專利名稱：：蜂膠中阿魏酸含量的測定方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及的是一種蜂膠中阿魏酸含量的測定方法，屬于食品安全生物檢測技術。
背景技術：
：蜂膠(propolis)是蜜蜂從膠原植物的枝條和腋芽處釆集的樹脂類物質，加入其自身的上顎腺分泌物與蠟腺分泌物以及少量花粉，通過復雜的生物化學反應，經(jīng)過蜜蜂咀嚼加工而成的一種芳香性不透明的膠狀物質。蜂膠含有許多種對健康有益的生物活性因子以及一些具備藥理活性的物質，在醫(yī)療保健領域用途廣泛，因其多種功效，且是珍稀的天然資源。阿魏酸(femlicacid)是蜂膠中最主要的一種有機酸，也是植物界中廣泛存在的一種酚酸，普遍存在于川穹、當歸、阿魏、木賊、升麻、樟白皮和酸棗仁等中藥材中，是這些中藥的重要成份之一。阿魏酸在醫(yī)藥，食品，化妝品等領域有著日益廣泛的用途。在臨床上用于冠心病，腦血管病，脈管炎，白細胞和血小板減少等疾病的治療；在化妝品中則主要作為抗氧化劑使用，具有吸收紫外線和防止氧化的作用。蜂膠組分十分復雜，文獻報道的蜂膠中阿魏酸的測定方法，主要采用高效液相色譜方法，偶有人用毛細管電泳方法來測定。大多數(shù)對阿魏酸檢測分析研究，通常與其他黃酮類或酚酸類物質一同進行，少見對蜂膠中阿魏酸單個指標的分析研究。波蘭學者JanKrzek等用液相梯度洗脫方法結合RP18固相萃取柱前處理的方法對蜂膠中阿魏酸等三個有機酸同時進行了測定，阿魏酸回收率達到99.42%，相對標準偏差控制在3%以內(nèi)。IvonaJasprica等用液相色譜在270rai檢測波長下實現(xiàn)了同時對包括阿魏酸在內(nèi)的十四種酚酸及黃酮類化合物的含量測定，阿魏酸測定結果的相對偏差在2%以下。國內(nèi)在中藥材中阿魏酸檢測方面的研究較多，如當歸、川穹等等，而蜂膠中阿魏酸的測定尚未深入開展。曹玉華等用毛細管電泳方法同時測定了蜂膠中含阿魏酸在內(nèi)的六種活性物質，該方法線性、重復性及回收率均良好，檢測限可達0.371.8嗎/mL。于世鋒等用液相色譜結合二極管陣列檢測器成功測定了蜂膠中阿魏酸等四種有機酸含量，阿魏酸回收率93.5%，線性范圍在0.050.36嗎，相關系數(shù)0.9990。于敏等用高效液相色譜法建立了蜂膠總黃酮樣品中阿魏酸的含量測定方法，方法的平均回收率為97.9%，阿魏酸線性范圍在0.0540.420嗎，相關系數(shù)0.9995。農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品檢測測試中心的趙靜曾用高效液相色譜法對蜂膠中阿魏酸含量的測定做過一些探索，由于種種原因，實驗未能得到系統(tǒng)完4善的研究結果，最近趙靜等人開發(fā)了一個超高效液相色譜技術同時測定蜂膠中阿魏酸等十二種活性物質的方法，該方法以AcquityBEHC18柱為分離柱，0.4%磷酸水溶液和甲醇為流動相，梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器檢測，整個分離過程在9.5min內(nèi)完成，阿魏酸回收率在98.499.8%，最小檢測限可達O.154mg/L。中國農(nóng)業(yè)部出版的《蜂產(chǎn)品檢測實用技術》也收錄了高效液相色譜測定蜂膠阿魏酸的方法，該法以甲醇/水(45:55)為流動相，用C18柱在340nm處測定，但此方法經(jīng)多個實驗室驗證，重現(xiàn)性存在問題，難以推廣實施?？傊瑢Τ煞輼O其復雜的蜂膠樣品，其阿魏酸的定量檢測至今尚無成熟和適用性良好的液相色譜檢測技術。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述存在的不足，而提供一種專屬性強、靈敏度高的液相色譜法，對蜂膠中阿魏酸進行含量測定，并根據(jù)標準品和樣品的液相色譜圖譜以外標法判定蜂膠中阿魏酸含量的蜂膠中阿魏酸的測定方法。本發(fā)明蜂膠中阿魏酸含量測定方法包括以下步驟步驟1.標準品溶液的制備稱取一定量阿魏酸的標準物質，溶于特定比例的溶液中制得；步驟2.供試品溶液的制備供檢測用的蜂膠經(jīng)冷凍、粉碎、稱量、超聲波強制溶解、離心和微孔濾膜過濾等制得；步驟3.