專利名稱：：高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇定量法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的改良的測定方法及相關(guān)試劑盒。
背景技術(shù)：
：血漿中膽固醇的存在和運(yùn)輸形式為血漿脂蛋白，即血漿中非極性的脂類包括膽固醇和親水性的載脂蛋白結(jié)合，使得脂蛋白有較強(qiáng)的水溶性可以在血中運(yùn)輸。血漿脂蛋白可以分為高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜顆粒四種，其中低密度脂蛋白主要負(fù)責(zé)將膽固醇運(yùn)輸至外周組織，而高密度脂蛋白是清除動(dòng)脈壁上的膽固醇向肝臟運(yùn)輸。流行病學(xué)和臨床研究表明，低密度脂蛋白膽固醇水平與動(dòng)脈硬化類疾病冠心病的發(fā)生率成正相關(guān)，高密度脂蛋白膽固醇與動(dòng)脈硬化類疾病冠心病的發(fā)生率成負(fù)相關(guān)，即具有抗動(dòng)脈硬化活性。因此高密度脂蛋白膽固醇HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C是當(dāng)前臨床實(shí)驗(yàn)室血脂測定中最有價(jià)值的心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素指標(biāo)。測定高低密度脂蛋白膽固醇的方法很多，包括超離心法、色譜法、電泳法和沉淀法等。超離心法可作為基本的定量法使用，它使用超速離心機(jī)進(jìn)行分離，根據(jù)比重的差別分離LDL或HDL，進(jìn)而測定其中的膽固醇含量；而后來發(fā)展的電泳法以醋酸纖維膜或瓊脂糖凝膠等做載體分離，然后根據(jù)酶法測定膽固醇含量；在沉淀法中，沉淀劑凝結(jié)除高密度脂蛋白以外的脂蛋白，凝結(jié)的脂蛋白通過離心分離沉淀，根據(jù)酶反應(yīng)測定上清即高密度脂蛋白膽固醇的含量；測定低密度脂蛋白膽固醇的第一代化學(xué)沉淀法，采用PVS和PEGME沉淀LDL，用離心分離法收集沉淀物，然后根據(jù)酶反應(yīng)測定其中的膽固醇含量；以上方法均需要特殊儀器，包括超速離心機(jī)、電泳儀和離心機(jī)等，操作復(fù)雜，難于自動(dòng)化，從而無法在臨床實(shí)驗(yàn)室開展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所涉及的直接測定高密度脂蛋白膽固醇的方法，是用優(yōu)化的聚乙烯硫酸三鉀PVS化學(xué)沉淀法聯(lián)合對(duì)高密度脂蛋白膽固醇反應(yīng)性較好的第一表面活性劑，采用優(yōu)化濃度的聚乙烯硫酸三鉀(PVS)和聚乙二醇獨(dú)甲醚(PEGME)聯(lián)合其他化合物將HDL以外的脂蛋白膽固醇包裹不溶于水但又不至于沉淀，在對(duì)高密度脂蛋白膽固醇反應(yīng)性較好的第一表面活性劑的作用下溶解高密度脂蛋白膽固醇利用酶反應(yīng)測定其中膽固醇的含量。本方法所涉及的直接定量低密度脂蛋白膽固醇的方法，采用優(yōu)化的PVS沉淀法，僅包裹LDL使其無法參與酶反應(yīng)，但不會(huì)沉淀LDL即形成不溶物，然后LDL中的膽固醇成分在第一和第二表面活性劑的聯(lián)合作用下直接測量；詳細(xì)而言，即高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的膽固醇在對(duì)低密度脂蛋白以外的脂蛋白膽固醇反應(yīng)性較好的第一表面活性劑的作用下參與膽固醇脂酶反應(yīng)，低密度脂蛋白膽固醇在第二表面活性劑的作用下溶解釋放以進(jìn)行酶反應(yīng)法測定其膽固醇含量。酶反應(yīng)中第一步產(chǎn)生的過氧化氫不必使用過氧化物酶去除，所以在第二步中不必加入抑制過氧化物酶活性的疊氮鈉。本發(fā)明中可以使用生物防腐劑。本發(fā)明的方法中均無需標(biāo)本前處理即沉淀和離心，可以直接在自動(dòng)生化儀測定標(biāo)本中的高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇。本發(fā)明所用的優(yōu)化的聚乙烯硫酸三鉀PVS化學(xué)沉淀法即優(yōu)化濃度和比例的PVS和PEGME，在檢測高密度脂蛋白膽固醇時(shí)，其優(yōu)化后的PVS:PEGME比例為1:500-550，濃度分別為10-20mg/L和5g-llg/L;同時(shí)可以聯(lián)合特殊的化合物將LDL、VLDL和CM包裹不溶于水但又不至于沉淀，所用的化合物為對(duì)低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和乳靡顆粒親和性較好的化合物，包括聚陰離子、環(huán)糊精硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽和皂苷類化合物等，這些物質(zhì)的使用量不受特別限制，根據(jù)物質(zhì)種類及組合方式而不同，盡量選用凝結(jié)或混濁少的組合；為進(jìn)一步提高特異性，還可以同時(shí)添加二價(jià)的金屬離子鹽，包括0.1mM-20mM的鎂鹽、鈣鹽等，優(yōu)先選用鎂鹽。直接測定低密度脂蛋白膽固醇時(shí)，采用優(yōu)化濃度和比例的PVS和PEGME包裹LDL，優(yōu)化后的比例為1:400-500，濃度分別為l-20mg/L和4g-10g/L;同時(shí)為了避免VLDL的共同被包裹，采用能掩蔽二價(jià)陽離子的金屬螯合劑包括EDTA或EGTA等，其使用濃度為0.1mM-2mM;其他只要是和低密度脂蛋白親和性較強(qiáng)的化合物，可以是促使其凝聚的聚陰離子、肝素鈉、磷鎢酸、環(huán)糊精硫酸鹽等，或?qū)ζ溆休^強(qiáng)親和力又不導(dǎo)致沉淀產(chǎn)生的皂苷類化合物也可以使用，它們可以單獨(dú)使用或兩種或以上組合使用，這些物質(zhì)的使用量不受特別限制，根據(jù)物質(zhì)種類及組合方式而不同，盡量選用凝結(jié)或混濁少的組合；同時(shí)為了生化儀的維護(hù)要求，盡量不使用或使用低濃度的鎂離子。對(duì)于第一表面活性劑的選用，可以是離子或非離子的選擇性表面活性劑，可以是對(duì)高密度脂蛋白有較好反應(yīng)性的表面活性劑或?qū)Φ兔芏戎鞍滓酝獾闹鞍子休^好反應(yīng)性的表面活性劑，如聚氧乙烯類衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合物，包括聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽等。對(duì)于第二表面活性劑的選用，其是可以與所有脂蛋白反應(yīng)或至少可以與低密度脂蛋白反應(yīng)的表面活性齊(J，如L121，或TritonXI00、Tween20、lipominLA、Anhitol24B和膽酸等。作為這些表面活性劑的商業(yè)上可得到的產(chǎn)品實(shí)例，包括Emulgen系列如Emulgen108、Emulgen220、Emulgen913、Emulgen709、EmulgenB66、EmulgenA60(或A6系列)、EmulgenA90(或A9系列)、Emulgen911、EmulgenL-40等，和pluronic系歹廿如PluronicF88、PluronicF68、PluronicL121、PluronicL123、PluronicLlOl、PluronicL108等禾口TritonX100等。這些表面活性劑可以單獨(dú)使用或者兩種或以上組合使用。這些表面活性劑的用量沒有特別限制，一般來說，表面活性劑的濃度優(yōu)選為0.01X—3Xw/v之間。特別優(yōu)選的濃度為0.05%-l%w/v。膽固醇反應(yīng)應(yīng)用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶進(jìn)行，生成的過氧化氫在過氧化物酶作用下用4-氨基安替比林和高敏感度色原進(jìn)行吸光度分析測定，并計(jì)算出高密度脂蛋白膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇的含量。作為商業(yè)上可得到的色原包括日本同仁化學(xué)的N-乙基-N-(2-羥基陽3畫磺丙基)-間苯甲胺(TOOS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-琥珀?；叶?EMSE)等。作為這些色原的濃度，優(yōu)選0.1mM-10mM。用于高密度脂蛋白膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇定量的試劑，除含有以上所屬化合物、表面活性劑、酶及色原等外，其所采用的緩沖液為Goods緩沖液，例如有HEPES、MES、MOPS禾卩PIPES等。緩沖液的pH為5-10，優(yōu)選為6-8。緩沖液的濃度為5-200mM,優(yōu)選為20mM-100mM。圖1顯示采用本發(fā)明的檢測高密度脂蛋白膽固醇的試劑盒1檢測結(jié)果與對(duì)照試劑的檢測結(jié)果具有相關(guān)性；圖2顯示采用本發(fā)明的檢測高密度脂蛋白膽固醇的試劑盒2檢測結(jié)果與對(duì)照試劑的檢測結(jié)果具有相關(guān)性；圖3顯示采用本發(fā)明的檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒1檢測結(jié)果與對(duì)照試劑的檢測結(jié)果具有相關(guān)性；圖4顯示采用本發(fā)明的檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒2檢測結(jié)果與對(duì)照試劑的檢測結(jié)果具有相關(guān)性；具體實(shí)施例方式實(shí)施例1用于檢測高密度脂蛋白膽固醇的試劑盒1的成分和使用方法1.