專利名稱：參與HEP G2細(xì)胞中膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)的大豆7S球蛋白α’亞基延伸區(qū)的克隆、酵母表達(dá)、純化和 ...的制作方法
參與HEP G2細(xì)胞中膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)的大豆7S球蛋白a ’亞基延伸區(qū)的克隆、酵母表達(dá)、純化和生物學(xué)活性

本發(fā)明涉及對應(yīng)天然a ’亞基的N端親水片段的大豆7S球蛋白的重組a ’片段，它的制備方法和含有它的組合物，在所述組合物中它作為控制膽固醇和甘油三酯內(nèi)穩(wěn)態(tài)有用的活性成分。
背景技術(shù)：
在高膽固醇血癥患者的血脂水平的控制中，膳食大豆蛋白作用的是廣為接受的問題[I]。在以前的研究中[2-4]，在體內(nèi)和體外系統(tǒng)中說明了大豆7S球蛋白的一個亞基，a ’亞基，直接涉及LDL-受體的增量調(diào)節(jié)，表明通過細(xì)胞酶加工很可能產(chǎn)生有生物學(xué)活性的，能夠調(diào)節(jié)膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)的(多)肽。天然的7S球蛋白由三個隨機(jī)組合的、通過不同基因編碼的多肽鏈，a’、a和3亞基組成[5]。成熟的a ’ (登錄號P11827UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫)和a鏈(登錄號P13916UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫)共享約145個氨基酸殘基的延伸的N端區(qū)，在^亞基(登錄號P25974UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫)中缺少所述N端區(qū)。基于a ’延伸區(qū)的特有的氨基酸序列，通過金屬親和色譜純化此亞基并且將其對高膽固醇血癥的大鼠口服施用，因而容許顯示它的血漿降脂性質(zhì)和肝P-VLDL受體的增量調(diào)節(jié)[4]。在另一方面，由于a ’亞基的分子量約為71kDa[6]，它似乎不可能體內(nèi)穿越腸屏障而沒有修飾。因此，我們的研究指向?qū)ふ覍?dǎo)致藥理學(xué)作用的a ’亞基的氨基酸序列。由于三個亞基的核心區(qū)具有較多的相似的氨基酸序列，可以想到生物學(xué)活性應(yīng)該存在于延伸區(qū)的一個或多個(多)肽中。原則上，a ’和a鏈的延伸區(qū)之間局部的但顯著的氨基酸差異將限制導(dǎo)致生物學(xué)活性的肽的數(shù)目。從這些以前的陳述中，尋求的第一策略是檢測HepG2細(xì)胞中的多肽和合成多肽對LDL-受體(LDL-R)調(diào)節(jié)的作用，所述H印G2細(xì)胞中的多肽獲取自CroksoyK70的體外消化(胃蛋白酶/胰蛋白酶)，所述Crokso/70是在食品治療高膽固醇血癥患者中常規(guī)使用的無異黃酮大豆?jié)饪s物[7-8]，所述合成的肽對應(yīng)于7S大豆球蛋白亞基之間不同的特定氨基酸序列。在這些研究中獲得的結(jié)果指出，在暴露于CrokSoyK70的酶消化產(chǎn)物和來自7S大豆球蛋白的小合成肽(2，271Da)的H印G2細(xì)胞中，能夠誘導(dǎo)顯著的LDL-R增量調(diào)節(jié)，所述酶消化產(chǎn)物具有在3，000到20，OOODa范圍內(nèi)的MW，并以KT4M濃度將所述小合成肽加入細(xì)胞。用小肽獲得的研究現(xiàn)在仍處于研究中且迄今尚未明確[10]。大豆蛋白的降低膽固醇和甘油三酯的能力是已證實的問題。大豆蛋白膳食是當(dāng)今治療高膽固醇血癥患者的最有力的膳食工具，因而為管理成人和非常年輕的對象提供了獨(dú)特的機(jī)會。而且，明確地確立在具有高基線程度的膽固醇血癥患者中血漿膽固醇降低更多[14]。蛋白質(zhì)本身降低血膽固醇的假說起于實驗研究，所述研究表明膳食中從動物到植物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換激活實驗動物的肝臟[15]，以及高膽固醇血癥患者的循環(huán)淋巴單核細(xì)胞中的LDL受體系統(tǒng)。