專利名稱:定量測定膽固醇的方法
本發(fā)明涉及一種測定高密度脂蛋白中膽固醇的方法，該方法不需要象離心分離這樣的預(yù)處理，而且有效地提供了僅需少量試樣的簡單分析方法。
象膽固醇這樣的血清類脂與脫輔基蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白。根據(jù)物理性質(zhì)的不同，脂蛋白可分類為乳糜微粒、很低密度的脂蛋白、低密度脂蛋白(LDLs)和高密度脂蛋白(HDLs)。在這些脂蛋白中，LDLs是致動脈粥樣化的，而HDLs具有抗動脈粥樣化的作用。
高密度脂蛋白中膽固醇含量與動脈硬化發(fā)病率有關(guān)已經(jīng)在流行病學(xué)上得到證實(shí)。為了預(yù)測和診斷局部缺血疾病，測定高密度脂蛋白中的膽固醇現(xiàn)在是相當(dāng)普遍的。
已知道幾種方法用于測定高密度脂蛋白中的膽固醇。例如，在一種方法中，膽固醇是在使用超離心作用把高密度脂蛋白從其它脂蛋白中分離后測定的。在另一種方法中，類脂在用電泳法分離后染色，而且測定顯色強(qiáng)度。但是，這些方法都有些問題，象復(fù)雜的步驟、不能處理許多試樣等等。因此，這些方法沒有在臨床實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用。
在臨床實(shí)驗(yàn)室中，測定高密度脂蛋白中膽固醇最廣泛采用的方法是沉淀法。在沉淀法中，沉淀劑加到試樣中來凝結(jié)除高密度脂蛋白之外的脂蛋白，凝結(jié)的脂蛋白通過離心分離而沉淀，測定只含高密度脂蛋白的上清液中存在的膽固醇。
盡管這種方法比超速離心或電泳更簡單，但不是所有的分析步驟可以是完全自動的。因?yàn)檫@種方法包括使用離心作用的分離操作。與其它自動的臨床測試相比，在這種方法中，為獲得只含高密度脂蛋白的上清液的手動過程增加了造成分析誤差的危險，而且需要較多量的試樣。
另一方面，研究了使用酶分級測定高密度脂蛋白中膽固醇的方法。例如，在已知的一種方法中，在膽汁酸鹽或非離子表面活性劑存在的情況下進(jìn)行酶反應(yīng)(日本專利申請公開No.63-126,498)。酶反應(yīng)速率在反應(yīng)開始階段與低密度脂蛋白的濃度成正比，此后與高密度脂蛋白中膽固醇濃度成正比，這種方法是以此為根據(jù)的。這種方法不能說是精確的，因?yàn)榕c高密度脂蛋白中膽固醇的酶反應(yīng)不能同與其它脂蛋白的酶反應(yīng)完全區(qū)分開。換句話說，在酶反應(yīng)條件下，低密度脂蛋白中的膽固醇轉(zhuǎn)變到高密度脂蛋白中的膽固醇不是以分步的方式而是以部分重迭的逐漸的方式進(jìn)行的。
根據(jù)另一種已知方法，將除高密度脂蛋白之外的脂蛋白預(yù)先凝結(jié)，而且只有高密度脂蛋白中的膽固醇是酶反應(yīng)的。此后，使酶失活，凝結(jié)的脂蛋白同時再溶解以測定吸收性(日本專利申請公開No.6-242,110)。這種方法至少需要加入試劑三次。因此，這種方法只能用于有限的分析儀，導(dǎo)致有關(guān)使用范圍方面的缺陷。另外，在重新溶解沉淀物時，需使用高濃度的鹽。因此，不論從對分析儀器有害的角度看，還是從處理廢試劑困難的角度看，這種方法都不令人滿意。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種定量測定高密度脂蛋白中膽固醇的方法，該方法消除了象離心分離這樣的預(yù)處理的必要性，有效地提供了簡單的測量并且該方法可應(yīng)用于各種自動分析儀。
在如前所述的情況下，本發(fā)明人已進(jìn)行了精心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果一種試樣在與一種表面活性劑和一種與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白形成配合物的物質(zhì)混合后，再進(jìn)行膽固醇的酶法測量，就可以用自動分析儀有效地定量測定高密度脂蛋白中的膽固醇。這導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。
本發(fā)明涉及一種定量測定高密度脂蛋白中膽固醇的方法，其特征在于，試樣中膽固醇的測定是在該試樣中加入一種表面活性劑和一種與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白形成配合物的物質(zhì)后進(jìn)行的。
