專利名稱：：高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法、測定用試劑和測定用試劑盒。
背景技術：
：生物體中的脂蛋白可根據(jù)其比重分為高密度脂蛋白(以下簡稱為HDL)、低密度脂蛋白(以下簡稱為LDL)、超低密度脂蛋白(以下，簡稱為VLDL)、乳糜微粒(以下簡稱為CM)，主要由于脫輔基蛋白的種類的不同，它們在生物體中的作用差異很大，脂質(zhì)組成各式各樣。已知，其中，HDL由于接受來自于包括動脈壁的各組織的膽固醇，因此與積累于細胞內(nèi)的膽固醇的除去作用相關，其為冠動脈硬化癥等各種動脈硬化癥的危險預防因子，其血中水平是動脈硬化性疾病的預知發(fā)病的有用指標。以往的HDL中的膽固醇(以下簡稱為HDL膽固醇)的測定方法由通過超離心法、免疫化學的方法、電泳法、沉淀法等的分餾操作和膽固醇定量操作的兩個階段構成。但是，分餾操作的操作很煩雜，需要很長時間，而且在安全性方面也存在問題。因此，需要這些分離操作的測定法效率極低，是一種不適于實用化的方法。近年來，為了解決上述問題，已經(jīng)報道了各種各樣的測定方法。例如，在含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽汁酸鹽或膽汁酸衍生物或琥珀酸二辛酯磺酸鹽的緩沖液中使血清或血漿與這些酶反應，以HDL膽固醇為先驅，使VLDL和LDL中的膽固醇反應，測定生成的過氧化氫后，在反應液中添加含有聚環(huán)氧乙烷氧化物基的非離子表面活性劑，使HDL膽固醇與該酶反應，對HDL膽固醇分別進行特異性定量的方法(參照專利文獻l),通過在特定的pH和特定溫度下，在含有胰臟來源的膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽汁酸族的表面活性劑和非離子系表面活性劑的緩沖液中使血清與該酶反應，測定HDL膽固醇的方法(參照專利文獻2)。在專利文獻2中記載的測定方法中，首先，進行LDL膽固醇與該酶的反應，然后，進行HDL膽固醇與該酶的反應，可以測定HDL膽固醇。但是，這些測定方法，測定需要長時間，而且，不一定是非特異性測定HDL膽固醇的方法。作為通過使HDL以外的脂蛋白凝集，測定HDL膽固醇的方法，已知有例如，使用硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝集的試劑、二價金屬鹽以及化學修飾的酶的測定方法(參照專利文獻3);以及聚陰離子等與HDL之外的脂蛋白形成復合體的試劑，和聚環(huán)氧乙烷-聚氧化丙烯縮聚物等不溶解脂蛋白的表面活性劑的測定方法(參照專利文獻4);使用硫酸葡聚糖等聚陰離子、二價金屬鹽，特定的非離子性表文獻5);#"征在于用;含有脂蛋白分^劑(硫酸葡聚糖等陰離子和鎂離子等二價陽離子的組合)的溶液處理血清或血漿，不用對獲得的混合液進行固體和液體的分離處理，在陰離子性表面活性劑(烷基磺酸或膽汁酸或其衍生物)的存在下，使之與膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶反應，測定生成的過氧化氫來測定血清或血漿中的HDL膽固醇的方法(參照專利文獻6)。但是，在這些使HDL之外的脂蛋白凝集的HDL膽固醇測定法中，雖然與以往的標準方法存在良好的相關性，但是由反應中生成的凝集物引起的渾濁而導致的不正確、在反應器中的堿清洗時，存在著在與反應液中的金屬鹽的反應中生成的金屬氫氧化物的析出而導致的對自動分析裝置的過度負荷等問題。作為不使HDL以外的脂蛋白凝集來測定HDL膽固醇的方法，已知的有；例如，通過使胰腺來源的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶與生物體試樣，在膽汁酸或其鹽以及白蛋白的存在下發(fā)生反應，測定由該酶反應消耗或生成的化合物，從而測定生物體試樣中的HDL膽固醇的測定方法(參照專利文獻7);對于HDL餾分具有反應選擇性的HLB值為16以上的非離子性表面活性劑的存在下，使優(yōu)先作用于HDL餾分的脂蛋白脂酶和/或膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶與試樣反應，測定試樣中的HDL膽固醇的方法(參照專利文獻8)等。而且，通過酰基聚環(huán)氧乙烷山梨聚糖酯將HDL之外的脂蛋白中的膽固醇優(yōu)先轉換為過氧化氫，除去生成的過氧化氫后，通過添加聚環(huán)氧乙烷烷基醚，用酶測定HDL膽固醇的方法(參照專利文獻9)。但是，在這些不使HDL以外的脂蛋白凝集的HDL膽固醇的測定方法中，存在著由于HDL以外的脂蛋白中的膽固醇的不完全消除，對于HDL以外的脂蛋白中的膽固醇的非特異性反應所引起的測定值不正確的問題。而且，作為不使HDL以外的脂蛋白凝集的HDL膽固醇的測定方法，已知有試樣中的HDL膽固醇的測定方法(參照專利文獻10)，其特征在于，使U膽甾醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者U)膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶，在含有非離子性表面活性劑、聚陰離子和白蛋白的水性介質(zhì)中與試樣反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶；以及HDL膽固醇的測定方法(參照專利文獻11)，其特征在于，使膽甾醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶在含有膽汁酸衍生物的水性介質(zhì)中與試樣反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶。專利文獻l:特開昭62-69999號公報專利文獻2:特開昭63-126498號公報專利文獻3:特開平8-131197號公報專利文獻4:特開平8-201393號公報專利文獻5:特開平9-285298號公報專利文獻6:特開平8-116996號公報專利文獻7:國際公開WO97/40376A小冊子專利文獻8:WO00/52480A小冊子專利文獻9:特開平9-299號公報專利文獻10:國際7>開WO2004/035816A小冊子專利文獻ll:WO2004/035817A小冊子
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供一種簡便的，并且可以正確測定的HDL膽固醇的測定方法、測定用試劑和測定用試劑盒。用于解決問題的手段本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題進行了積極的研究，結果發(fā)現(xiàn)，在具有胺或銨鹽結構的特定的含氮表面活性劑和聚陰離子的共存下，膽齒醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或膽固醇脫氳酶特異性作用于HDL,從而完成本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明涉及以下(1)-(13)。(l)試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于，使i)膽甾醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者ii)膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶，在含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(II)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)、以及聚陰離子的水性介質(zhì)中與試樣反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(式中，Ri表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和r相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(式中，115表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和IT相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。(2)根據(jù)前述(1)記載的方法，其中，水性介質(zhì)還含有選自于白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)。