液相色譜分析進樣，在C18色譜柱上進行梯度洗脫；步驟4.計算蜂膠供試品中阿魏酸的含量。步驟l中標準品溶液的制備，具體操作步驟如下準確稱取10.Omg阿魏酸標準物質于50ml棕色容量瓶中，加70%甲醇使其溶解并定容至刻度，混勻，作為標準品溶液。步驟2中供試品溶液的制備，具體操作步驟如下將試樣置冰柜中于-l(TC以下冷凍，取試樣20g30g，迅速用勻漿儀打碎，稱取試樣約0.5g(精確到0.lmg)，置于50mL棕色容量瓶中，加入35mL甲醇，超聲15min，加入10mL水，搖勻，冷卻到室溫后，用水定容至刻度，混勻；以4500rpm的轉速離心20min，上清液用0.45nm聚偏氟乙烯微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。步驟3中液相色譜分析，具體操作步驟如下5(a)色譜條件色譜柱C18色譜柱，5pm，4.6mmX200mm流動相以0.085%磷酸溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，以乙腈為流動相C，按表1進行梯度洗脫；表1阿魏酸液相色譜梯度洗脫方法時間(min)流速(mL/min)0.085%磷酸溶液甲醇乙腈A(%)B(%)c(%)0201.08301720211.0—1.583—00—10017—021361.50100036371.50—83100—00—1737521.583017進樣量20pL檢測波長316nm柱溫30°C(b)測定依次吸取標準品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。對同一試樣進行平行試驗測定。步驟4中計算蜂膠供試品中阿魏酸的含量，是按公式(l)以外標法計算供試品中阿魏酸的百分含量。X:供試品中阿魏酸的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)，A樣:供試品的色譜峰面積，C標:標準品溶液中阿魏酸的濃度，單位為微克每毫升(Pg/mL)，A標:標準品溶液的色譜峰面積，m~~試樣的質量，單位為克(g)。50——試樣定容體積(mL)。根據(jù)含量檢測的要求，以上供試品溶液制備方法及色譜條件是經(jīng)過大量試驗篩選得到的，具體試驗篩選情況如下1檢測波長的確定取阿魏酸標準物質溶液，在200400nm進行掃描，在316nm處有最大吸收，故選擇316nm作為檢測波長。2色譜條件色譜柱C18色譜柱，5nm，4.6mmX250mm6流動相見表1阿魏酸液相色譜梯度洗脫方法；波長316nm;3阿魏酸標準儲備溶液制備精密稱取阿魏酸標準物質10mg(精確到0.01mg)，置50ml棕色量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；即得(每lml含阿魏酸200嗎)。此溶液可在溫度低于4'C冰箱中冷藏保存兩個月。4阿魏酸標準工作溶液分別吸取適量的阿魏酸標準儲備溶液至100mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，配成0.10Hg/ml，0.20Mg/ml，1.OPg/ml，2.OPg/ml，4.OPg/ml，6.0|ig/ml，10Pg/ml，標準工作溶液。當天新鮮配制。5線性關系考察表2含量測定線性關系試驗結果(n:7)濃度(Ug/mL)2.05.010,020.040.080.0160.0峰面積1193342718405427931059571214452743881008443418線性方程y=52976x+25179R2=0.99966精密度試驗精密吸取阿魏酸標準物質溶液，重復進樣5次，每次20^11測定,RSD:1.8%(n=5)表3精密度試驗結果次數(shù)12345109281峰面積1073366108591610753691042491RSD:1.8%n:57穩(wěn)定性試驗；精密吸取同一供試品溶液，每隔2小時測定一次，共測定6小時，RSD為2.0°/o(n=4)表4穩(wěn)定性試驗結果時間(小時)02461522峰面積159676715785431555994918RSD:2.0%n:4一樣品6份，按供試品溶液制備的方法操作，進樣20|il測定，測定峰面積，計算含量，RSD為4.75%(n=6)表5重現(xiàn)性試驗結果編號123456含量0.04090.04290.03900.04000.04000.0372RSD:4.75%n:69加樣回收試驗9.1加樣回收率試驗1:精密稱取用該法測定的已知含量為0.270%蜂膠6份，分別精密加入對照品一定量(實際樣品檢測量的0.4倍、0.5倍、0.6倍)，按供試品溶液制備方法操作，其平均回收率為99.4%RSD為1.8%(n=6)。表6含量測定回收率試驗結果(n:6)阿魏酸加入量(mg)測得量(mg)回收率(％)平均回收率(%)RSD(%)0.520.51498.70.520.50997.90.700.708101.299.41.80.700.69198.70.880綴102.50.880.87399.29.2加樣回收試驗2:精密稱取用該法測定的己知含量為0.200%蜂膠6份，分別精密加入對照品一定量(實際樣品檢測量的0.5倍、2倍、5倍)，按供試品溶液制備方法操作，其平均回收率為99.7°/。RSD為1.2Q/。(n=6)。表7含量測定回收率試驗結果(n:6)平均回收率阿魏酸加入量(mg)測得量(mg)回收率(％)RSD(%)(%)0.610.60398.899.71.20.590.58198.582.712.7091002.652.671畫.85.295.2298.75.245.31101.310樣品提取試驗分別釆用以下的提取方法，按前述液相色譜分析方法進行測定，(1)稱取0.5g樣品置索氏提取器中，用100ml乙醇回流提取到無色，蒸干，用甲醇溶解。阿魏酸含量測定結果為1010mg/kg。(2)稱取0.5g樣品置索氏提取器中，用100ml丙酮回流提取到無色，蒸干，用甲醇溶解。阿魏酸含量測定結果為1000mg/kg。(3)稱取0.5g樣品置索氏提取器中，用100ml乙酸乙酯回流提取到無色，蒸干，用甲醇溶解。阿魏酸含量測定結果為1300mg/kg。(4)用本發(fā)明中供試品溶液制備的方法處理蜂膠樣品。阿魏酸含量測定結果為1870mg/kg。用本發(fā)明中供試品溶液制備的方法測定蜂膠中阿魏酸含量的結果為1870mg/kg。該方法在四種樣品前處理方法中峰面積最大，同時回收率也達到99%以上，故提取方法定為本發(fā)明的方法取經(jīng)冷凍的蜂膠樣品，用YJA-電動勻漿儀打碎，稱取試樣約0.5g，置于50ml棕色容量瓶中，加入35ml甲醇，超聲15min，加入10ml水，搖勻，冷卻到室溫后，用水定容，搖勻。將樣品放入離心機中，以4500轉/min的轉速離心20min。將上清液用0.45pm濾膜過濾，濾液待用，即得。本發(fā)明是以蜂膠為測試樣品開發(fā)的阿魏酸液相色譜檢測方法，具有以下特點-(1)蜂膠的成份很復雜，其阿魏酸含量不僅低，而且難于分離。常規(guī)化學分析方法檢測蜂膠中的阿魏酸很難獲得良好的專屬性和靈敏度，本發(fā)明使用液相色譜方法解決了這一問題。(2)蜂膠是一種常溫下粘性較強的物質，本身內(nèi)質的均一性不夠理想，為使檢測樣品更有代表性，本發(fā)明采用低溫冷凍的方法處理蜂膠原料，使之脆性良好，在此基礎上取20g30g進行低溫粉碎以獲得更為均勻的樣品，使受檢樣品的代表性更佳，檢測數(shù)據(jù)更為準確和穩(wěn)定。(3)蜂膠中成份復雜，某些組分在色譜柱上保留能力很強，等度洗脫色譜不能有效洗脫這些強保留組分，對后續(xù)的色譜有強大干擾，因此不能連續(xù)進行色譜。本發(fā)明采用梯度洗脫方法，確保每次色譜完成后都能洗脫強保留組分，使連續(xù)色譜能夠進行。(4)本發(fā)明在C18分析柱和紫外檢測器的硬件基礎上建立蜂膠阿魏酸的液相色譜檢測方法，當前液相色譜儀在國內(nèi)已廣泛使用，C18分析柱和紫外檢測器都是最普遍使用的設備，因此本發(fā)明提供的方法具有良好的應用推廣價值，實用性強。通過試驗研究表明，采用本發(fā)明的分析方法，可以很好地對蜂膠中阿魏酸的含量進行測定，其精密度、準確度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和線性范圍等指標均符合有關標準規(guī)定的要求，充分說明本發(fā)明的分析方法具有科學意義和應用價值。圖1是本發(fā)明所述的阿魏酸標準物質紫外光譜掃描圖譜；圖2是本發(fā)明所述的阿魏酸標準物質色譜圖；圖3是本發(fā)明所述的含有阿魏酸的蜂膠樣品色譜圖；具體實施例方式下面將結合具體實施例對本發(fā)明作詳細的介紹實施例選取不同產(chǎn)地的蜂膠原料10份，按本發(fā)明提供的方法測定蜂膠中阿魏酸的含量。具體實施如下1、試劑和材料除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純；水為:GB/T6682規(guī)定的一級水(水為蒸餾水或同等純度水)；未指明用何種溶劑配制時，均指水溶液。1.1甲醇；色譜純。1.20.085X(v/v)磷酸溶液:量取0.85ml磷酸，加水1000ml溶解，經(jīng)0.45,過濾。1.3乙腈色譜純。1.4阿魏酸標準物質購自中國藥品生物制品檢定所，批號為110773-200611，純度》99%。1.5阿魏酸標準品溶液制備準確稱取10.Omg阿魏酸標準物質于50ml棕色容量瓶中，加70%甲醇使其溶解并定容至刻度，混勻，作為標準品溶液，此溶液可在溫度低于4'C冰箱中冷藏保存兩個月。2、儀器與設備2.1液相色譜儀Agilent100Series(安捷倫液相色譜儀，配有紫外檢測器)2.2分析天平分度值0.lmg/O.Olmg。2.3過濾膜0.45)am聚偏氟乙烯微孔濾膜。2.4超聲儀(頻率為25KHZ，功率為50W)。2.5離心機。2.6YJA-電動勻漿儀。3、測定步驟3.1試樣處理將試樣于10。C以下用勻漿儀打碎，稱取試樣約0.5g(精確到O.lmg)，置于50ml棕色容量瓶中，加入35ml甲醇，超聲15min(頻率為25KHZ，功率為50W)，加入10ml水，搖勻，冷卻到室溫后，用水定容至刻度，混勻。將樣品放入離心機中，以4500rpm的轉速離心20min。將澄清液用0.45i^ii濾膜過濾，濾液用于液相色譜測定。3.2色譜側定3.2.1液相色譜條件a)色譜柱Hypersil0DS25pm4.6腿X200mra，b)流動相乙腈-0.085%磷酸溶液(V/V=17:83);C)進樣量20|_d;d)檢測波長316nm;e)柱溫30。C;3.2.2液相色譜測定分別精密吸取對阿魏酸標準工作溶液和供試品溶液各20)al，注入液相色譜儀，采用表8所示梯度洗脫方法分析測定。表8檢測蜂膠中阿魏酸的液相色譜梯度洗脫方法<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.3平行試驗按上述步驟，對同一試樣進行平行試驗測定。4、結果計算按公式(1)計算蜂膠樣品中阿魏酸含量。xC好x50X=^——^-..........................................(1)X:供試品中阿魏酸的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)，A樣:供試品的色譜峰面積，C標:標準品溶液中阿魏酸的濃度，單位為微克每毫升Oig/mL)，A標:標準品溶液的色譜峰面積，m——試樣的質量，單位為克(g)。50——試樣定容體積(mL)。按上述方法測得10批不同產(chǎn)地的蜂膠中阿魏酸含量的數(shù)據(jù)見表9:表9IO批不同產(chǎn)地的蜂膠阿魏酸含量表序號蜂膠采集點阿魏酸的含量(mg/kg)1吉林長白山18702遼寧大石橋5603河北方城11804河北永清1405河南南陽10706江蘇建湖3407安徽蒙城27108安徽壽縣8609浙江仙居89010貴州水城1280本發(fā)明提供了一種測定蜂膠中阿魏酸的液相色譜檢測方法，該方法是通過大量試驗所得到的切實可行的方法，具有良好的重現(xiàn)性，有專屬性強、靈敏度高、推廣便利等優(yōu)點。對于本領域技術人員而言，根據(jù)本發(fā)明公開的技術內(nèi)容，本領域技術人員將很清楚本發(fā)明的其他實施方案。在不違背本發(fā)明主旨及范圍的情況下，本領域技術人員可以對本發(fā)明進行各種改變或改進。例如，使用不同的梯度洗脫程序或不同長度的C18色譜柱，可能獲得同樣的檢測結果。