試劑成分本申請(qǐng)的檢測高密度脂蛋白膽固醇的試劑盒1包括兩種成分，分別是試劑lMOPS(pH7.0)20mMPVS20mg/LPEGME10g/La-環(huán)糊精硫酸鹽2mMMgS045mM4AA0.5g/LPC3000.5g/L試劑2MOPS(pH7.0)20mM膽固醇酯酶4KU/L膽固醇氧化酶10KU/L過氧化物酶30KU/LMgS045mMHDAOS2mMEmulgenA6系列0.1%w/vPC3000.5g/L2.試劑盒1的使用方法-使用OlympusAU400自動(dòng)分析儀分別進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)操作如下血清3ul，第一試劑225ul，37。C反應(yīng)5分鐘，第二試劑75ul反應(yīng)5分鐘，測定主波長600nm，副波長700nm，用吸光度差進(jìn)行計(jì)算。對(duì)照試劑按照其說明書所述參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。方法對(duì)比中，本試劑和對(duì)比試劑(日本協(xié)和KyowaMedexCo.,下同)分別用各自的校準(zhǔn)血清進(jìn)行定標(biāo)。同時(shí)測定了40例臨床標(biāo)本HDL-C含量，結(jié)果如表l、圖1所示，顯示按本發(fā)明方法獲的結(jié)果與對(duì)照試劑獲得的結(jié)果有良好的相關(guān)性。1病人血對(duì)照自配病人血對(duì)照自配清編號(hào)試劑試劑清編號(hào)試劑試劑12.522.53211.271.1921.531.48221.661.6231.241.28231.321.2941.161.17241.491.4651.351.3251.31.3361.41.35261.31.2771.931.94272.031.9981.511.48281.411.3891.341.29292.041.99101.321.28301.391.36111.41.4311.311.31121.231.22321.751.67131.51.48331,751.73141.411.4341.781.75151.561.53351.171.18161.691.62361.411.41171.121.14371.341.35181.811.75381.731.66191.891.82391.921.86201.471.4401.211.18實(shí)施例2用于檢測高密度脂蛋白膽固醇的試劑盒2的成分和使用方法1.試劑成分本申請(qǐng)的檢測高密度脂蛋白膽固醇的試劑盒2包括兩種成分，分別是試劑lHEPES-NaOH(pH7.0)20mMPVS20mg/LPEGME10g/L硫酸葡聚糖lmg/LMgS042mM4AA0.5g/LPC3000.5g/L試劑2HEPES-NaOH(pH7.0)20mM膽固醇酯酶4KU/L膽固醇氧化酶10KU/L過氧化物酶30KU/LMgS045mM10HDAOSEmulgenA9系歹!jPC3002mM0.1%w/v0.5g/L2.試劑盒2的使用方法具體實(shí)驗(yàn)操作及儀器同上所述。同時(shí)測定了40例臨床標(biāo)本HDL-C含量，結(jié)果如表2、圖2所示。結(jié)果顯示出試劑盒2按本發(fā)明方法獲的結(jié)果與對(duì)照試劑獲得的結(jié)果有良好的相關(guān)性。211.561.5621.951.9331.941.9141.661.5951.871.7861.021.0471.81.7781.291.2991.81.75101.811.76110.980.97120.980.98131.231.21141.081.09151.621.58161.641.6171.771.75181.791.76191.361.33212.061.96221.831.77231.741.68241.351.28251.841.77261.081.02272.682.58282.051.96291.821.78301.171.12311.461.4321.771.67331.61.55341.141.1351.321.28361.611.54371.781.69381.821.75391.661.58病人血對(duì)照自配病人血清編號(hào)試劑試劑清編號(hào)己w酉齊自試照劑對(duì)試201.351.32401.511.48實(shí)施例3用于檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒1的成分和使用方法1.