(3)根據(jù)前迷(1)或(2)記載的方法，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。(4)高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑，其特征在于含有選自于通式(i)表示的物質(zhì)和通式(n)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)、聚陰離子、膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(式中，W表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，f和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(式中，115表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R'相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。(5)高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑，其特征在于含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(II)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)、聚陰離子、膽甾醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶和氧化型輔酶；(I)(式中，Ri表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R'相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。(6)根據(jù)前述(5)記載的試劑，其中還含有還原型輔酶。(7)前述(4)-(6)任一項記載的試劑，其中還含有選自于白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)。(8)前述(4)-(7)任一項記載的試劑，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。(9)高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，其含有笫一試劑和第二試劑，其特征在于，在第一試劑中含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(n)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)和聚陰離子，第二試劑中含有膽固醇氧化酶，第一試劑、笫二試劑中的任一種或二者中還含有過氧化氫測定用試劑，第一試劑、第二試劑中的任一種或二者中還含有膽甾醇酯水解酶；\6/(II)(I)(式中，^表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，^表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(II)(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R7相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。(IO)高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，其含有第一試劑和第二試劑，其特征在于，在第一試劑中含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(II)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)和聚陰離子，第二試劑中含有膽固醇脫氫酶，第一試劑、第二試劑中的任一種或二者中還含有氧化型輔酶，第一試劑、第二試劑中的任一種或二者中還含有膽甾醇酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(I)(式中，W表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R'表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R'相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。(11)前述(10)記載的試劑盒，其中，第一試劑、第二試劑中的任一種或兩者中還含有還原型輔酶測定用試劑。(12)前述(9)-(11)任一項中記載的試劑盒，其中，第一試劑、第二試劑中的任一種或兩者還含有選自于白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)，第一試劑、第二試劑中的任一種或兩者還含有膽甾醇酯水解酶。(13)前述(9)-(12)任一項中記載的試劑盒，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供簡便且正確的HDL膽固醇的測定方法，測定用試劑和測定用試劑盒。具體實施例方式本發(fā)明的HDL膽固醇的測定方法是不消除HDL以外的脂蛋白中的膽固醇，也不使HDL以外的脂蛋白中的膽固醇凝集的測定HDL膽固醇的方法。作為本發(fā)明的測定方法中可以使用的試樣，可以列舉有例如全血，血漿，血清，髓液，唾液，羊水，尿，汗，胰液等，優(yōu)選血漿和血清o作為本發(fā)明中的膽甾醇酯水解酶，如果是具有加水分解膽齒醇酯能力的酶，沒有特別的限制，還可以使用例如動物，植物或微生物來源的膽甾醇酯酶，脂蛋白脂肪酶，以及通過基因工程方法制備的膽甾醇酯酶，脂蛋白脂肪酶等。作為膽甾醇酯水解酶，可以使用未修飾的膽甾醇酯水解酶，也可以使用化學修飾的膽甾醇酯水解酶。而且，作為膽甾醇酯水解酶，還可以z使用市售品。作為市售的膽甾醇酯水解酶，可以列舉膽甾醇酯酶"Amano"2(CHE2;天野酶公司制)，膽甾醇酯酶"Amano"3(CHE3;天野酶公司制)，脂蛋白脂肪酶(LPL311，東洋紡制社制)，脂蛋白脂肪酶"Amano"3(LPL3，天野酶公司制)，43kDa酯酶(天野酶公司制)，EST"Amano"2(天野酶公司制)，膽甾醇酯酶[COE313(化學修飾的膽甾醇酯酶)；東洋紡制社制]等。而且，在本發(fā)明中，還可以組合使用兩種以上的膽甾醇酯水解酶。作為膽甾醇酯水解酶的化學修飾中修飾該酶的基團，可以列舉有例如以聚乙二醇作為主要成分的基團，以聚丙二醇作為主要成分的基團，具有聚丙二醇和聚乙二醇的共聚物的基團，含有水溶性多糖類的基團，磺丙基，磺丁基，聚氨基甲酸酯，具有螯合功能的基團等，優(yōu)選以聚乙二醇作為主要成分的基團。作為水溶性多糖類，可以列舉例如葡聚糖，可溶性淀粉等。作為用于化學修飾膽甾醇酯水解酶的試劑，可以列舉具有上述化學修飾基團，以及與酶的氨基，羧基，巰基等反應獲得的官能團或結構的化合物等。作為與酶中的氨基反應獲得的官能團或結構，可以列舉，例如羧基，活性酯基(N-羥基丁二酰亞胺基等)，酸酐，酰氯化物，醛，環(huán)氧化物基，1，3-丙磺酸內(nèi)酯，1,4-丁烷磺內(nèi)酯等。作為與酶中的羧基反應獲得的官能團或結構，可以列舉例如氨基。作為與酶中的巰基具有反應性的基團或結構，可以列舉例如馬來酰亞胺，二石克化物，a-卣素酯(a-碘酯等)等。作為化學修飾劑，還可以使用市售品。作為市售的化學修飾劑，可以列舉，例如具有以聚乙二醇作為主要成分的基團和N-羥基丁二酰亞胺基的SunbrightVFM-4101，SunbrightME-050AS，SunbrightDE-030AS(均由日本油脂公司制)，具有以聚亞垸基二醇作為主要成分的基團和酸酐結構的SunbrightAKM系列(例如，SunbrightAKM-1510等)，SunbrightADM系列，SunbrightACM系列(均為日本油脂公司制)，具有以聚乙二醇作為主要成分的基團和環(huán)氧化物基的EPOX-3400,M-EPOX-5000(均由SheawaterPolymers公司制)，具有螯合功能的基團和酸酐結構的二乙烯三胺-N，N，N，，N"，N"-五乙酰乙酸酐(DTPAanhydride;同仁化學公司制)等。膽甾醇酯水解酶的化學修飾可以用例如以下方法進行，但是不限于本方法。首先，將膽甾醇酯水解酶溶解于pH8.0以上的緩沖液(例如，HEPES緩沖液)中，在0-55。C添加0.01-500倍摩爾量的化學修飾劑，攪拌5分鐘-5小時。在實際的酶反應中，作為化學修飾的膽齒醇酯水解酶，不但可以照原樣使用該反應液，而且還可以使用根據(jù)需要通過超濾膜等除去未反應的化學修飾劑的反應液。作為可以在本反應的方法中使用的膽甾醇酯水解酶的濃度，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是優(yōu)選反應液中的濃度為0.01-400U/mL，更優(yōu)選0.02-200U/mL。作為本發(fā)明中的膽固醇氧化酶，如果是具有通過氧化膽固醇生成過氧化氫的能力的酶，就沒有特別的限制，例如，可以使用動物、植物或微生物來源的膽固醇氧化酶，也可以使用由基因工程方法制備的膽固醇氧化酶等，還可以使用膽固醇氧化酶"Amano"1(CH0D1;天野酶公司制)，膽固醇氧化酶(CHOPE;Kikkoman/>司制)，膽固醇氧化酶(C00321;東洋紡制社制)，膽固醇氧化酶協(xié)和(協(xié)和發(fā)酵社制)等市售品。而且，在本發(fā)明中，還可以組合使用兩種以上的膽固醇氧化酶。膽固醇氧化酶可以是未修飾的酶，也可以是化學修飾的酶。化學修飾的膽固醇氧化酶可以通過例如^f吏用前述的化學#~飾劑通過前述化學修飾方法進行制備。作為可以在本反應的方法中使用的膽固醇氧化酶的濃度，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是優(yōu)選在反應液中的濃度為0.01-400U/mL，更優(yōu)選0.02_200U/mL。作為本發(fā)明中的膽固醇脫氫酶，如果是具有通過在氧化型輔酶存在下氧化膽固醇生成還原型輔酶的能力的酶，就沒有特別的限制，還可以使用例如動物，植物或微生物來源的膽固醇脫氫酶等。還可以使用膽固醇脫氬酶"Amano"5(CHDH5;天野酶/>司制)等市售品。而且。在本發(fā)明中，還可以組合使用兩種以上的膽固醇脫氫酶。膽固醇脫氫酶可以是未修飾的酶，也可以是化學修飾的酶?；瘜W修飾的膽固醇脫氫酶可以通過例如使用前述的化學修飾劑通過前述化學修飾方法進行制備。作為可以在本反應的方法中使用的膽固醇脫氫酶的濃度，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是優(yōu)選在反應液中的濃度為0.01-400U/mL，更優(yōu)選0.02-200U/mL。在使用本發(fā)明的膽固醇脫氫酶的測定方法中，可以使用氧化型輔酶。作為氧化型輔酶，可以列舉有例如NAD，NADP，thio-NAD,thio-NADP等。在本發(fā)明中，可以與聚陰離子一起使用通式(I)表示的物質(zhì)[以下稱為化合物(I)]，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>(式中，W表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，f和W相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，或者通式(II)表示的物質(zhì)[以下稱為化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R7相同或不同，分別表示氬原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。的烷基，可以列舉例如己基、庚基、辛基，異辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鯨蠟基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山?；?、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等基團，并優(yōu)選碳原子數(shù)為8-24的烷基，且更優(yōu)選碳原子數(shù)為10-18的烷基。作為化合物(I)和化合物(II)中直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烯基，可以列舉例如己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基等，并優(yōu)選碳原子數(shù)為8-24的烯基，且更優(yōu)選碳原子數(shù)為10-18的烯基。的烷基，可以列舉例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、異辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鯨蠟基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山?；?、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等基團，并優(yōu)選碳原子數(shù)為1-24的烷基，且更優(yōu)選碳原子數(shù)為1-18的烷基。作為化合物(I)和化合物(II)中直鏈或分支枝狀的碳原子數(shù)為l-6的烷基，可以列舉例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等基團，并優(yōu)選甲基、乙基、丙基中任一種，且更優(yōu)選甲基。作為化合物(I)和化合物(II)中直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為2-30的烯基，可以列舉例如乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基等，并優(yōu)選碳原子數(shù)為2-24的烯基，且更優(yōu)選碳原子數(shù)為2-18的烯基。作為化合物(I)和化合物(II)中直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為2-6的烯基，可以列舉例如乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基等，并優(yōu)選乙烯基、丙烯基中的任一種，且更優(yōu)選乙烯基。作為化合物(I)中的陰離子，可以列舉例如，氫氧根離子、卣素離子、來自于無機酸的陰離子、來自于有機酸的陰離子等。作為卣素離子，可以列舉氟離子、氯離子、溴離子、碘離子等。作為來自于無機酸的陰離子，可以列舉例如硝酸離子、硫酸離子、磷酸離子、碳酸離子等。作為來自于有機酸的陰離子，可以列舉例如甲酸離子、乙酸離子、乳酸離子、檸檬酸離子、谷氨酸離子等羧酸離子等。另外，在通式(I)中，優(yōu)選R'表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，112表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，RS和R4都表示甲基，X表示陰離子的化合物。作為化合物(I)的實例(制品)，可以列舉例如陽離子AB,陽離子BB，陽離子2ABT，陽離子2DB-500E，陽離子2-OLR(均由日本油脂公司制)等。作為化合物(II)的具體實例(制品)，可以列舉例如胺BB,胺AB,胺2-0LR,叔胺BB，叔胺FB(均由日本油脂公司制)等。作為化合物(I)或化合物(II)的濃度，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是優(yōu)選在反應液中的濃度為0.0001-1%,更優(yōu)選0.001-0.1%。作為可以在本發(fā)明中使用的聚陰離子，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的聚陰離子，則沒有特別的限定，可以列舉例如硫酸葡聚糖或其鹽，肝素或其鹽，鎢磷酸或其鹽，疏酸化環(huán)糊精或其鹽，疏酸寡糖或其鹽等，但優(yōu)選疏酸葡聚糖。作為硫酸葡聚糖，可以列舉例如分子量為4萬，8萬，20萬，50萬，100萬，200萬等的石克酸葡聚糖。作為硫酸寡糖，可以列舉例如硫酸瓊脂糖，疏酸海藻糖，疏酸軟骨素等。作為鹽，可以列舉例如鈉鹽，鉀鹽，鋰鹽，銨鹽，鎂鹽等。而且，在本發(fā)明中，可以使用兩種以上的聚陰離子。作為在本發(fā)明的HDL膽固醇測定中的聚陰離子的濃度，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是優(yōu)選在反應液中的濃度為0.001-10%,更優(yōu)選0.01-1%。