專(zhuān)利名稱(chēng)：高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定血清成分試劑的制備方法及試劑，特別是測(cè)定血清中的高密度脂蛋白中膽固醇試劑的制備方法與試劑，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病的發(fā)生率與血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)呈負(fù)相關(guān)已經(jīng)流行病學(xué)和相關(guān)臨床證實(shí)，檢測(cè)高密度脂蛋白膽固醇還可廣泛應(yīng)用于相關(guān)的臨床診治，并作為脂類(lèi)代謝異常的危險(xiǎn)性指標(biāo)之一。因此高密度脂蛋白膽固醇的準(zhǔn)確測(cè)定至關(guān)重要，特別是在高密度脂蛋白膽固醇下限，極小的誤差可能造成相對(duì)較大的影響，而且高密度脂蛋白膽固醇的結(jié)果直接影響低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的計(jì)算值。目前，對(duì)高密度脂蛋白膽固醇的測(cè)定方法有已知的超速離心法和電泳法以及中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編制的《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版279頁(yè)所推薦的沉淀法。超速離心法是根據(jù)脂蛋白的比重不同，用超速離心器把脂蛋白進(jìn)行分類(lèi)，再對(duì)膽固醇進(jìn)行測(cè)定。該方法過(guò)程分超速離心和膽固醇檢測(cè)兩步，費(fèi)用高、耗時(shí)大。電泳法需要借助一些如瓊脂糖凝膠等做為載體分離，操作極其繁雜。沉淀法是使用多聚陰離子和二價(jià)金屬離子試劑沉淀大顆粒的脂蛋白，然后離心，用其上清液測(cè)定其含量。該方法雖簡(jiǎn)便，但不適用于全自動(dòng)、大批量樣本檢測(cè)，而且對(duì)高甘油三酯血癥患者，會(huì)使高密度脂蛋白膽固醇結(jié)果偏高，當(dāng)高甘油三酯大于5mmol/L時(shí)會(huì)使計(jì)算LDL-C的Friedwald公式受其限制。上述這些已知的方法由于都不能在全自動(dòng)上直接檢測(cè)，近幾年，直接在全自動(dòng)上進(jìn)行檢測(cè)HDL-C試劑也相繼出現(xiàn)，如中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?9116565.9)他們利用聚陰離子復(fù)合物與血清中LDL(低密度脂蛋白)、VLDL(極低密度脂蛋白)、CM(乳糜微粒)反應(yīng)，生成不溶于水的復(fù)合物，而HDL-C仍以溶液狀態(tài)存在，在膽固醇試劑的存在下進(jìn)行其測(cè)定，本方法中添加了膽酸鈉，可能是為了提高專(zhuān)一性。在本發(fā)明中不僅僅HDL起反應(yīng)，LDL、VLDL等也緩慢地起反應(yīng)，所以要想得到完全的HDL的反應(yīng)終點(diǎn)是不可能的。并且特異性也不一定好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種測(cè)定高密度脂蛋白中膽固醇的試劑的制備方法及試劑的改進(jìn)，用該方法所制得的試劑應(yīng)特異性好、檢測(cè)簡(jiǎn)便、測(cè)試準(zhǔn)確率高，并能夠在各種型號(hào)的全自動(dòng)生化分析儀上對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑，包括適量防腐劑、穩(wěn)定劑和色原，該試劑還包括以下成分A、高親合性酶化合物，該酶化合物，由酶和化合物反應(yīng)而得，其中化合物是甾類(lèi)糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種與活化劑混合、活化后的活化物，化合物的濃度為1-50毫克/毫升；酶是1、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10、2、脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10中的任一組與緩沖液混合、溶解后的溶解物，緩沖液的PH值為5-9，緩沖液的摩爾配比是50-200mmol/L，所述的緩沖液是GOOD’S緩沖液或磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液或檸檬酸緩沖液或硼酸鹽緩沖液；上述化合物與酶二種成分反應(yīng)時(shí)的摩爾配合比為1∶1-20∶1；B、表面活性劑，其混合比例與A成分的重量百分比是0.003-30，所述的表面活性劑是陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑和非離子表面活性劑中的一種或任意比例混合的多種。
所述的酶優(yōu)先選擇膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
該試劑還包括適量催化劑。
所述的表面活性劑的混合比例為0.01-10重量百分比。
該試劑中還有適量抗干擾物質(zhì)。
所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑的制備方法包括以下步驟一、化合物活化選擇所述的甾類(lèi)糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種，在水介質(zhì)中用公知的疊氮法或碳化二亞胺法或丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法進(jìn)行活化，活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶10，溫度0-25℃，PH在4-11范圍內(nèi)，時(shí)間0.1-24小時(shí)。
二、酶溶解選擇所述的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶中的任一組，溶解在緩沖液中；三、混合反應(yīng)活化后的化合物與溶解后的酶混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應(yīng)18-24小時(shí)；四、配置反應(yīng)后的酶化合物與表面活性劑混合，并加入防腐劑、穩(wěn)定劑、用于顯色測(cè)定的色原和催化劑。
所述的甾類(lèi)糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素預(yù)先置于以下有機(jī)溶劑混合物中溶解二甲亞砜或甲酰替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲酰替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物；化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
該試劑中還加入抗干擾劑物質(zhì)。
本發(fā)明所提供的高密度脂蛋白中膽固醇測(cè)定試劑的制備方法及試劑，能夠直接在各種型號(hào)的全自動(dòng)生化分析儀上對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇進(jìn)行檢測(cè)，省卻了樣本離心、沉淀等繁雜步驟，大幅度減輕了檢測(cè)工作量、減少了檢測(cè)時(shí)間、降低了檢測(cè)成本；而且試劑的特異性好，檢測(cè)的準(zhǔn)確率較高，與國(guó)家推薦的沉淀法的檢測(cè)效果比較，相關(guān)性達(dá)到0.98以上。


圖1至圖3分別是本發(fā)明的實(shí)施例1至實(shí)施例3的測(cè)得值與沉淀法(《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版279頁(yè)所推薦)的測(cè)得值的相關(guān)性示意圖。
具體實(shí)施例方式
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)用經(jīng)制備的高親合性膽固醇酯酶化合物和高親合性膽固醇氧化酶化合物及對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇具有較強(qiáng)作用的表面活性劑配制的試劑用來(lái)測(cè)定經(jīng)超速離心分離出的HDL、LDL、VLDL及CM各組份脂蛋白時(shí)，上述各組份脂蛋白膽固醇的反應(yīng)性顯示出不同，且不同組份的選擇性和反應(yīng)性為HDL＞LDL＞VLDL＞CM。當(dāng)表面活性劑濃度達(dá)一定時(shí)，LDL、VLDL、CM在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不參加測(cè)定HDL的反應(yīng)。
由此，本發(fā)明提供的試劑及其制備方法是一、選用高親合性酶化合物該酶化合物，由酶和化合物制備而得，其中1、化合物選自甾類(lèi)糖苷，該甾類(lèi)糖苷在其結(jié)構(gòu)中具有作為配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇的甾環(huán)酶，以及具有含3-10個(gè)線(xiàn)狀或分支結(jié)構(gòu)單糖的低聚糖酶?；蛘哌x自三萜烯糖苷，該三萜烯糖苷在其結(jié)構(gòu)中具有α-或β-胡椒烷、羊毛脂甾烷等的配基，以及具有由2-8個(gè)分支或線(xiàn)狀結(jié)構(gòu)基構(gòu)成的低聚糖，或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成復(fù)合物的疏水蛋白質(zhì)，或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)毒素，或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成復(fù)合物的多烯抗菌素。上述化合物可以單獨(dú)使用也可以?xún)煞N或幾種混合使用，沒(méi)有特別的限制，只要制得的酶化合物及對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇具有較強(qiáng)作用的表面活性劑配制的試劑對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇的反應(yīng)比其它脂蛋白膽固醇的反應(yīng)性強(qiáng)。
本發(fā)明中使用的甾類(lèi)糖苷實(shí)例有脫糖毛地黃皂苷、天門(mén)冬苷、龍舌苷、羊毛蠟苷等等。
三萜烯糖苷的實(shí)例有七葉素、茶皂苷等。
疏水蛋白質(zhì)實(shí)例有脂蛋白的脫水蛋白質(zhì)、溶酶體的蛋白質(zhì)等等。
蛋白質(zhì)毒素可由細(xì)菌、海洋微生物等獲得，作為實(shí)例有鏈球菌溶血素O、腦酮溶細(xì)胞素等。
多烯抗菌素實(shí)例有菲律賓菌等。
2、酶選用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶中任意一組。當(dāng)然也可以選用其它的酶，只要制得的高親合性酶化合物及對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇具有較強(qiáng)作用的表面活性劑配成的試劑對(duì)高密度脂蛋白中膽固醇的反應(yīng)比其它脂蛋白膽固醇的反應(yīng)性強(qiáng)。為了提高檢測(cè)的專(zhuān)一性，本發(fā)明中優(yōu)先使用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的來(lái)源不作具體限制。
二、高親合膽固醇酶化合物的制備1、將上述化合物中的一種或幾種混合物在水介質(zhì)中進(jìn)行活化將上述化合物中的一種或幾種混合物在水介質(zhì)中用公知的疊氮法、碳化二亞胺法、丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法進(jìn)行活化，選用的方法最好能夠最大地保持制備的酶化合物的活性?；罨瘲l件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶10，化合物的濃度為1-50毫克/毫升，溫度0-25℃，PH在4-11范圍內(nèi)，時(shí)間0.1-24小時(shí)。眾所周知，其中的活化劑，在疊氮法、碳化二亞胺法、丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法中分別是疊氮化物、對(duì)環(huán)己基-2-(4-嗎啉)乙基-碳化二亞胺-甲基-對(duì)甲苯磺酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺以及高碘酸鈉。上面所描述的某些化合物，如甾類(lèi)糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素較難溶于水，為使它們完全溶解可預(yù)先置于以下不給出質(zhì)子的極性有機(jī)溶劑混合物中溶解二甲亞砜或甲酰替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物、甲酰替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物。化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
2、所述的膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶溶解在PH為5-9范圍的緩沖液中膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶溶解在PH為5-9范圍的緩沖液中。為了提高膽固醇酶化合物的親合性，還可向溶液中加入能改變膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶化合物中的氨基的高分子聚合物。檢測(cè)其活性后直接使用。
3、混合反應(yīng)活化后的化合物與溶解后的酶按1∶1-20∶1(摩爾比)的比例混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應(yīng)18-24小時(shí)；三、配置在制得的酶化合物中加入表面活性劑，表面活性劑的混合比例為前述成分重量百分比的0.003-30，優(yōu)先混合比例為0.01-10；還可加入適量防腐劑、穩(wěn)定劑和用于顯色測(cè)定的色原，還可考慮加入適量催化劑和抗干擾物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的對(duì)高密度脂蛋白膽固醇具有較強(qiáng)作用的表面活性劑可以是陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子表面性性劑，只要對(duì)高密度脂蛋白膽固醇具有較強(qiáng)作用，作為陽(yáng)離子表面活性劑的實(shí)例有月桂酰胺基咪唑啉、棕櫚酰胺基咪唑啉、聚環(huán)氧乙烷十二烷胺、聚氧乙烯十六烷胺；作為陰離子表面活性劑的實(shí)例有十二(烷)醇聚氧乙烯醚磷酸混合脂、PAM共聚物、十二烷基二苯醚二磺酸鈉、棕櫚酰甲基硫磺酸鈉；作為非離子表面活性劑的實(shí)例有磺基咪唑啉甜菜堿、烷基聚氧乙烯甜菜堿；作為非離子表面活性劑的實(shí)例子有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、二芐基聯(lián)苯基聚氧乙烯醚、失水山梨醇聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚、三芐基酚聚氧乙烯醚等。這里優(yōu)選非離子表面活性劑(如Tween-80、Triton X-100、GenapolX-081、Thesit等)。表面活性劑可以單獨(dú)使用也可以混合使用，其用量如前所述。
在本發(fā)明中為了保持酶化合物和試劑的穩(wěn)定性，可以加入穩(wěn)定劑、防腐劑或防霉劑或其它的醇類(lèi)，如乙二胺四乙酸鈉(EDTA.2Na)、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、二價(jià)金屬離子。防腐劑或防霉劑的種類(lèi)和用量可多可少不作限定，一般使用范圍0.1-20mmol/L。
在本發(fā)明中用于顯色測(cè)定的色原有2.4.6-三溴-3-羥基苯甲酸(TBHBA)、3.5-二氯-2-羥基苯甲酸(DHBS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-5-2甲氧基苯胺(HDAOS)、TODP、TOOS等。色原的種類(lèi)和用量也可多可少不作限定，一般使用范圍0.01-10mmol/L。
本發(fā)明所使用的緩沖液，可以是GOOD’S緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、檸檬酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液等，緩沖液的種類(lèi)和濃度因具體成份而定，這里不作限制，只要在PH為5-9的范圍內(nèi)保證緩沖作用且不抑制酶活性的一種或其混合物。優(yōu)先選用50-200mmol/L的GOOD’S緩沖液。
催化劑的種類(lèi)和用量也可多可少不作限定，一般使用范圍也為10U/L-10000U/L。
本發(fā)明中為了防止其它非測(cè)量物質(zhì)的干擾，可加入抗壞血酸氧化酶等抗干擾物質(zhì)。該物質(zhì)的種類(lèi)和用量也的種類(lèi)和用量可多可少不作限定，一般使用范圍10U/L-10000U/L。
本發(fā)明所采用的所有生化用品均可外購(gòu)獲得。
本發(fā)明所提供的高密度中膽固醇的試劑，在測(cè)試時(shí)全自動(dòng)生化分析儀上的主要參數(shù)如下

實(shí)施例1本實(shí)施例中的高親合酶膽固醇酯酶化合物與高親合酶膽固醇氧化酶化合物由甾類(lèi)糖苷化合物中的龍舌苷甾類(lèi)糖苷與酶制備；配置方式如前所述，其中化合物活化的活化條件為
化合物與活化劑的摩爾比為1∶1，溫度15℃，PH值為8，時(shí)間10小時(shí)。
緩沖液的摩爾配比是100mmol/L，緩沖液的PH值為7。
活化后的化合物與溶解后的酶混合，該溶液在15℃的溫度下反應(yīng)20小時(shí)。
所述的龍舌苷預(yù)先置于以下有機(jī)溶劑混合物中溶解甲酰替二甲胺與甲苯按2∶1混合的混合物，化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶0.01。
試劑I高親合酶膽固醇酯酶化合物 500U/L高親合酶膽固醇氧化酶化合物 5000U/L緩沖液GOOD’S(PH6.7) 100mmol/L穩(wěn)定劑BSA1g/L穩(wěn)定劑聚乙二醇 10g/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na 2mmol/L色原TOPS 2mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L催化劑辣根過(guò)氧化物酶 950U/L抗干擾物質(zhì)抗壞血酸氧化酶 1000U/L試劑II表面活性劑聚氧乙烯烷基苯基醚 500g/L緩沖液GOOD’S(PH6.7) 100mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L色原4-AAP0.25mmol/L穩(wěn)定劑BSA1g/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na 2mmol/L上機(jī)測(cè)試時(shí)試劑I、試劑II同時(shí)混合加入測(cè)試。
表1為本實(shí)施例1的上機(jī)測(cè)試值與沉淀法的測(cè)定值對(duì)照表。
圖1根據(jù)表1數(shù)據(jù)制成，本實(shí)施例1測(cè)得值與沉淀法(《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版279頁(yè)所推薦)的測(cè)得值的相關(guān)性r為0.992，說(shuō)明相關(guān)性良好。
實(shí)施例2本實(shí)施例中使用膽固醇酯酶化合物、膽固醇氧化酶化合物由三萜烯糖苷類(lèi)化合物的中的茶皂苷與酶制備；配置方式如前所述，其中化合物活化的活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶5，溫度0℃，PH值為4，時(shí)間24小時(shí)。
緩沖液的摩爾配比是50mmol/L，緩沖液的PH值為9。
活化后的化合物與溶解后的酶混合，該溶液在0℃的溫度下反應(yīng)24小時(shí)；所述的茶皂苷預(yù)先置于以下有機(jī)溶劑混合物中溶解甲酰替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物；化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶15。
試劑I膽固醇酯酶化合物用量為 5000U/L膽固醇氧化酶化合物用量為4000U/L緩沖液GOOD’S(PH5)50mmol/L穩(wěn)定劑BSA 1g/L穩(wěn)定劑Mgcl25mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na 2mmol/L色原TOOS2.2mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L催化劑辣根過(guò)氧化物酶950U/L抗干擾物質(zhì)抗壞血酸氧化酶1000U/L試劑II表面活性劑聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚 600g/L緩沖液GOOD’S(PH6.7) 50mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L色原4-AAP 0.20mmol/L穩(wěn)定劑BSA 1g/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na 2mmol/L
上機(jī)測(cè)試時(shí)試劑I、試劑II同時(shí)混合加入測(cè)試。
表2為本實(shí)施例2的上機(jī)測(cè)試值與沉淀法的測(cè)定值對(duì)照表。
圖2根據(jù)表2數(shù)據(jù)制成，本實(shí)施例2測(cè)得值與沉淀法(《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版279頁(yè)所推薦)的測(cè)得值的相關(guān)性r為0.994，說(shuō)明相關(guān)性良好。
實(shí)施例3本實(shí)施例中使用膽固醇酯酶化合物、膽固醇氧化酶化合物由由三萜烯糖苷類(lèi)化合物的中的茶皂苷與酶制備；配置方式如前所述。
化合物活化的活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶10，溫度25℃，PH值11，時(shí)間0.1小時(shí)。
緩沖液的摩爾配比是200mmol/L，緩沖液的PH值為5。
活化后的化合物與溶解后的酶混合，該溶液在25℃的溫度下反應(yīng)18小時(shí)；所述的茶皂苷預(yù)先置于以下有機(jī)溶劑混合物中溶解六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶30。
試劑I膽固醇酯酶化合物用量為6000U/L膽固醇氧化酶化合物用量為 600U/L緩沖液GOOD’S(PH9) 200mmol/L穩(wěn)定劑BSA 1g/L穩(wěn)定劑Mgcl25mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na2mmol/L色原HDAOS 3mmol/L防腐劑NaN37.5mmol/L催化劑辣根過(guò)氧化物酶 950U/L抗干擾物質(zhì)抗壞血酸氧化酶 1000U/L試劑II表面活性劑三芐基酚聚氧乙烯醚 12g/L緩沖液GOOD’S(PH6.7)200mmol/L防腐劑NaN37.5mmol/L
色原4-AAP 0.15mmol/L穩(wěn)定劑BSA 1g/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na 2mmol/L上機(jī)測(cè)試時(shí)試劑I、試劑II同時(shí)混合加入測(cè)試。