圖1中12峰值檢兩吸收但提述131S.400.421O386.80一O.003;3■■■■■■■■■■■■■■■258.■300.104圖2中橫坐標為時間(min),縱坐標為電壓(nw)，各色譜峰上標示的數(shù)字是該色譜峰的保留時間。本圖譜中保留時間13.998min所指示的色譜峰為阿魏酸色譜峰。圖3中橫坐標為時間(min),縱坐標為電壓(mv)，各色譜峰上標示的數(shù)字是該色譜峰的保留時間。本圖譜中保留時間13.657min所指示的色譜峰為阿魏酸色譜峰。1權利要求1、一種蜂膠中阿魏酸含量的測定方法，它采用高效液相色譜法中的紫外檢測法對蜂膠原料中的阿魏酸進行定性定量檢測分析，其特征在于該測定方法包括以下步驟步驟1.阿魏酸標準品溶液的制備稱取一定量阿魏酸的標準物質，溶于特定比例的溶液中制得；步驟2.蜂膠檢測樣品溶液的制備供檢測用的蜂膠經(jīng)冷凍、粉碎、稱量、超聲波強制溶解、離心和微孔濾膜過濾等制得；步驟3.液相色譜分析進樣，在C18色譜柱上進行梯度洗脫；步驟4.計算供檢測蜂膠樣品中阿魏酸的含量。2、根據(jù)權利要求1所述的蜂膠中阿魏酸含量的測定方法，其特征在于，步驟1中標準品溶液的制備，具體操作步驟如下準確稱取10.0mg阿魏酸標準物質于50ml容量瓶中，加70%甲醇使其溶解并定容至刻度，混勻，作為標準品溶液；步驟2中蜂膠檢測樣品溶液的制備，具體操作步驟如下將蜂膠試樣置冰柜中于-l(TC以下冷凍，取試樣20g30g，迅速用勻漿儀打碎，稱取試樣約0.5g，并精確到0.1mg，置于50mL棕色容量瓶中，加入35mL甲醇，超聲15min，加入10mL水，搖勻，冷卻到室溫后，用水定容至刻度，混勻；以4500rpm的轉速離心20min，上清液用0.45pm聚偏氟乙烯微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液；步驟1和步驟2之后進行步驟3液相色譜分析。3、根據(jù)權利要求1或2所述的蜂膠中阿魏酸含量的測定方法，其特征在于所述步驟3中的液相色譜分析，具體操作步驟如下(a)色譜條件色譜柱C18色譜柱，5pm，4.6mmX200mm;流動相以0.085%磷酸溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，以乙腈為流動相C，按如下表所示方法進行梯度洗:<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>37521.583017進樣量20pL;檢測波長316nm;柱溫30°C;(b)測定依次吸取標準品溶液和蜂膠檢測樣品溶液，注入液相色譜儀，進行測定，記錄色譜圖。4、根據(jù)權利要求1所述的蜂膠中阿魏酸含量的測定方法，其特征在于所述的溶液中阿魏酸的含量計算，是以外標法按如下(l)式計算供試品中阿魏酸的含量，即進行步驟4;式中-X:供試品中阿魏酸的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)，A樣:供試品的阿魏酸色譜峰面積，C標:標準品溶液中阿魏酸的濃度，單位為微克每毫升(M/mL)，A標:,標準品溶液的阿魏酸色譜峰面積，m——試樣的質量，單位為克(g)。50——試樣定容體積(mL)。全文摘要一種蜂膠中阿魏酸含量的測定方法，該方法對預先冷凍的蜂膠進行粉碎，用甲醇提取粉末中的阿魏酸，提取液通過液相色譜梯度洗脫方法在C18色譜柱上實現(xiàn)了對蜂膠樣品中阿魏酸的有效分離，在316nm檢測波長下以外標法對阿魏酸進行含量測定。本發(fā)明包括以下步驟步驟1.阿魏酸標準品溶液的制備；步驟2.蜂膠檢測樣品溶液的制備；步驟3.液相色譜分析；步驟4.外標法計算樣品中阿魏酸含量。該方法的樣品預處理措施，可提高檢測結果的準確性和穩(wěn)定性。另外，該方法的色譜分析采用了梯度洗脫，克服了蜂膠中強保留組分對連續(xù)進行色譜的干擾。文檔編號G01N30/00GK101493445SQ20091011805公開日2009年7月29日申請日期2009年2月17日優(yōu)先權日2009年2月17日發(fā)明者徐承智,朱金梁,胡曉嵐,虞英民申請人:杭州保靈集團有限公司