作為可以在本發(fā)明中使用的白蛋白，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的，則沒有特別的限定，可以列舉例如來源于牛，馬，羊，人的白蛋白等，但是優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)。而且，還可以使用通過基因工程方法制備的白蛋白。在本發(fā)明中，還可以組合使用兩種以上的白蛋白。作為在本發(fā)明的HDL膽固醇的測定中的白蛋白的濃度，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是優(yōu)選在反應液中的濃度為0.001-10%,更優(yōu)選0.01-1%。作為可以在本發(fā)明中使用的聚環(huán)氧乙烷烷基胺或聚環(huán)氧乙烷烯基胺，可以列舉例如通式(III)表示的化合物[以下稱為化合物(III)]，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>。作為在化合物(in)中的烷基和烯基，可以列舉例如前述的支鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基，前述的支鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烯基，優(yōu)選碳原子數(shù)為8-24的烷基或烯基，更優(yōu)選碳原子數(shù)為10-18的烷基或烯基。作為聚環(huán)氧乙烷烷基胺或聚環(huán)氧乙烷烯基胺的具體實例(制品)，可以列舉，例如NymeenL201(氧乙烯月桂騰日本油脂公司制)，NymeenL207(聚氧乙烯月桂胺；日本油脂乂>司制)，NymeenS204,NymeenS210(聚氧乙烯十八烷胺；日本油脂公司制)，PioninOD420(聚氧乙烯十八烷胺；日本乳化劑公司制)，PioninD3104(聚氧乙烯月桂胺；竹本油脂公司制)，PioninD3110(聚氧乙烯月桂胺；竹本油脂公司制)，PioninD3605(聚氧乙烯烷基(大豆)胺；竹本油脂^^司制)，PioninD3615T(聚氧乙烯烷基(牛脂)胺;竹本油脂公司制)，BLAVNON0209(聚氧乙烯油烯氨基醚；青木油脂公司制)，BLAVNONL205(聚氧乙烯月桂胺酯；青木油脂公司制)等。聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷亞烷基胺中的氧化乙烯鏈的聚合度優(yōu)選為1-100，更優(yōu)選1-60。在本發(fā)明中，還可以使用兩種以上的聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷亞烷基胺。作為聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷亞烷基胺的濃度，如果是可以測定本發(fā)明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是優(yōu)選反應液中的濃度為0.0001-1%，更優(yōu)選0.001-0.1%。作為可以在本發(fā)明的HDL膽固醇的檢測方法中使用的水性介質(zhì)，可以列舉，例如脫離子水、蒸餾水、緩沖液等，優(yōu)選緩沖液。作為緩沖液中使用的緩沖劑，可以列舉，例如三(羥曱基)氨基曱烷緩沖劑、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、Good's緩沖劑等。作為Good's緩沖劑，可以列舉，例如2-嗎啉乙磺酸(MES)、二(2-羥基)亞氨基三(羥甲基)曱烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亞氨基二乙酸(ADA)、p底溱-N，N，-二(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基曱磺酸(ACES)、3-嗎啉代-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、N，N-二(2-羥甲基)-2-氨基曱磺酸(BES)、3-嗎啉代丙磺酸(M0PS)、N-[三(羥曱基)甲基]-2-氨基曱磺酸(TES)、2-[4-(2-羥甲基)-1-哌嗪]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N，N-二(2-羥甲基)氨]-2-羥基丙磺酸(DIPS0)、N-[三(羥曱基)甲基]-2-羥基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N，-二(2-羥基丙磺酸)(P0PS0)、3-[4-(2-羥曱基)-l-哌溱]-2-羥基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羥曱基)-l-哌溱]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羥甲基)曱基]甘氨酸(Tricine)、N，N,-二(2-羥曱基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥曱基)曱基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-環(huán)己基-2-氨基甲磺酸(CHES)、N-環(huán)己基-3-氨基-2-羥基丙磺酸(CAPSO)、N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。緩沖液的濃度如果是適于測定的濃度，則沒有特別的限制，優(yōu)選0.001-2.0mol/L，更優(yōu)選0.005-1.Omol/L。以下，對本發(fā)明的HDL膽固醇的測定方法，測定用試劑和測定用試劑盒進行具體說明。(HDL膽固醇的測定方法)作為本發(fā)明的HDL膽固醇的測定方法，可以列舉例如如下方式的方法。測定方法(1)在含有化合物(I)或化合物(II)和聚陰離子，根據(jù)需要含有選自于白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)的水性介質(zhì)中使試樣與膽甾醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶反應，使之生成過氧化氫或還原型輔酶，(2)測定生成的過氧化氫或還原型輔酶，(3)通過根據(jù)由(2)測定的值和預先制作的標準曲線，計算試樣中的HDL膽固醇濃度，可以測定試樣中的HDL膽固醇。在本測定方法中，(l)的反應在例如10-50°C，優(yōu)選20-4(TC，進行l(wèi)-60分鐘，優(yōu)選進行2-30分鐘。生成的過氧化氬的量，也可以用例如直接過氧化氫電極，但是也可以通過過氧化氬測定用試劑進行測定。過氧化氫測度用試劑是用于將生成的過氧化氫的物質(zhì)轉換成可以檢測的物質(zhì)的試劑。作為可以檢測的物質(zhì)，可以列舉，例如色素，發(fā)光等，優(yōu)選色素。在可以檢測的物質(zhì)為色素時，過氧化氫測定用試劑含有氧化發(fā)色型發(fā)色體和過氧化酶等過氧化活性物質(zhì)。作為氧化發(fā)色型發(fā)色體，可以列舉例如后述的氧化發(fā)色型發(fā)色體。在可以檢測的物質(zhì)為發(fā)光時，過氧化氫測定用試劑含有化學發(fā)光物質(zhì)。作為化學發(fā)光物質(zhì)，可以列舉，例如魯米諾，異魯米諾，光澤精(Lucigenin)，吖啶酯等。作為過氧化氬測定用試劑，在使用含有氧化發(fā)色型發(fā)色體和過氧化酶等過氧化活性物質(zhì)的試劑時，通過在過氧化活性物質(zhì)的存在下與氧化發(fā)色型發(fā)色體反應生成過氧化氫，定量生成的色素，可以定量過氧化氫。而且，在使用含有化學發(fā)光物質(zhì)的過氧化氫測度用試劑時，過氧化氫通過與化學發(fā)光物質(zhì)反應生成光子(photon)，通過定量生成的光子，可以定量過氧化氬。作為氧化發(fā)色型發(fā)色體，可以列舉，例如白色型發(fā)色體，氧化偶合發(fā)色型發(fā)色體等。白色型發(fā)色體，是在過氧化氫和過氧化酶等過氧化活性物質(zhì)的存在下，單獨轉換成色素的物質(zhì)。具體可以列舉10-N-羧甲基氨基甲酰-3，7-二(二甲胺)-10H-吩噻"秦(CCAP)、10-N-甲基代氨基甲?；?3，7-二(二甲胺)-1OH-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧曱基氨基碳酰)-4，4，-二(二曱胺)二苯胺鈉鹽(DA-64)、4，4，-二(二甲胺)二苯胺、二[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。氧化偶合發(fā)色型發(fā)色體是在過氧化氫和過氧化酶等過氧化活性物質(zhì)的存在下，通過氧化偶合兩種化合物而生成色素的物質(zhì)。作為兩種化合物的組合，可以列舉偶合劑和苯胺類的組合，偶合劑和酚類的組合等。作為偶合劑，可以列舉例如4-氨酰安替比林(4-AA)，3-曱基-2-瘞唑啉酮肼等。作為苯胺類，可以列舉N-(3-磺丙基)苯胺、N-曱基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-曱基-N-(2-幾基-3-磺丙基)-3，5-曱基苯胺(MAOS)、N-甲基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二曱氧基苯胺(DA0S)、N-甲基-N-(3-磺丙基)-3-曱基苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-曱基-N-(3-磺丙基)-3-曱氧苯胺、N-甲基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-甲基-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-甲基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-甲基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-甲基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-曱基^-(3-磺丙基)->1，-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-曱基-N-(3-磺丙基)-N，-乙酰乙二胺、N-甲基-N-(2-幾基-3-磺丙基)-4-氟代-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。作為酚類，可以例舉有苯酚，4-氯酚、3-甲基苯酚-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。在過氧化氫的測定中，過氧化活性物質(zhì)的濃度如果是適于測定的濃度，則沒有特別的限定，但是使用過氧化酶作為過氧化活性物質(zhì)時，優(yōu)選l-100kU/L。而且，氧化發(fā)色型發(fā)色體的濃度如果是適于測定的濃度，則沒有特別的限定，優(yōu)選0.01-10g/L。作為還原型輔酶的測定方法，可以列舉，例如測定生成的還原型輔酶的吸光度的方法，使用還原型輔酶測定用試劑的方法等。作為測定還原型輔酶的吸光度的方法中的吸光度，優(yōu)選300-500nm，更優(yōu)選330-400認，尤為優(yōu)選340nm附近。還原型輔酶測定用試劑是用于將生成的還原型輔酶轉換成可以檢測的物質(zhì)的試劑。作為可以檢測的物質(zhì)，可以列舉，例如色素等。作為可以檢測的物質(zhì)為色素時的還原型輔酶測定用試劑，可以列舉，例如含有黃遞酶，電子載體(electroncarrier)和還原型發(fā)色型發(fā)色體的試劑。作為電子載體，可以列舉，例如l-甲氧基-5-哈"秦絲、(methylphenazium)石克酸甲酉旨(methylsulfate)等。作為還原型輔酶測定用試劑，在使用含有黃遞酶，電子載體和還原型發(fā)色型發(fā)色體的試劑時，通過定量通過還原發(fā)色型發(fā)色體轉化所生成的色素，可以定量還原型輔酶。作為還原發(fā)色型發(fā)色體，可以列舉，例如3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝化苯基)-5-(2，4-二碘苯基)-2H-四唑單鈉鹽(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二碘苯基)-2H-四唑單鈉鹽(WST-3)等。(HDL膽固醇測定用試劑)本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑含有選自于化合物(I)和化合物(n)中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，膽齒醇酯水解酶，膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑，根據(jù)需要，還含有選自于白蛋白，聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)。作為測定用試劑，優(yōu)選含有選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)，選自聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，膽甾醇酯水解酶，膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑的試劑，和含有選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，白蛋白，膽甾醇酯水解酶，膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑的試劑。而且，作為這種測定用試劑，特別優(yōu)選含有選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)，選自聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，白蛋白，膽甾醇酯水解酶，膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑的試劑。本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑含有選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，膽甾醇酯水解酶，膽固醇氧化酶，根據(jù)需要，還含有選自于還原型輔酶測定用試劑，白蛋白，聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)。作為這種測定用試劑，優(yōu)選含有選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)，聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，膽甾醇酯水解酶，膽固醇脫氫酶和氧化型輔酶和還原型輔酶測定用試劑的試劑，和含有選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，白蛋白，膽甾醇酯水解酶，膽固醇脫氫酶和氧化型輔酶和還原型輔酶測定用試劑的試劑。而且，作為這種測定用試劑，特別優(yōu)選含有選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)，聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)，聚陰離子，白蛋白，膽甾醇酯水解酶，膽固醇脫氫酶和氧化型輔酶和還原型輔酶測定用試劑的試劑。作為本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑，可以例舉例如以下方式的試劑，但其并不對本發(fā)明的范圍有任何限定。而且，方便起見，以下將選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)稱為"化合物A"，將選自于白蛋白，聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺的至少一種物質(zhì)稱為"化合物B，，。在本發(fā)明的測定用試劑中，可以使用1種或多種化合物A，可以使用1種或多種化合物B。試劑1含有化合物A、聚陰離子、膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑的試劑。試劑2含有化合物A、聚陰離子、化合物B、膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑的試劑。試劑3含有化合物A、聚陰離子、膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶的試劑。