正丁醇殘留量的數(shù)據(jù)見表1。
(三)當采用將萃取廢液直接上聚酰胺樹脂柱吸附洗脫，然后減壓濃縮、干燥的方式制備銀杏總黃酮，實驗結(jié)果顯示最終銀杏總黃酮中溶劑殘留量偏高，總黃酮回收率偏低。推測該方法由于萃取廢液中有機溶劑濃度過高，在聚酰胺樹脂上會與銀杏總黃酮產(chǎn)生競爭吸附，最終導致上樣過程中部分被有機溶劑洗脫，銀杏總黃酮收率偏低，而溶劑殘留量偏高?？傸S酮重量、總黃酮含量、總黃酮回收率、乙酸乙酯和正丁醇殘留量的數(shù)據(jù)見表1。
在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，通過控制萃取廢液的稀釋倍數(shù)與除雜體積，可改變成品的總黃酮含量和溶劑殘留量兩個關(guān)鍵指標。
首先，萃取廢液稀釋倍數(shù)對上樣吸附過程、總黃酮的含量和溶劑殘留有很大影響，過高或過低都會導致最終制備的銀杏總黃酮達不到上述技術(shù)指標，稀釋倍數(shù)過大，溶液中銀杏總黃酮濃度過低，過柱后聚酰胺不能最大程度吸附銀杏總黃酮成分，導致收率降低，相應(yīng)其它無效成分含量增加，實驗過程工時延長，不利于操作；稀釋倍數(shù)過小，溶液中有機溶劑濃度偏高，同上所述，會與銀杏總黃酮成分產(chǎn)生競爭吸附，最終導致制備出的銀杏總黃酮收率降低，而有機溶劑殘留量偏高。因此，通過實驗設(shè)計本發(fā)明萃取廢液最佳稀釋倍數(shù)為30-40倍萃取廢液體積(V/V)。
其次，除雜體積對過柱和總黃酮的含量和溶劑殘留也有很大影響，除雜體積過大，影響總黃酮損失嚴重，低極性黃酮類成分會被洗脫，從而損失部分銀杏總黃酮類成分；除雜體積過小，未能完全除掉聚酰胺樹脂吸附的有機溶劑，最終導致制備出的銀杏總黃酮中有機溶劑殘留量過高，因此，通過實驗得出最佳除雜體積為2-4BV。
以下通過實驗數(shù)據(jù)進行具體說明。
表1：不同制備方式對于最終銀杏總黃酮各項指標的影響
注：均量取100ml萃取廢液進行試驗，下同。
綜上所述，最佳工藝為：萃取廢液稀釋后通過聚酰胺樹脂富集洗脫。
二、最佳工藝中的關(guān)鍵參數(shù)進行研究設(shè)計。
表2：單因素萃取廢液稀釋倍數(shù)對于銀杏總黃酮各指標的影響
由表中數(shù)據(jù)可得出，當萃取廢液稀釋體積在30-40倍(V/V)時，銀杏總黃酮各項指標均符合要求，其中萃取廢液稀釋體積優(yōu)選40倍(V/V)。
表3：單因素除雜體積對于銀杏總黃酮各指標的影響
由表中數(shù)據(jù)可得出，當除雜體積在2-4BV時，銀杏總黃酮各項指標均符合要求，優(yōu)選3BV。