在本發(fā)明中使用的與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白形成配合物的物質(zhì)可以是與高密度脂蛋白的親和力不同于與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白的親和力的任何物質(zhì)。這類物質(zhì)的例子包括象糊精硫酸鹽、磷鎢酸和肝素這樣的聚陰離子；象鎂離子和鈣離子這樣的二價金屬離子；象聚乙二醇這樣的水溶性聚合物；和針對除高密度脂蛋白之外的脂蛋白的抗體。它們可以單獨(dú)或兩種結(jié)合或兩種以上結(jié)合使用。在這些可能性中，聚陰離子與二價金屬離子的結(jié)合是優(yōu)選的。
這些物質(zhì)的使用量不受特別限制，根據(jù)物質(zhì)種類而不同。這些物質(zhì)在測定時與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白形成配合物就足夠了。凝結(jié)可能發(fā)生或不可能發(fā)生。例如，當(dāng)一種聚陰離子與一種二價金屬離子結(jié)合使用時，當(dāng)它們與試樣混合后優(yōu)選的是聚陰離子濃度為0.02～2wt％，二價金屬離子為10～500mM。更優(yōu)選的情況是，聚陰離子濃度為0.05～1wt％，二價金屬離子為20～200mM。
本發(fā)明中使用的表面活性劑最好對用于檢測膽固醇和脂蛋白的多種酶之間的相互作用有抑制效果，換句話說，表面活性劑最好不溶解脂蛋白。這類表面活性劑的例子包括聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚，聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合產(chǎn)物，聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽和烷基苯磺酸鹽。聚氧乙烯烷基醚的優(yōu)選實(shí)例包括聚氧乙烯十六烷基醚(HLB14)(作為商品，有Kao Corp.等生產(chǎn)的Emulgen 220)。聚氧乙烯烷基苯基醚的優(yōu)選實(shí)例包括聚氧乙烯壬基苯基醚(HLB15)(作為商品，有Kao Corp.等生產(chǎn)的Emulgen 913)。聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合產(chǎn)物的優(yōu)選實(shí)例包括Asahi Denka K.K.生產(chǎn)的市場上買得到的Pluronic F88。聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽的優(yōu)選實(shí)例包括聚氧乙烯十二烷基醚硫酸鈉(作為商品，有Kao Corp.等生產(chǎn)的Emal20C)。烷基苯磺酸鹽的優(yōu)選實(shí)例包括十二烷基苯磺酸鈉。
這些表面活性劑可以單獨(dú)使用或者兩種或兩種以上表面活性劑結(jié)合使用。盡管它們的用量不受特別限制，但與一種試樣混合后，在這樣的用量中，優(yōu)選使用的濃度是0.01-5wt％，特別優(yōu)選的濃度是0.05-1wt％。
在本發(fā)明中，一種表面活性劑和一種與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白形成配合物的物質(zhì)加到一種試樣中。這兩種物質(zhì)可以在混合后作為一種試劑加入，或者它們可以作為兩種獨(dú)立的試劑加入。
然后，對已加入表面活性劑和與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白形成配合物的物質(zhì)的試樣直接測定膽固醇。即不需要象離心分離這樣的預(yù)處理。
任何酶學(xué)方法可用于測定膽固醇。例如，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶可作為酶試劑結(jié)合使用。另一方面，膽固醇酯酶與膽固醇脫氫酶可以結(jié)合使用。在這些酶方法中，膽固醇酯酶與膽固醇氧化酶結(jié)合使用的方法是優(yōu)選的。
加入一種酶后，測定一定時間內(nèi)的信號量，以此確定膽固醇的濃度。為提高分析的準(zhǔn)確性，在加入酶后，可以比較兩個確定時間點(diǎn)之間的信號量(兩點(diǎn)法)。為了校準(zhǔn)的目的，相似地分析一種已知高密度脂蛋白值的試樣。
在加入酶試劑后的最后階段，測定膽固醇的方法不受特別限制。例如，可以使用一種吸收分析法，其中過氧化物酶與色原結(jié)合；也可使用檢測輔酶和過氧化氫的方法。