試劑4含有化合物A、聚陰離子、化合物B、膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶的試劑。試劑5含有化合物A、聚陰離子、膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶和還原型輔酶測定用試劑的試劑。試劑6含有化合物A、聚陰離子、化合物B、膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶和還原型輔酶測定用試劑的試劑。(HDL膽固醇測定用試劑盒)本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑可以以試劑盒形式保存，流通和使用。作為試劑盒的形式，沒有特別的限制，可以是雙試劑系列，三試劑系列等中的任意一種，但是優(yōu)選雙試劑系列。在由第一試劑和笫二試劑構成的雙試劑系列的HDL膽固醇測定用試劑盒中，第一試劑和第二試劑中可分別含有，也可以在第二試劑一者中含有膽甾醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。在第一試劑和第二試劑中分別含有時，優(yōu)選在第一試劑中含有膽甾醇酯水解酶，在第二試劑中含有膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。可以在使用膽固醇脫氬酶的測定方法中使用的氧化型輔酶可以包含于第一試劑、第二試劑中的任一者中或包含于兩者中。選自于化合物(I)和化合物(II)中的至少一種物質(zhì)可以包含于第一試劑、第二試劑中的任一者中或包含于兩者中，但優(yōu)選包含于第一試劑中。聚陰離子可以包含于第一試劑、第二試劑中的任一者中或包含于兩者中，但優(yōu)選包含于第一試劑中。選自于白蛋白，聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺的至少一種物質(zhì)(化合物B)可以包含于第一試劑、第二試劑中的任一者中或包含于兩者中。過氧化氫測定用試劑可以包含于第一試劑、第二試劑中的任一者中或包含于兩者中，但當該試劑含有氧化偶合型發(fā)色體時，優(yōu)選各個試劑中含有氧化偶合型發(fā)色體的各種化合物的形態(tài)，即，優(yōu)選過氧化氫測定用試劑包含于第一試劑和第二試劑兩者中。還原型輔酶測定用試劑可以包含于笫一試劑、第二試劑中的任一者中或包含于兩者中，但優(yōu)選包含于第一試劑、第二試劑兩者中。作為本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑盒，可以列舉例如以下方式的試劑盒，但其并不對本發(fā)明有任何限定。試劑盒1第一試劑化合物A、聚陰離子第二試劑過氧化氫測定用試劑試劑盒2第一試劑化合物A、聚陰離子第二試劑過氧化氫測定用試劑試劑盒3第一試劑化合物A、化合物B酯水解酶第二試劑過氧化氫測定用試劑試劑盒4第一試劑化合物A、化合物B、聚陰離子、過氧化氫測定用試劑、過氧化氫測定用試劑、膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化氫測定用試劑、膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、聚陰離子、過氧化氫測定用試劑、膽甾醇、膽固醇氧化酶聚陰離子、過氧化氫測定用試劑、膽甾醇酯水解酶過氧化氫測定用試劑、膽固醇氧化酶聚陰離子、過氧化氫測定用試劑過氧化氫測定用試劑、膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化第二試劑過氧化氫測定用試劑、膽齒醇酯水解酶、膽固醇氧化酶試劑盒5第一試劑化合物A、第二試劑化合物B、試劑盒6第一試劑化合物A、第二試劑化合物B、試劑盒7第一試劑化合物A、第二試劑膽固醇脫氫酶試劑盒8第一試劑化合物A、聚陰離子第二試劑膽甾醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶試劑盒9第一試劑化合物A、化合物B、聚陰離子、氧化型輔酶、膽甾醇酯第二試劑膽固醇脫氫酶試劑盒10聚陰離子、氧化型輔酶、膽甾醇酯水解酶氧化型輔酶第一試劑化合物A、化合物B、聚陰離子、氧化型輔酶第二試劑膽甾醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶試劑盒11第一試劑化合物A、第二試劑化合物B、試劑盒12第一試劑化合物A、聚陰離子、氧化型輔酶第二試劑聚陰離子、氧化型輔酶、膽甾醇酯水解酶膽固醇脫氫酶化合物B、試劑盒13膽甾醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶第一試劑化合物A、聚陰離子、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑、膽甾醇酯水解酶第二試劑膽固醇脫氫酶試劑盒14第一試劑化合物A、聚陰離子、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑第二試劑還原型輔酶測定用試劑、膽固醇脫氫酶試劑盒15第一試劑化合物A、化合物B、聚陰離子、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑、膽甾醇酯水解酶第二試劑還原型輔酶測定用試劑、膽固醇脫氳酶試劑盒16笫一試劑化合物A、化合物B、聚陰離子、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑笫二試劑還原型輔酶測定用試劑、膽甾醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶試劑盒17第一試劑化合物A、聚陰離子、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑、膽甾醇酯水解酶第二試劑化合物B、還原型輔酶測定用試劑、膽固醇脫氫酶試劑盒18第一試劑化合物A、聚陰離子、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑第二試劑化合物B、還原型輔酶測定用試劑、膽甾醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶在本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑和試劑盒中，可以使用在前述的本發(fā)明的HDL膽固醇測定方法中列舉的化合物(I)、化合物(II)、聚陰離子、白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺、聚環(huán)氧乙烷烯基胺、膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶、過氧化氫測定用試劑、還原型輔酶測定用試劑。在本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑和試劑盒中，根據(jù)需要還可以含有水性介質(zhì)、穩(wěn)定劑、防腐劑、影響物質(zhì)消除劑、反應促進劑等。作為水性介質(zhì)，可以列舉，例如前述的水性介質(zhì)等。作為穩(wěn)定劑，可以列舉例如乙二胺四乙酸(EDTA)，蔗糖，氯化鈣等。作為防腐劑，可以列舉，例如疊氮鈉、抗生素等。作為影響物質(zhì)消除劑，可以列舉，例如用于消除抗壞血酸的影響的抗壞血酸鹽氧化酶等。作為反應促進劑，可以列舉，例如共脂肪酶，磷脂酶等酶，硫酸鈉，氯化鉤等鹽類等。在，也可以以溶解于水性介質(zhì)中的狀態(tài)存在。在^f吏用冷凍干燥狀態(tài)的試劑測定試樣中的HDL膽固醇時，將該試劑溶解于水性介質(zhì)中再使用。作為本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑和試劑盒中的膽甾醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶的含量，溶解于水性介質(zhì)中的狀態(tài)的濃度優(yōu)選達到0.01-1200U/mL的含量，更優(yōu)選達到0.02-600U/raL的含量。作為本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑和試劑盒中的化合物(I)或化合物(II)的含量，優(yōu)選為溶解于水性介質(zhì)中的狀態(tài)的濃度達到0.0001-3%的含量，更有效達到0.001-0.3°/。的含量。