試劑成分本申請(qǐng)的檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒1包括兩種成分，分別是試劑lMOPS(pH7.0)20mMPVS20mg/LPEGME8g/LEDTA2mM4AA0.5g/L膽固醇酯酶5KU/L膽固醇氧化酶10KU/LEmulgenA6系歹ij0.1%w/vPC3000.5g/L試劑2MOPS(pH7.0)20mM過氧化物酶30KU/LHDAOS2mMTritonX100lg/LPC3000.5g/L2.使用方法具體實(shí)驗(yàn)操作及儀器同實(shí)施例1所述。同時(shí)測定了40例臨床標(biāo)本LDL-C含量，結(jié)果如表3、圖3所示。結(jié)果顯示出檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒1按本發(fā)明方法獲的結(jié)果與對(duì)照試劑獲得的結(jié)果有良好的相關(guān)性。表312.572.51212.532.622.762.74222.772.9132.62.57232.492.6943.373.35243.413.5452.582.6252.662.8562.272.32262.32.4172.782.73272.742.7782.96282.972.7892.993.13293.23.3102.422.4303.023.18112.182.19312.692.86122.872.79323.053.2133.023.11333.163.33142.522.52342.973153.042.97352.92.94162.012.063611.611.72172.322.463710.1310.45182.051.91387.877.93193.933.99395.725.81205.265.15403.493.52實(shí)施例4用于檢測低密度脂蛋白膽固醇的試劑盒2的成分和使用方法按與實(shí)施例3相同的方法測定低密度脂蛋白膽固醇的含量并與對(duì)照試劑做比較，第一試劑中采用0.1%w/vPluronicF88代替EmulgenA6系列，第二試劑中采用0.2%w/vPluronicL121代替TritonXIOO。結(jié)果如表4、圖4所示，顯示出按本發(fā)明方法獲的結(jié)果與對(duì)照試劑獲得的結(jié)果有良好的相關(guān)性。病人血清編號(hào)自配病人血對(duì)照自配試劑清編號(hào)試劑試劑照劑對(duì)試13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1、一種測定樣品中高密度脂蛋白膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇的含量的方法，其步驟為1)用優(yōu)化濃度和比例的聚乙烯硫酸三鉀和聚乙二醇獨(dú)甲醚與所述的樣品接觸；2)在不形成沉淀的條件下聯(lián)合至少一種表面活性劑通過酶法測定所述樣品中高密度脂蛋白膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇的含量。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在測定高密度脂蛋白膽固醇含量時(shí)，所述的聚乙烯硫酸三鉀和聚乙二醇獨(dú)甲醚的優(yōu)化比例為l:500-550，所述的優(yōu)化濃度分別為10-20mg/L和5g-llg/L。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的至少一種表面活性劑選自聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六垸基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中進(jìn)一步加入一種或更多選自下述的物質(zhì)聚陰離子、環(huán)糊精硫酸鹽、葡聚糖硫酸鹽或皂苷類化合物。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中進(jìn)一步加入濃度為0.1mM-20mM的二價(jià)金屬鹽。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的二價(jià)金屬鹽為鎂鹽或鈣鹽。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在測定低密度脂蛋,白膽固醇含量時(shí)，所述的聚乙烯硫酸三鉀和聚乙二醇獨(dú)甲醚的優(yōu)化比例為l:400-500，所述的優(yōu)化濃度分別為10-20mg/L和4g-10g/L。