為了鑒定導(dǎo)致降膽固醇作用的大豆蛋白組分，用人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞、系實施體外研究，所述細(xì)胞系對調(diào)節(jié)LDL受體表達(dá)和膽固醇生物合成/分解的因子高度敏感。在H印G2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)從7S大豆球蛋白純化的a ’亞基增量調(diào)節(jié)LDL受體[3]并且在膽固醇飼養(yǎng)的大鼠中證實此發(fā)現(xiàn)[4]。盡管這些數(shù)據(jù)支持蛋白質(zhì)部分導(dǎo)致觀察到的生物效應(yīng)的假說，可對a ’鏈體內(nèi)生物學(xué)命運(yùn)提出爭論，因為通常通過胃和/或腸蛋白分解酶的作用生產(chǎn)肽和氨基酸。然而，聲稱越來越多的動物和植物(多)肽起相關(guān)的調(diào)節(jié)功能，通常歸因于抗氧化、抗增殖和抗炎效應(yīng)[17]。對大豆而言，實驗證據(jù)明確地表明了可吸收肽和更小的緊密蛋白質(zhì)(例如Bowman-Birk抑制物)的可能性[18]，因而誘發(fā)很多效應(yīng)，包括抗癌、抗炎、放射保護(hù)性效應(yīng)[19]。也已經(jīng)顯示了遺傳修飾的大豆(多)肽引發(fā)生物學(xué)應(yīng)答，比如低血壓效應(yīng)[20]。最近，已經(jīng)從大豆水解產(chǎn)物鑒定了衍生自7S球蛋白P鏈的LDL-R轉(zhuǎn)錄模擬肽(FVVNATSN),所述水解產(chǎn)物通過來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶并隨后通過化學(xué)合成制備[21]。在這種情況下，在暴露于100 y M濃度妝的Hep G2細(xì)胞中檢測到增加的LDL-R轉(zhuǎn)錄(+148%)。已經(jīng)顯示了源自IlS球蛋白的其他肽產(chǎn)生相似但是較低的活性[21]。
將需要使得可獲得的較短的多肽維持或甚至提高全長蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)。發(fā)明描述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所謂的對應(yīng)其N端側(cè)的大豆7S球蛋白的a ’延伸區(qū)具有有利的生物學(xué)活性并且已被證明在LDL吸收和降解上比全尺寸a ’鏈甚至更有效。因此本發(fā)明提供了所述a ’延伸區(qū)(在下文中稱為e a ’)，以及通過克隆、酵母表達(dá)和純化重組多肽制備它的方法，所述重組多肽含有大豆a ’亞基的N端延伸區(qū)。為此目的，采用a ’鏈的N端片段的異源表達(dá)。在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)的分泌-感受態(tài)的酵母細(xì)胞中達(dá)成目標(biāo)。純化重組多肽并在H印G2細(xì)胞中評價它的生物學(xué)活性。通過使用此生物技術(shù)方法，能夠獲得足夠量的重組多肽以在體外試驗而且也在體內(nèi)實驗中測試。附圖
描述圖IpPICZ a B-e a ’構(gòu)建體的概觀。e a ’的表達(dá)由AOX(醇氧化酶)甲醇可誘導(dǎo)的啟動子(5’ AOXI)驅(qū)動；a交配因子(a -MF)促進(jìn)重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中；A0X1TT A0X轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。Sh ble基因賦予對zeocin的抗性；pUC Ori :大腸桿菌中高數(shù)量質(zhì)粒拷貝的復(fù)制起點(diǎn)。其他縮寫指限制酶的切割位置；bp :堿基對。圖2重組多肽(e a ’)和野生型大豆a ’亞基的序列比對。星表明兩個序列中相同的氨基酸殘基。圖2A重組多肽(e a ) ’的序列(SEQ IDl)圖2B野生型大豆a ’亞基的序列(SEQ ID2)圖3A重組巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物的還原條件下的SDS-PAGE 第M道分子重量標(biāo)志物第I道在用甲醇誘導(dǎo)以前TCA沉淀的培養(yǎng)物上清液(無細(xì)胞)。第2道在用甲醇誘導(dǎo)I小時以后TCA沉淀的培養(yǎng)物上清液(無細(xì)胞)。第3道在用甲醇誘導(dǎo)8小時以后TCA沉淀的培養(yǎng)物上清液(無細(xì)胞)。第4道在用甲醇誘導(dǎo)19小時以后TCA沉淀的培養(yǎng)物上清液(無細(xì)胞)。第5道在用甲醇誘導(dǎo)25小時以后TCA沉淀的培養(yǎng)物上清液(無細(xì)胞)。
圖3B e a ’純化步驟的還原條件下的SDS-PAGE第M道分子重量標(biāo)志物第I道發(fā)酵肉湯的凍干粉第2道DEAE_纖維素150mM NaCl洗脫的級分
第3道DEAE-纖維素250mM NaCl洗脫的級分發(fā)明詳述現(xiàn)在在以下實驗部分中將詳細(xì)描述本發(fā)明
材料和方法
酵母、細(xì)菌株和化學(xué)品。巴斯德畢赤酵母X33 (WT)菌株(Invitrogen, San Diego,CA)用于酵母表達(dá)。遺傳操作使用的細(xì)菌株為大腸桿菌XLl-Blue (Invitrogen, San Diego,CA)。限制酶 Pst I 和Xba I 購自 Roche (Indianapolis, IN), Sac I 來自 Fermentas (Ontario,Canada) Taq DNA 聚合酶購自 Invitrogen (San Diego, CA)。Zeocin 購自 Invivogen (SanDiego, CA)。PCR的寡核苷酸獲取自Primm(Milano,意大利)。蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂購自Becton Dickinson and Company (Sparks, MD)。葡萄糖和山梨糖醇購自Sigma (St. Louis MO)。透析膜購自 Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA)。DEAE樹脂購自 Whatman (Maidstone, England)。NiNTA 樹脂購自 Qiagen (Hilden,德國)。對稱C4HPLC 柱購自 Waters (Milford, MA)。其他化學(xué)品為來自Sigma (St. Luis, MO)或來自Merck (Darmstadt,德國)的試劑純。培養(yǎng)基和生長環(huán)境。在YPD (酵母蛋白胨葡萄糖)完全培養(yǎng)基(2%蛋白胨、I %酵母提取物、2%葡萄糖)中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母X33菌株。在含有YPD、I. 5%瓊脂、IOOmg/mLzeocin的平板中選擇Mut+轉(zhuǎn)化體。將全部酵母培養(yǎng)物維持在30°C。對于異源蛋白質(zhì)檢測，在YPS(酵母蛋白胨山梨糖醇)培養(yǎng)基(2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%山梨糖醇)中培養(yǎng)Zeolr-Mut+轉(zhuǎn)化體至600nm光密度為5。然后加入甲醇至最終濃度I %。在含有zeocin的低鹽LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基(I %胰蛋白胨、0. 5 %酵母提取物、0. 5 %氯化鈉、I. 5 %瓊脂、25mg/mL zeocin)的平板中選擇全部細(xì)菌轉(zhuǎn)化體。將全部細(xì)菌培養(yǎng)物維持在37°C。構(gòu)建ea’基因表達(dá)載體。通過PCR在表達(dá)巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒DNA模板(PPICZaB)上擴(kuò)增ea ’基因，所述模板含有包含目標(biāo)序列(e a ’)的插入片段。設(shè)計寡核苷酸5’ -GAAAAGATAGATTAAAGCTGCAGTGGAGGAAG-3，以在 e a ’ 基因的 5’ 端生成 PstI 限制位點(diǎn)。此突變導(dǎo)致丙氨酸殘基插入于e a ’的N端位置中。設(shè)計又一個寡核苷酸5’ -CCCTTCTTATTCTTTCTAGATCATGGTTCTCTTTGAGACTC-3’ 以在 ea’基因的 3’端生成XbaI限制位點(diǎn)。將兩個寡核苷酸都溶解于mQ無菌水中。PCR反應(yīng)混合物由0. 5mM引物、0. 8mM dNTP (Eppendorf, Hamburg,德國)、30ng 模板(pPICZ a B /t a ’)、2.5U Taq DNA 聚合酶、PCR 緩沖液(最終組成50mM KCl、1.5mM MgCl2,20mM Tris-Cl.pH 8. 4 和 mQ 無菌水至最終體積25mL)組成。使用如下條件在Perkin Elmer Geneamp PCR System 2400熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Corp. , Wellesley, MA)上實施 PCR 擴(kuò)增起始于 94°C達(dá) 10 分鐘；30個循環(huán)的于94°C達(dá)40秒，60°C達(dá)40秒，72°C達(dá)20秒；最終延伸72°C達(dá)10分鐘并且維持在40C。酶消化465bp的PCR產(chǎn)物至423bp的全尺寸構(gòu)建體，并且將它克隆入pPICZ a B載體獲取pPICZ a B-e a ’構(gòu)建體并且轉(zhuǎn)化入XLl-Blue大腸桿菌細(xì)胞中。在含有四環(huán)素和zeocin的半固態(tài)LB培養(yǎng)基上選擇陽性克隆。將這些克隆中的一個通過Primm(Milano,意大利)測序以保證在pPICZ a B-e a ’構(gòu)建體序列中沒有突變發(fā)生。通過用限制酶SacI消化將20 y gpPICZaB-e a ’構(gòu)建體和30 y g表達(dá)載體pPICZ a B (陰性對照)線性化并然后純化。在巴斯德畢赤酵母基因組中轉(zhuǎn)化pPICZaB-e a ’。用20 ii g線性化的pPICZ a B~e a ’ 構(gòu)建體和 30 U g 線性化的 pPICZ a B 在設(shè)為 I. 5kV 的 Eppendo rf (Hamburg,德國)電穿孔儀2510設(shè)備上通過電穿孔轉(zhuǎn)化野生型(wt)酵母細(xì)胞。首先通過鋪平板在含有l(wèi)OOmg/mL zeocin的YPD平板上選擇轉(zhuǎn)化體。為了證實我們的構(gòu)建體整合入轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母基因組，使用Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN，Hilden，德國)以提取基因組 DNA。通過使用 5’ AOXl (5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ')和 3’ AOXl 引物(5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')的PCR，使用基因組DNA作為模板以驗證構(gòu)建體在醇氧化酶啟動子(A0X1)位點(diǎn)的插入。PCR反應(yīng)混合物由0. 5mM引物、0. 25mM dNTP、IOOng基因組模板、2. 5U Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液(最終組成如上)組成。使用如下條件實施PCR反應(yīng)起始于94°C達(dá)10分鐘；30個循環(huán)的于94°C達(dá)40秒，60°C達(dá)40秒，72°C達(dá)20秒；最終延伸72°C達(dá)10分鐘并且維持在4°C。轉(zhuǎn)化體克隆選擇。在震蕩(180rpm)培養(yǎng)器中的30°C 50mL YPS培養(yǎng)基中生長18個Zeo+轉(zhuǎn)化體和I個含有pPICZ a B表達(dá)載體(陰性對照)的轉(zhuǎn)化體至0D_ = 5。誘導(dǎo)期通過加入甲醇至最終濃度1%引發(fā)并且延長至24小時。通過SDS-PAGE檢測上清液等份試樣的ea ’表達(dá)。選擇具有最高ea ’表達(dá)的克隆轉(zhuǎn)化體用于重組蛋白質(zhì)發(fā)酵罐規(guī)模的生產(chǎn)。ea’表達(dá)發(fā)酵罐規(guī)模。為了大量生產(chǎn)，根據(jù)Invitrogen的“畢赤酵母發(fā)酵過程指南”(版本B,053002)在14L發(fā)酵罐(Chemapj^i)中生長選擇的克隆。在不帶擋板的搖瓶中的 YNB 培養(yǎng)基(KH2PO4 2. Og ； (NH4)2SO4 10.0g;MgS04 IW2Q 1.0g;NaCl 0. 2g ；CaCl2 0.28;100%甘油10.(^;1(011至？11 5. 2 ;蒸餾水至I. 0L)上制備接種物培養(yǎng)物。在30°C，250rpm孵育約24小時后，使用I. OL種子培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐，用8. 5L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(Basal Salt Medium) (H3PO4 85% 227mL ；CaSO4 2H20 7. 9g ；K2S04 155g ；MgS04 7H20 127g ；KOH 35g;100%甘油340g;蒸餾水至8. 5L;在滅菌后用NH4OH將pH調(diào)節(jié)至5. 0)制備所述發(fā)酵罐。用生物素和肌醇(各lmg/L)補(bǔ)充引用的兩個培養(yǎng)基。也用修改的PTM1痕量鹽溶液(Trace Salt Solution) (H2SO4 96% 2. 5mL ；CoC2O4. 2H20 243mg ；CuSO4. 5H20 3. Og ；KI44. 5mg ；MnSO4= H2O I. 5g ；Na2MoO4= 2H20 IOOmg ；H3BO3 IOmg ;FeS04。7H20 32. 5g ；ZnCl2 IOg ；蒸餾水至500mL)補(bǔ)充基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。通過三步過程獲得微生物的生長和異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。約24小時的第一批生長階段(甘油作為碳源)，接著是約4小時的補(bǔ)料分批階段(甘油作為限制性碳源)。在首先的這兩個階段期間，通過加入20% NH4OH將pH維持在5. O。一旦全部甘油被消耗，起始甲醇補(bǔ)料以引發(fā)e a ’蛋白表達(dá)并且通過加入20^NH4OH將pH改變至6. O。甲醇補(bǔ)料分批階段持續(xù)約24小時。在這兩個補(bǔ)料分批階段，通過攪拌器速度(rpm)的精密電子控制，而手動漸進(jìn)地提高通氣速率(vvm)將溶解氧(Dissolved Oxygen) (D0% )穩(wěn)定維持在30%。每幾個小時，通過跟隨D0%水平檢查碳源限制性環(huán)境在突然停止甲醇補(bǔ)料后它的數(shù)據(jù)應(yīng)該顯示急劇增加，并且反之亦然，在恢復(fù)甲醇之后迅速降低。每幾個小時，從發(fā)酵罐中在無菌環(huán)境下取得樣品，用于下述分析光密度(X 600nm)、細(xì)胞生物質(zhì)％ (濕重)、無菌、顯微鏡觀察、SDS-PAGE。e a，純化發(fā)酵肉湯的下游加工。將約9. 2L培養(yǎng)物從發(fā)酵罐中流出并且在冰上冷卻。在+4°C實施全部隨后的操作。通過在3，OOOXg達(dá)30分鐘離心(Centrikon T-124，Kontron Instruments)分離全部培養(yǎng)物；丟棄生物質(zhì)(片狀沉淀物)；通過在Zetaplus30SP (Cuno)上深度過濾澄清約7. 5L上清液，并且隨后在0. 22 y m過濾器(Millipak 100，Millipore)上微過濾上清液。通過在MWCO IOkDa的聚醚砜膜(Omega filter, PalD上超濾濃縮澄清的濾液。濃縮物，約300mL，對3. OL Tris-HCl IOmM pH 7. 2滲濾并最終被低壓凍干。用這個流程獲得34. 5g凍干粉，在SDS-PAGE上顯示了相當(dāng)?shù)统潭鹊奈廴疚锏鞍踪|(zhì)并且具有約25% p/p的總蛋白質(zhì)含量(Bradford Protein Assay,牛血清白蛋白作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn))。e a，純化色譜純化。為了更高性能的凝膠電泳，根據(jù)提供者的流程使用]VllPAGE Pre-Cast GelSystem(Invitrogen)。將兩克凍干粉溶解于150mL 50mMTris-HCl, pH 7. 50中并且將其裝 載到用相同的緩沖液平衡的DEAE-纖維素柱上(6X 10cm, Whatman, Maidstone, UK)。用分別含有150和250mMNaCl的相同緩沖液實施保留的蛋白質(zhì)的洗脫。用0. 25M NaCl (300mL)洗脫的級分展示了 ea’的最大含量。通過冷凍-干燥將溶液濃縮至IOOmL,并且隨后用6000-8000Da膜在4°C用milliQ超濾水透析溶液24小時并隨后冷凍干燥。獲得約370mg蛋白質(zhì)。為了驗證蛋白的均質(zhì)性,將約Img蛋白質(zhì)裝載到對稱C4(4. 6X250mm)反相柱上。使用緩沖液A (超濾水和0. 1%三氟乙酸)和緩沖液B (100%乙腈+0. 1%三氟乙酸)。電泳技術(shù)。在12%聚丙烯酰胺凝膠上，根據(jù)參考文獻(xiàn)11，使用mini-Protean
IIcell (Bio-Rad)實施在還原條件下(2% P -巰基乙醇)的SDS-PAGE。用考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue)給凝膠染色。細(xì)胞培養(yǎng)物。建立的人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(HepG2)獲取自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection) (Rockville, MD)。Eagle 極限必需培養(yǎng)基(MEM)、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA(Ix)、青霉素(105U/L)、鏈霉素(100g/L)、tricine緩沖液(ImmoI/L, pH 7.4)和非必需氨基酸溶液(IOOx)來自GIBCO(Madison, WI)。培養(yǎng)皿來自 COSTAR (Cambridge, MA)。過濾器來自 Millipore (Bedford, MA)。ProteinCoomassie Plus Protein Assay 試劑盒購自 Pierce (Rockford, IL,美國)。I OOmmo I/L NaOH 中無載體的碘 125 來自 Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA)。SephadexG25 柱(PD 10)來自 Pharmacia Biotech (Uppsala,瑞典)。LDH 和 MTT 試劑盒來自 SigmaDiagnostics (Milano-意大利)。其他分析級的化學(xué)品來自 Merck (Darmstadt, Germany)。在90mm直徑的培養(yǎng)皿中單層種植細(xì)胞，并且維持在37°C、95%空氣，5% CO2的濕化的大氣和用10%胎牛血清(FCS)、非必需氨基酸溶液(1%, v/v)、青霉素(105U/L)、鏈霉素(0. Ig/L) > tricine 緩沖液(20mmol/L, pH 7. 4)、NaHC03 (24mmol/L)和丙酮酸鈉(0. llg/L)補(bǔ)充的MEM中。對于設(shè)計用來評價LDL受體調(diào)節(jié)的實驗，將細(xì)胞種在35mm塑料盤中(3_5xl05個細(xì)胞)并且在將要達(dá)到匯合之前使用。在全部細(xì)胞培養(yǎng)物實驗中，每2-3天更換培養(yǎng)基。為了評價細(xì)胞活力，基本如參考文獻(xiàn)9中所描述的，通過甲基四唑鹽(MTT)測定檢測來自暴露于不同濃度e a ’的細(xì)胞的培養(yǎng)基。通過使用動態(tài)(LDH/LD)診斷試劑盒(Sigma Diagnostics)測量乳酸脫氫酶(LDH)活性確定細(xì)胞酶滲漏。通過順序制備超離心[12]從臨床健康的正常血脂的志愿者的血漿中分離LDL (I. 019 ^ I. 063g/L)。根據(jù)如由Bilheimer等人修改的McFarlane方法[13]，和先前描述的[3]方法標(biāo)記脂蛋白。125I-LDl通過過濾(Millipore過濾器，0.45 孔徑)滅菌并且在4°C貯藏直到使用。如先前描述地制備人脂蛋白缺陷型血清(LPDS) [9]。125I-LDL的攝取和降解。在含有/缺乏列于表中的不同濃度的e a ’或3. 5 ii mol/La ’純化的亞基或I. 0 ii mol/L辛伐他汀(simvastatin)的情況下,在37°C用5g/100g LPDS補(bǔ)充的MEM中預(yù)先孵育單層細(xì)胞24小時以增量調(diào)節(jié)LDL-受體[2]。隨后向培養(yǎng)基中加入固定濃度(7. 5mg/L)的125I-LDL并且在37°C繼續(xù)孵育另外5小時。如先前報道地評價125I-LDL的特定的攝取(結(jié)合+內(nèi)化)和降解[2]。統(tǒng)計分析。通過ANAOVA以及隨后的Dunnett檢測確定在用不同濃度的e a ’孵育細(xì)胞之后LDL細(xì)胞攝取和降解的差異。以平均值土SD表示數(shù)值；認(rèn)為p值< 0. 05為統(tǒng)計 顯著的。結(jié)果巴斯德畢赤酵母中ea ’的表達(dá)。在圖I中顯示了用于轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。在圖2中顯示了插入片段的序列和它與a’亞基的比對。如在材料和方法中所提到的，重組和野生型多肽之間僅存的差異在于N-端第一個氨基酸殘基，由于技術(shù)原因，所述氨基酸殘基在重組鏈中為丙氨酸。如通過培養(yǎng)基的SDS-PAGE分析所判斷的(未顯示)，選擇顯示了最大量重組多肽生產(chǎn)的克隆用于大量生產(chǎn)。圖3-A顯示了在用甲醇接種之前(第I道)和1-8-19和25小時之后(第2、3、4、5道)酵母培養(yǎng)物上清液的電泳分析。如它所顯示的，由于誘導(dǎo)，在約20kDa的表觀分子量處出現(xiàn)明顯的帶。e a ’的純化。通過色譜方法達(dá)到e a ’的純化。收集并通過SDS-PAGE分析來自每一步的樣品。在圖3-B中顯示了純化步驟對鑒定的多肽的同質(zhì)性的作用。在培養(yǎng)基中已經(jīng)達(dá)到了非常低程度的由酵母蛋白質(zhì)的污染，而其它的色譜步驟移除主要的污染物蛋白質(zhì)并且以幾乎同質(zhì)的形式容許重組多肽回收。這條帶的N-端序列分析證實了此20kDa多肽對應(yīng)于ea ’鏈。判斷這一樣品的純度適合于細(xì)胞測定。e a ’的生物學(xué)活性。如下表所報道的，與未處理的細(xì)胞相比，向IfepG2細(xì)胞加入作為陽性對照的純化的a ’亞基和它的截短的a ’形式在LDL受體介導(dǎo)的攝取和降解中產(chǎn)生顯著的上升。表.a ’和它的截短的形式(e a ’)對IfepG2細(xì)胞U2的LDL攝取和降解上的作用
權(quán)利要求
1.具有SEQIDl的大豆7S球蛋白a ’亞基的N-端親水片段。
2.制備權(quán)利要求I的大豆7S球蛋白的N-端親水片段的方法，其包括重組多肽的克隆、在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)和純化。
3.包含與合適的載體混合的作為活性成分的權(quán)利要求I的大豆7S球蛋白的N-端親水片段的組合物。
全文摘要
將大豆7S球蛋白截短形式的α’鏈(eα’)克隆并在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)，所述截短形式的α’鏈在體內(nèi)和體外模型中在調(diào)控膽固醇和甘油三酯內(nèi)穩(wěn)態(tài)中有活性。重組多肽跨越從N-端側(cè)的142個氨基酸殘基并且包括大豆α’亞基的N-端延伸區(qū)。通過常規(guī)的生物化學(xué)技術(shù)純化eα’多肽并且在人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(Hep G2)中通過監(jiān)測被標(biāo)記的LDL的攝取和降解評價所述eα’多肽調(diào)節(jié)LDL受體活性的潛力。
文檔編號C07K14/415GK102753571SQ201080032535
公開日2012年10月24日 申請日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者A·康索尼, A·里瓦, C·蓬佐內(nèi), D·貝蘭達(dá), M·杜蘭蒂, P·莫拉佐尼 申請人:因德納有限公司