作為本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑和試劑盒中的聚陰離子的含量，優(yōu)選為溶解于水性介質(zhì)中的狀態(tài)的濃度達到0.001-30%的含量，更優(yōu)選達到0.01-3%的含量。作為本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑和試劑盒中的白蛋白的含量，優(yōu)選為溶解于水性介質(zhì)中的狀態(tài)的濃度達到0.001-3°/。的含量，更優(yōu)選達到0.01-0.3%的含量。作為本發(fā)明的HDL膽固醇測定用試劑和試劑盒中的聚環(huán)氧烷基胺或聚環(huán)氧乙烷烯基胺的含量，優(yōu)選為溶解于水性介質(zhì)中的狀態(tài)的濃度達到0.0001-3%的含量，更優(yōu)選達到0.001-0.3%的含量。以下，通過實施例對本發(fā)明進行詳細的說明，但其對本發(fā)明的范圍不作任何限定。而且，在本實施例中，使用了下述標記的試劑和酶。HEPES(BDH實驗室公司制)，EMSE(DAITOCHEMIX公司制)，硫酸鈉(關東化學公司制)，胺BB(十二碳胺，日本油脂公司制)，叔胺BB(十二烷基二甲胺，日本油脂公司制)，陽離子BB(十二烷基三甲基氯化銨)，葡聚糖硫酸鈉(分子量50萬)(Pharmacia公司制)，牛血清白蛋白(BSA;ProLiant7>司制)，4-氨酰安替比林(埼京化成社制)，過氧化物酶(東洋紡織社制)，43kDa酯酶(膽甾醇酯水解酶；天野酶公司制)，CHOPE(膽固醇氧化酶，Kikkoman公司制)，BLAUNONL205(聚氧乙烯月桂胺酯；青木油脂公司制)。實施例1制備了由以下的第一試劑(試劑A)和第二試劑(試劑a)構成的HDL膽固醇測定用試劑盒。第一試劑(試劑A)證ES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L石克酸鈉5.Og/L胺BB0.lg/L葡聚糖硫酸鈉1.0g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)1Ommol/L4-氨酰安替比林0.3g/L過氧化酶2QkU/L43kDa酯酶100kU/LCHOPE1.2kU/L實施例2制備了由以下的第一試劑(試劑B)和第二試劑(試劑a)構成的HDL膽固醇測定用試劑盒。第一試劑(試劑B)麼ES(pH7.5)1Ommol/LEMSE0.3g/L硫酸鈉5.Og/L叔胺BB0.03g/L葡聚糖硫酸鈉1.0g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨酰安替比林0.3g/L過氧化酶20kU/L43kDa酯酶100kU/LCHOPE1.2kU/L實施例3制備了由以下的第一試劑(試劑C)和第二試劑(試劑a)構成的HDL膽固醇測定用試劑盒。第一試劑(試劑C)證ES(pH7.5)1Ommol/LEMSE0.3g/L硫酸鈉5.Og/L陽離子BB0.14g/L葡聚糖硫酸鈉1.0g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)1Ommol/L4-氨酰安替比林0.3g/L過氧化酶2QkU/L43kDa酯酶100kU/LC證E1.2kU/L實施例4制備了由以下的第一試劑(試劑D)和笫二試劑(試劑a)構成的HDL膽固醇測定用試劑盒。第一試劑(試劑D)HEPES(pH7.5)1Ommol/LEMSE0.3g/L碌o酸鈉5.Og/L陽離子BB0.14g/L葡聚糖硫酸鈉1.0g/L0,3g/L20kU/L100kU/L1.2kU/LBSA2.Og/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)4-氨酰安替比林過氧化酶43kDa酯酶C麼E實施例5制備了由以下的第一試劑(試劑C)和第二試劑(試劑b)構成的HDL膽固醇測定用試劑盒。第一試劑(試劑C)HEPES(pH7.5)EMSE硫酸鈉陽離子BB葡聚糖硫酸鈉第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0)4-氨酰安替比林過氧化酶43kDa酯酶CHOPEBLAU醒L205實施例6制備了由以下的笫一試劑(試劑D)和第二試劑(試劑b)構成的HDL膽固醇測定用試劑盒。第一試劑(試劑D)鮮ES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L10mmol/L0.3g/L5.Og/L0.14g/L1.Og/L1Ommol/L0.3g/L20kU/L100kU/L1.2kU/L0.16g/L石克酸鈉5.Og/L陽離子BB0.14g/L葡聚糖硫酸鈉l.Og/LBSA2.Og/L第二試劑(試劑b)匿ES(pH7.0)1Ommol/L4-氨酰安替比林0.3g/L過氧化酶2GkU/L43kDa酯酶100kU/LCHOPE1.2kU/LBLAUNONL2050.16g/L比較例1制備了由以下的第一試劑(試劑E)和笫二試劑(試劑a)構成的HDL膽固醇測定用試劑盒。第一試劑(試劑E)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酸鈉5.Og/L葡聚糖硫酸鈉1.0g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)10隱1/L4-氨酰安替比林0.3g/L過氧化酶2QkU/L43kDa酯酶100kU/LCHOPE1.2kU/L實施例7使用實施例1的試劑盒，測定人血清30試樣中的HDL膽固醇。(l)標準曲線的制作使用生理鹽水(HDL膽固醇濃度0.Omg/dL)和血清(HDL膽固醇濃度80.Omg/dL)作為標準液，使用實施例1的試劑盒，通過日立7170S型自動分析裝置，制成表示HDL膽固醇濃度與"吸光度"的關系的標準曲線。這里所謂"吸光度"表示基于通過以下反應測定的兩個吸光度(El和E2)，由E2減去E1獲得的值。向反應器中添加標準液(2jaL)和第一試劑(0.15mL)，于37€加熱5分鐘，在主波長600nm,副波長700nm測定反應液的吸光度(El),接著，在該反應液中添加第二試劑(0.05mL),再于37。C加熱5分鐘，于主波長600nm，副波長700nm測定反應液的吸光度(E2)。(2)通過人血清試樣與實施例1的試劑盒的反應計算該試樣中的"吸光度"除了使用人血清試樣代替(1)的標準曲線的制備中使用的標準液之外，其余均與(l)的吸光度的計算方法相同的方法，計算該試樣中的"吸光度"。(3)人血清試樣中的HDL膽固醇濃度的測定根據(jù)由(2)計算出的"吸光度"和由(l)制備的標準曲線，測定各試樣中的HDL膽固醇濃度。實施例8除了使用實施例2的試劑盒代替實施例1的試劑盒之外，其余與實施例7的測定法相同，用日立7170型自動分析裝置測定人血清30試樣中的HDL膽固醇。實施例9除了使用實施例3的試劑盒代替實施例1的試劑盒之外，其余與實施例7的測定法相同，用日立7170型自動分析裝置測定人血清30試樣中的HDL膽固醇。實施例10除了使用實施例4的試劑盒代替實施例1的試劑盒之外，其余與實施例7的測定法相同，用日立7170型自動分析裝置測定人血清30試樣中的HDL膽固醇。實施例11除了使用實施例5的試劑盒代替實施例1的試劑盒之外，其余與實施例7的測定法相同，用日立7170型自動分析裝置測定人血清30試樣中的HDL膽固醇。實施例12除了使用實施例6的試劑盒代替實施例1的試劑盒之外，其余與實施例7的測定法相同，用日立7170型自動分析裝置測定人血清30試樣中的HDL膽固醇。比較例2除了使用比較例1的試劑盒代替實施例1的試劑盒之外，其余與實施例7的測定法相同，用日立7170型自動分析裝置測定人血清30試樣中的HDL膽固醇。接著，使用在實施例7-12和比較例2的測定中使用的人血清30試樣，通過記載于ClinicalChemistry第45巻，No.10(1999)的DCM法(DesignatedComparisonMethod)測定該試樣中的HDL膽固醇，比較各實施例和比較例中的測定值。各實施例和比較例的各個測定與通過DCM法進行的測定的相關系數(shù)示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>根據(jù)表1的比較例2與實施例7-12的比較，在使用含有化合物(I)或化合物(II)和聚陰離子的試劑盒的測定中，清楚了與DCM之間良好的相關關系。而且，根據(jù)實施例9與實施例10-12之間的比較，清楚了由于使化合物(I)或化合物(II)和聚陰離子之外與白蛋白或聚環(huán)氧乙烷烷基胺共存，與DCM之間的相關系數(shù)進一步提高。