表3為本實(shí)施例3的上機(jī)測(cè)試值與沉淀法的測(cè)定值對(duì)照表。
圖3根據(jù)表3數(shù)據(jù)制成，本實(shí)施例3測(cè)得值與沉淀法(《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版279頁(yè)所推薦)的測(cè)得值的相關(guān)性r為0.989，說(shuō)明相關(guān)性良好。
表1


表2

表3

權(quán)利要求
1.高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑，包括適量防腐劑、穩(wěn)定劑和色原，其特征在于該試劑還包括以下成分A、高親合性酶化合物，該酶化合物，由酶和化合物反應(yīng)而得，其中，化合物是甾類(lèi)糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種與活化劑混合、活化后的活化物，化合物的濃度為1-50毫克/毫升；酶是1、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10、2、脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10中的任一組與緩沖液混合、溶解后的溶解物，緩沖液的PH值為5-9，緩沖液的摩爾配比是50-200mmol/L，所述的緩沖液是GOOD’S緩沖液或磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液或檸檬酸緩沖液或硼酸鹽緩沖液；上述化合物與酶二種成分反應(yīng)時(shí)的摩爾配合比為1∶1-20∶1；B、表面活性劑，其混合比例為A成分的重量百分比的0.003-30，所述的表面活性劑是陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑和非離子表面活性劑中的一種或任意比例混合的多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑，其特征在于所述的酶優(yōu)先選擇膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑，其特征在于該試劑還包括適量催化劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑，其特征在于所述的表面活性劑的混合比例為0.01-10重量百分比。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑，其特征在于該試劑中還有適量抗干擾物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟一、化合物活化選擇所述的甾類(lèi)糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種，在水介質(zhì)中用公知的疊氮法或碳化二亞胺法或丁二酰亞胺法或高碘酸鹽氧化法進(jìn)行活化，活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶10，溫度0-25℃，PH在4-11范圍內(nèi)，時(shí)間0.1-24小時(shí)。二、酶溶解選擇所述的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶中的任一組，溶解在緩沖液中；三、混合反應(yīng)活化后的化合物與溶解后的酶混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應(yīng)18-24小時(shí)；四、配置反應(yīng)后的酶化合物與表面活性劑混合，并加入防腐劑、穩(wěn)定劑、用于顯色測(cè)定的色原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于所述的甾類(lèi)糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素預(yù)先置于以下有機(jī)溶劑混合物中溶解二甲亞砜或甲酰替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲酰替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物，化合物與有機(jī)溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于該試劑中還加入催化劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑的制備方法，其特征在于該試劑中還加入抗干擾物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定血清中的高密度脂蛋白中膽固醇試劑以及制備方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種測(cè)定高密度脂蛋白中膽固醇的試劑的制備方法及試劑的改進(jìn)，用該方法所制得的試劑應(yīng)特異性好、檢測(cè)簡(jiǎn)便、測(cè)試準(zhǔn)確率高，并能夠在各種型號(hào)的全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。技術(shù)方案是試劑的成分如下A.高親合性酶化合物，由酶和化合物反應(yīng)而得，二種成分反應(yīng)時(shí)的摩爾配合比為1∶1－20∶1；B.表面活性劑，其混合比例為A成分的重量百分比的0.003－30；C.適量防腐劑、穩(wěn)定劑、色原。該試劑中還加入適量催化劑和抗干擾物質(zhì)。所述的制備方法包括以下步驟一、化合物活化；二、酶溶解；三、混合反應(yīng)；四、配置。
文檔編號(hào)G01N21/77GK1632541SQ20041009938
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者王賢理, 蒙凱 申請(qǐng)人:浙江伊利康生物技術(shù)有限公司