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的至少一種表面活性劑為第一表面活性劑和第二表面活性劑的組合，所述第一表面活性劑選自聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯垸基苯基醚、聚氧乙烯亞垸基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；所述第二表面活性劑選自TritonXIOO、聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合物PluronicL121、Pl訓(xùn)nicL123、PluronicL101、Pl腸nicL108、Plu腿icF68、Tween20、lipominLA、Anhitol24B或膽酸。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一歩加入0.1mM-2mM的能掩蔽二價(jià)陽離子的金屬螯合劑。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的金屬螯合劑為EDTA或EGTA。11、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，酶反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化氫無需過氧化物酶或過氧化氫酶去除，從而不需要加入疊氮鈉。12、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的第二表面活性劑與脂蛋白反應(yīng)或至少與低密度脂蛋白反應(yīng)。13、用于檢測高密度脂蛋白膽固醇含量的試劑盒，其包括試劑1和試劑2，其中-試劑1包括10-20mg/L聚乙烯硫酸三鉀、5-llg/L聚乙二醇獨(dú)甲醚、1-10mMa-環(huán)糊精硫酸鹽；-試劑2包括l-10KU/L膽固醇酯酶、5-20KU/L膽固醇氧化酶、10-30KU/L過氧化物酶、l-10mMHDAOS、0.1-1%w/v的至少一種選自聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六垸基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯垸基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯垸基醚硫酸鹽的表面活性劑；和-說明書。14、用于檢測低密度脂蛋白膽固醇含量的試劑盒，其包括試劑1和試劑2，其中-試劑1包括10-20mg/L聚乙烯硫酸三鉀、4-10g/L聚乙二醇獨(dú)甲醚、0.1-5mMEDTA、l-10KU/L膽固醇酯酶、5-20KU/L膽固醇氧化酶、,0.1-1%w/v的至少一種選自聚氧乙烯高級(jí)醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基苯基醚、聚氧乙烯亞烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽的第一表面活性劑；-試劑2包括10-30KU/L過氧化物酶、0.1-1°/。w/v的至少一種選自TritonXIOO、聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合物PluronicL121、PluronicLI23、PluronicLI01、PluronicLI08、PluronicF68、Tween20、lipominLA、Anhitol24B或膽酸的第二表面活性劑；和-說明書。全文摘要本發(fā)明公開一種直接測定高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的方法，采用優(yōu)化濃度和比例的聚乙烯硫酸三鉀(polyvinylsulphateK-salt，PVS)和聚乙二醇獨(dú)甲醚(Methoxypolyethyleneglycol，PEGME)，即優(yōu)化的化學(xué)沉淀法，聯(lián)合對(duì)高密度脂蛋白膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇反應(yīng)性較好的表面活性劑進(jìn)行特異性的高密度脂蛋白膽固醇或低密度脂蛋白膽固醇的含量測定。文檔編號(hào)G01N33/92GK101551399SQ20091011783公開日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年3月6日優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日發(fā)明者孫國敬申請(qǐng)人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司