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明，可以提供對于動脈硬化等疾病的診斷有用的HDL膽固醇的測定方法、測定用試劑和測定用試劑盒。權利要求1、試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于，使i)膽甾醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者ii)膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶，在含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(II)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)、以及聚陰離子的水性介質(zhì)中與試樣反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶；(式中，R1表示直鏈或支鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R7相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。2、根據(jù)權利要求1記載的方法，其中，水性介質(zhì)還含有選自于白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)。3、根據(jù)權利要求1或2記載的方法，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。4、高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑，其特征在于其含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(n)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)、聚陰離子、膽甾醇酯水解酶和膽固醇氧化酶和過氧化氫測定用試劑；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(式中，R'表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)(式中，115表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和IT相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。5、高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑，其特征在于含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(II)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)、聚陰離子、膽甾醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶和氧化型輔酶；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(I)(式中，W表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R'相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。6、根據(jù)權利要求5記載的試劑，其中還含有還原型輔酶。7、根據(jù)權利要求4-6任一項記載的試劑，其中還含有選自于白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)。8、根據(jù)權利要求4-7任一項記載的試劑，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。9、高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，含有第一試劑和第二試劑，其特征在于在第一試劑中含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(n)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)和聚陰離子，第二試劑中含有膽固醇氧化酶，第一試劑、第二試劑中的任一種或二者中含有過氧化氫測定用試劑，第一試劑、第二試劑中的任一種或二者中含有膽甾醇酯水解酶；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(i)(式中，R'表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，R3和R4相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(ii)(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R7相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。10、高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，含有第一試劑和第二試劑，其特征在于在第一試劑中含有選自于通式(I)表示的物質(zhì)和通式(II)表示的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)和聚陰離子，第二試劑中含有膽固醇脫氫酶，第一試劑、第二試劑中的任一種或二者中含有氧化型輔酶，第一試劑、第二試劑中的任一種或二者中含有膽甾醇酯水解酶；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(式中，f表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R2表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為l-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基，113和114相同或不同，分別表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-6的烷基或碳原子數(shù)為2-6的烯基，X表示陰離子)，>——r7(ii)r6Z(式中，R5表示直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為6-30的烷基或烯基，R6和R'相同或不同，分別表示氫原子、直鏈或分鏈的碳原子數(shù)為1-30的烷基或碳原子數(shù)為2-30的烯基)。11、根據(jù)權利要求10記載的試劑盒，其中，第一試劑、第二試劑中的任一種或兩者中還含有還原型輔酶測定用試劑。12、根據(jù)權利要求9-11任一項中記載的試劑盒，其中，笫一試劑、第二試劑中的任一種或兩者中還含有選自于白蛋白、聚環(huán)氧乙烷烷基胺和聚環(huán)氧乙烷烯基胺中的至少一種物質(zhì)，第一試劑、第二試劑中的任一種或兩者中還含有膽甾醇酯水解酶。13、根據(jù)權利要求9-12任一項中記載的試劑盒，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。全文摘要本發(fā)明提供了一種簡便的，并且可以正確測定的HDL膽固醇的測定試劑、測定用試劑和測定用試劑盒。試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于使i)膽甾醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或者ii)膽甾醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶，在含有具有胺或銨鹽結構的特定的含氮表面活性劑和聚陰離子的水性介質(zhì)中與試樣反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶。文檔編號C12Q1/26GK101166831SQ20068001421公開日2008年4月23日申請日期2006年4月27日優(yōu)先權日2005年4月27日發(fā)明者片山有基,藤中真由美申請人:協(xié)和梅迪克斯株式會社