簡單地說，4μl試樣與含0.2％磷鎢酸、100mM氯化鎂和0.5％的聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物(Asahi Denka K.K.生產(chǎn)的P1uronic F-68)的300μl試劑混合。隨后加入含有0.2U/ml膽固醇酯酶、0.2U/ml膽固醇氧化酶、0.3U/ml過氧化物酶、0.04％N,N-二甲基間甲苯胺、0.05％氨基安替比林和0.1％Triton×-100的100μl膽固醇測定試劑。其后，監(jiān)測545mm處吸收度的變化，通過把這一吸收度的變化與已知高密度脂蛋白值的試樣的吸收度變化相比較來獲得高密度脂蛋白中膽固醇的濃度。用Hitachi公司的型號為7150的自動分析儀進(jìn)行上述操作。
在獨(dú)立使用一種沉淀法測定高密度脂蛋白中膽固醇時，含0.3％葡聚糖硫酸鹽和2％氯化鎂的水溶液0.2ml與0.2ml的試樣混合。以3000rpm對混合物離心分離10分鐘。收集50μl上清液并與如上所述配制的3ml膽固醇測定試劑相混合，隨后在37℃溫育10分鐘。測定545nm處的吸收情況，獲得高密度脂蛋白中膽固醇濃度。
表1試樣號 膽固醇濃度 (mg/dl)本發(fā)明方法 沉淀法1 79 802 65 643 64 644 64 585 15 186 81 887 47 488 38 389 47 4610 33 32從表1中結(jié)果看，可理解的是，盡管本發(fā)明的方法是簡單的，但所得的數(shù)據(jù)可與用傳統(tǒng)方法所得數(shù)據(jù)相比。
表2試樣號 膽固醇濃度 (mg/dl)本發(fā)明方法 沉淀法11 47 4512 38 3413 36 3214 54 5215 26 2216 93 9217 61 6218 36 3219 55 5020 75 74從表2中結(jié)果看，可理解的是，盡管本發(fā)明的方法是簡單的而且僅需少量試樣，但所得的數(shù)值可與通過傳統(tǒng)方法所得數(shù)值相比。
根據(jù)本發(fā)明，通過簡單的方法可有效地測定高密度脂蛋白中的膽固醇。此方法不需要象離心分離這樣的任何預(yù)處理。因?yàn)榇朔ㄓ蒙倭吭嚇雍秃唵尾僮魈峁┒康臏y定，所以可以在各種自動分析儀中采用。因此，此法在臨床化驗(yàn)領(lǐng)域是非常有用的。
權(quán)利要求
1．一種定量測定高密度脂蛋白中膽固醇的量的方法，它包括將含有高密度脂蛋白和除高密度脂蛋白之外的脂蛋白的試樣與一種表面活性劑和一種物質(zhì)接觸，形成所述物質(zhì)與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白的配合物，其中所述表面活性劑不溶解高密度脂蛋白或除高密度脂蛋白之外的脂蛋白；和在所述物質(zhì)與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白的配合物存在下，酶法定量測定高密度脂蛋白中的膽固醇的量。
2．權(quán)利要求
1的方法，其中所述物質(zhì)包括一種聚陰離子、一種二價金屬離子、一種水溶性聚合物或者一種針對除高密度脂蛋白之外的脂蛋白的抗體。
3．權(quán)利要求
2的方法，其中所述物質(zhì)包括糊精硫酸鹽、磷鎢酸、肝素、鎂離子、鈣離子或聚乙二醇。
4．權(quán)利要求
1的方法，其中所述表面活性劑選自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合產(chǎn)物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽和烷基苯磺酸鹽。
5．權(quán)利要求
4的方法，其中所述表面活性劑是聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸鈉或十二烷基苯磺酸鈉。
6．權(quán)利要求
1的方法，其中用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶酶法定量測定高密度脂蛋白中的膽固醇。
專利摘要
一種定量測定高密度脂蛋白中膽固醇的方法，其中，在用酶法測定膽固醇之前，向含有脂蛋白的試樣中加入一種表面活性劑和一種與除高密度脂蛋白之外的脂蛋白形成配合物的物質(zhì)。該方法不需要象離心分離這樣的任何預(yù)處理步驟。簡單操作就可有效測定HDLs中的膽固醇。本方法同樣可以用于各種自動分析儀，因而在臨床測定領(lǐng)域中非常有用。
文檔編號G01N33/92GKCN1072724SQ95192343
公開日2001年10月10日 申請日期1995年4月3日
發(fā)明者日野浩一, 中村光浩, 真鍋滿久 申請人:第一化學(xué)藥品株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan