專利名稱：：通過融合蛋白的自我蛋白剪切制備重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備具有特定同源N端的所需要的異源重組多肽(heterologousrecombinantpolypeptide)的方法。本發(fā)明將色譜體系與融合多肽結(jié)合起來，該融合多肽包括所需要的多肽(polypeptideofinterest)以及一個附加部分，即具有自我蛋白水解功能的第二多肽，'該多肽與所需要的多肽的N端相連。所述的色譜體系形成本發(fā)明的一部分，當(dāng)融合多肽被固定在色譜體系中時，該體系使融合多肽N端的自我蛋白水解功能激活。融合多肽的固定，再折疊以及剪切都在同一個色譜體系中進(jìn)行，之后，從該色譜體系中分離出純化形式的所需要的多肽。
背景技術(shù)：
：大多數(shù)所需要的多肽，例如源于真核細(xì)胞的醫(yī)藥用途蛋白，由于其具有高表達(dá)速度(expressionrate)及高產(chǎn)量(yields),所以其制備通常在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行。然而，在細(xì)菌細(xì)胞中合成多肽的機(jī)制與在真'核細(xì)胞中合成多肽的機(jī)制不同；通常，細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的多肽在N端都具有一個附加的外來氨基酸，或者其N端為不同源的(inhomogenous)，雖然附加的氨基酸可以剪切，但是大多數(shù)情況下此剪切并不完全。然而，尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域，上述不同源性(inhomogeneity)是不受;歡迎的，因?yàn)檫@些多肽與天然多肽所呈現(xiàn)的性質(zhì)并不相同，例如，抗體形成的誘導(dǎo)、半衰期、藥代動力學(xué)等等。當(dāng)天然的蛋白衍生的N端，和/或N端不同源則N端會出現(xiàn)不可接受的特性。制備用藥多肽時，大部分情況下要求生產(chǎn)一種與天然相同的產(chǎn)品，其與正確的N端同源，，并且沒有附加氨基酸。已知的方法是在多肽制備過程中增加一些附加!的步驟，借此試圖達(dá)到上述要求，但是這種方法耗費(fèi)了更多的財(cái)力和材料，而且把所謂的生產(chǎn)下游工藝變的相當(dāng)復(fù)雜。在細(xì)菌細(xì)胞中制備具有特定同源N端的多肽的已知的方法中所使用的融合多肽包含有所需要的多肽，且其N端連接一個具有自我蛋白水解活性的多肽，具有自我蛋白水解活性的多肽優(yōu)選瘟病毒的Npro自我蛋白酶。通過融合多肽的自我水解活性可以剪切出感興趣的、具有同源N端的多肽。如果在細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中制備多肽，在一定的條件下，多肽的生產(chǎn)率大于其折疊動力學(xué)(foldingkinetics)。因此會形成高濃度的多肽聚集體(aggregates),該聚集體以包涵體的形式堆積在細(xì)胞質(zhì)中。在工業(yè)生產(chǎn)水平中，人們對上述這種以包涵體形式制備多肽的方式非常感興趣，因?yàn)樗磉_(dá)在包涵體中的多肽的含量很大，純度也很高。另外，細(xì)胞中的包涵體缺乏蛋白酶，所以儲存在包涵體中的多肽也可以得到保護(hù)。此外，包涵體非常易于離析。然而，以細(xì)胞質(zhì)包涵體形式制備多肽的主要缺點(diǎn)是，包涵體溶解性很低，并且必須進(jìn)行多肽的再折疊。因此，尤其當(dāng)要求正確的再折疊以得到具備生物活性的感興趣的多肽時，包涵體的處理就變得非常復(fù)雜。盡管利用上述融合多肽的自我蛋白水解活性可以制備出具有同源N端的多肽，但是所需產(chǎn)物的純化工藝依然非常冗長，尤其是當(dāng)其以細(xì)胞質(zhì)包涵體的形式表達(dá)時。處理工藝包括大量清洗(washing),再折疊，剪切，純化以及分離等步驟。因此，要快速、低成本的制備多肽，復(fù)雜的下游工藝將會是一個巨大的挑戰(zhàn)。工業(yè)生產(chǎn)中這種情況更為迫切。因此，尋找一種簡單可行的生產(chǎn)并純化多肽的工藝迫在眉睫。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明中，人們驚奇的發(fā)現(xiàn)，通過將特殊的親和色譜方法與具有自我蛋白水解活性的融合多肽體系結(jié)合可以極大的便利例如，從包涵體中獲得所需的異源多肽的制備方法。因此，該制備方法可以通過一種色譜體系的協(xié)助得以進(jìn)行。首先制備融合多肽。融合多肽包含具有自我蛋白水解功能的多肽，優(yōu)選為自我蛋白酶的自我蛋白水解功能，更優(yōu)選為瘟病毒屬(Pestivirus)的Npra自我蛋白酶及其衍生物的自我蛋白水解功能。多肽的C端具有自我蛋白水解功能，上述融合多肽還包含所需的異源多肽。融合多肽是在抑制其N端自我蛋白水解活性的環(huán)境下在宿主細(xì)胞中制備的。特別以細(xì)胞質(zhì)包涵體的變性形態(tài)(denaturedform)制備融合多肽。從細(xì)胞中將這些包涵體離析出來并使其在保持自我蛋白水解活性失活的環(huán)境下溶解。融合蛋白選擇性地固定在色譜體系中，特別是可以保持融合多肽N端失活及變性狀態(tài)的色譜柱中。一旦融合多肽被固定在色譜體系中，必要的話，未固定的雜質(zhì)成分將被清洗出來。當(dāng)只有融合多肽從色譜體系中脫離時，純化體系將從抑制自我蛋白水解功能的環(huán)境改變?yōu)榧せ钭晕业鞍姿夤δ艿沫h(huán)境。這種環(huán)境的改變使融合多肽恢復(fù)其原本的結(jié)構(gòu)，從而N端部分自我蛋白水解功能被激活，感興趣的多肽被剪切出來，最后洗脫出來的成分為純化的、經(jīng)重疊的、具有同源N端的所需的多肽，而融合多肽的N端部分繼續(xù)固定在色譜體系中。一旦融合多肽被固定在與色譜體系中，步驟l)清洗未被固定的雜質(zhì)(或污染物)成分2)再折疊3)剪切所需多肽的以及4)在同一個色譜體系中純化所需的多肽。這極大的便利了操作。未被固定的雜質(zhì)成分在此體系中非常易于清洗，同時融合多肽保持與色譜體系的選擇性固定。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種制備具有同源N端的所需要的異源多肽的新方法，該方法大大簡化了獲取活性多肽所需的復(fù)雜的處理過程。因此，本發(fā)明涉及一種使用包含有所需多肽和連接在所需多肽N端的，具有自我蛋白剪切功能的多肽的融合多肽制備具有同源N端的異源所需多肽的方法，該方法包括以下步驟a)使用親和色譜體系將融合多肽以可溶的、自我蛋白水解功能失活的形態(tài)固定，b)再折疊融合多肽，以便激活融合多肽的自我蛋白水解功能并使所需的異源多肽剪切，c)隨后洗脫所需的異源多肽，其中所述的步驟都在一個親和色譜體系中進(jìn)行。本文涉及的術(shù)語含義如下所述術(shù)語"所需的異源多肽"(heterologouspolypeptideofinterest)意為一種并非通過天然自我蛋白酶剪切天然(融合)多肽而形成的多肽，所需的異源多肽例如有工業(yè)酶(工藝酶)或具有治療活性，尤其是針對人類治療的多肽。術(shù)語"融合多肽"意為包含有兩個或多個多肽的多肽。特別的，一個融合多肽可能包含一個親和標(biāo)記、一個自我蛋白剪切部分，優(yōu)選自我蛋白酶、以及一個所需要的多肽。在本發(fā)明中，融合多肽包含所需要的多肽，以及具有自我蛋白剪切功能的，N端連接所需要的多肽的多肽。術(shù)語"變性形態(tài)"(denaturedform)在本發(fā)明中意為在重組制備過程中，通常是在溶解包涵體之后所獲得的作為產(chǎn)品的，具有生物失活形態(tài)的表達(dá)融合多肽。術(shù)語"再折疊"意為溶解多肽恢復(fù)其原本結(jié)構(gòu)和生物活性的機(jī)制，例如，將處于變性、失活形態(tài)的蛋白質(zhì)重組，使其恢復(fù)其活性形態(tài)。術(shù)語"自我蛋白水解功能"(autoproteolyticfunction)意為融合成分(fbsionpartner)中一種成分的自我蛋白水解活性，當(dāng)融合多肽處于變性形態(tài)時，此活性被抑制，當(dāng)融合多肽進(jìn)行再折疊時，此活性被激活。當(dāng)融合多肽的自我蛋白水解功能失活時，融合多肽被固定在色譜體系中。在環(huán)境改變、所需要的多肽剪切、以及之后的過程中，融合多肽都必須保持固定在色譜體系中。在本發(fā)明中，當(dāng)融合多肽再折疊的同時剪切開始進(jìn)行，此時融合多肽從失活形態(tài)恢復(fù)至活性形態(tài)。本發(fā)明提供了一種親和色譜體系，在使變性環(huán)境下，融合多肽的N端固定在此親和色譜體系中，之后當(dāng)環(huán)境改變時，具有自我蛋白水解功能的融合成分依然保持固定在親和色譜體系中。再折疊發(fā)生的同時多肽仍然被固定在色譜體系中，所以要求親和體系和再折疊方法互不干擾。這個問題在本發(fā)明中已得以解決。本文使用的術(shù)語"使變性"意為多肽原始三維結(jié)構(gòu)被破壞了的環(huán)境。在融合多肽的自我蛋白水解活性部分，再折疊可以激活此部分的活性并引發(fā)剪切的開始。同時，所需要的的多肽部分恢復(fù)其原本的結(jié)構(gòu)，最后剪切下來的所需要的多肽便具備其原本的、活性的形態(tài)。剪切之后，由于融合多肽的自我蛋白水解活性部分仍然固定在色譜柱中，而在剪切開始之前，未被固定的雜質(zhì)成分已經(jīng)從色譜柱中清洗出來，所以從色譜柱中洗脫出來的便是純凈的、經(jīng)再折疊的所需要的多肽。因此，不需要再進(jìn)行融合多肽兩部分的分離，剪切劑的分離或再折疊這些后序工作。在本發(fā)明中，融合多肽是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，以最初失活形態(tài)制備而成的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，融合多肽是通過在細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)以包涵體的形式重組表達(dá)制備而成的，所使用的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(transform)是通過含有編碼融合多肽的核酸分子的表達(dá)載體得以實(shí)現(xiàn)的。本文使用的術(shù)語"包涵體"意為存在于轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的含有異源多肽的集合體。在顯微鏡下，包涵體呈亮點(diǎn)狀(brightspots),可以通過分離細(xì)胞質(zhì)獲得包涵體。本文使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞"意為包含編碼異源多肽載體的細(xì)胞。為了啟動色譜柱上的剪切，需要在最開始以及多肽已經(jīng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的過程中抑制融合多肽的自我蛋白水解活性。表達(dá)的多肽在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中聚集，尤其是以包涵體形態(tài)聚集，該過程的環(huán)境需要保持融合多肽的失活形態(tài)。本發(fā)明中所使用的細(xì)菌宿主細(xì)胞為，例如革蘭氏陰性細(xì)菌如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌，或者其他革蘭氏陰性細(xì)菌，例如假單胞菌屬，如綠膿桿菌，或桿菌屬(caulobactersp.)，如新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)，或者革蘭氏陽性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬，尤其是枯草桿菌。優(yōu)選大腸桿菌作為宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中使用的表達(dá)載體包含編碼融合多肽的核酸分子，其包含具有自我蛋白水解功能的多肽，并且其C端連有所需的多肽。剪切在具有自我蛋白水解活性的多肽C端進(jìn)行，以便形成所需多肽的同源N端。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，具有自我蛋白水解功能的多肽為自我蛋白酶。本文使用的術(shù)語"自我蛋白酶"意為具有自我蛋白水解功能的，可以從更長的多肽部分上將自身剪切下來的多肽，優(yōu)選天然蛋白酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知自我蛋白酶的概念，已知的有很多天然自我蛋白酶體系。研究比較深入的自我蛋白酶有，例如病毒蛋白酶，發(fā)育蛋白質(zhì)(developmentalproteins)(如HetR，Hedgehog蛋白質(zhì)(其羧基端蛋白酶)，RumA蛋白酶領(lǐng)域，UmuD，等等)。黃病毒科的病毒(Flaviviridae),包括瘟病毒屬(pestiviruses)都具有NS3蛋白酶。通過黃熱病毒、2型登革熱病毒和西尼羅河病毒所顯示，蛋白酶結(jié)構(gòu)域位于NS3的N端180殘基上，其可在NS2A/2B和NS2B/NS3接點(diǎn)處以作用與明顯的分子內(nèi)形式(inanapparentintramolecularfashion)被剪切下來。通過對丙型肝炎和GB病毒NS3序列分析顯示，其與黃病毒(flavivirus)和瘟病毒屬(pestiviruses)NS3序列有著密切的聯(lián)系。N端自我蛋白酶也會出現(xiàn)在口瘡病毒屬(aphthoviruses)[口蹄疫病毒(FMDV)]中，該口瘡病毒屬屬于小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)的正鏈(positivestrand)RNA病毒。該蛋白酶也被稱作前導(dǎo)蛋白酶(Lpro)，其屬于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶科。該蛋白酶除了可以將其自身從多肽上剪切下來之外，還可導(dǎo)致真核起始因子4G的220-kDa組的蛋白水解退化(degradation)并停止加帽依賴性(cap-dependent)宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。由于小核糖核酸RNA沒有加帽，所以當(dāng)加帽結(jié)合(cap-binding)蛋白質(zhì)復(fù)合體失活時其被繼續(xù)翻譯。然而，細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒復(fù)制并不需要口瘡病毒前導(dǎo)蛋白酶基因。小核糖核酸病毒(picomavirus)科中的另外兩種自我蛋白酶是2A和3C,它們與和類糜蛋白酶絲氨酸蛋白酶(chymotrypsin-likeserine-proteases)極其一致。兩種蛋白酶都包含在多聚蛋白質(zhì)的前體(precursor)中。植物病毒中自我蛋白質(zhì)水解的簡短的例子是，甜菜黃化病毒中的前導(dǎo)蛋白酶，此前導(dǎo)蛋白具有非保護(hù)的(non-conserved)N端結(jié)構(gòu)域(RNA擴(kuò)增功能)和保護(hù)的(conserved)類木瓜蛋白酶(papain-like)的C端結(jié)構(gòu)域，其需要自我蛋白水解。在逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，例如人類免疫缺陷病毒(HIV-1)中的Gag-Pol多聚蛋白中，也可以發(fā)現(xiàn)自我蛋白酶。該多聚蛋白包含一個有99個氨基酸的蛋白酶，當(dāng)其與另一個多聚蛋白中的蛋白酶聚合之后便可將自身釋放出來。術(shù)語"自我蛋白酶"優(yōu)先指代瘟病毒的NPTO自我蛋白酶，包括其所有具有自我蛋白水解活性的衍生物。在本發(fā)明中更深一層的實(shí)施例中，自我蛋白酶為瘟病毒的N^，或其具有自我水解功能的衍生物。瘟病毒為小型包膜病毒，它具有一條直接擔(dān)任mRNA的基因組。從瘟病毒中鑒別出的兩種病毒編碼的蛋白酶分別為Npro自我蛋白酶和絲氨酸蛋白酶NS3。NPr。蛋白酶位于多聚蛋白的N端。N^組成瘟病毒多聚蛋白的第一個蛋白質(zhì)，并在自我蛋白水解過程中與后面的核包核酸蛋白剪切開。剪切發(fā)生在N^序列Cysl68的最后一個氨基酸之后。瘟病毒可以形成一系列的包括其他病毒的病原體，典型豬瘟病毒(CSFV)，邊境病毒(BDV)以及牛病病毒性腹瀉病毒(BVDV)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，瘟病毒選自CSFV，BDV或者BVDV，其中CSFV為最優(yōu)選。在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施例中，CSFV的Npro自我蛋白酶的氨基酸序列如下所示SEQIDNO1:(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGmKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKR,GRVTQSDGKLYHIYVCVDGC,LLKLAKRGTPRTLKW識NFTNCPLWVTSC-(168)，或?yàn)榫哂凶晕业鞍姿夤δ艿腘pro自我蛋白酶的衍生物的氨基酸序列。又見EMBL數(shù)據(jù)庫，登陸號X87939,1至168位氨基酸，從N端向C端方向讀取。當(dāng)需要保持所需的自我蛋白酶的活性，尤其是制備所需的具有同源N端的所需的異源多肽時，本發(fā)明具有自我蛋白水解功能的衍生物是由瘟病毒的NPr。自我蛋白酶通過突變，特別是氨基酸的替換、缺失、添加和/或插入衍生而來。通過突變制備上述衍生物的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。從融合多肽中剪切下來的不同種類的異源多肽的NPr0自我蛋白酶的性質(zhì)可以通過上述突變進(jìn)行調(diào)整。在本發(fā)明中可以對多肽進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其與天然蛋白酶相比不僅具有改良的性質(zhì)，且仍然保持瘟病毒N^的自我蛋白水解活性。出于這種考慮，優(yōu)選那些在溶解性方面具有改良性質(zhì)以及可以優(yōu)先固定在親和色譜體系中的衍生物，這些性質(zhì)在本專利中用處極大。由突變得到的衍生物的自我蛋白水解功能可以通過例如WO01/11056進(jìn)行測試。優(yōu)選半胱氨酸殘基被替換的，氨基酸序列為上述IDNOl所述的天然的瘟病毒N^的衍生物。更優(yōu)選C112，C134，C138三個半胱氨酸殘基被其他氨基酸殘基(例如谷氨酸)替換的，天然Npro的衍生物。尤其優(yōu)選具有下列氨基酸序列的衍生物SEQIDN02:(1)-MELNHFQ1YKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGlYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLE汗DEAQraEVTKR，GRVTGSDGKLYHIWEVDG日LLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)。另外一種優(yōu)選的天然的瘟病毒Npro的衍生物，除上述半胱氨酸的突變之外，53位和57位上的精氨酸被替換為谷氨酸殘基，54位上的甘氨酸被替換為天冬氨酸，143位上的亮氨基酸被替換為谷氨酰胺。此衍生物的氨基酸序列如下所示SEQIDNO3:(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDR(3EDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKW1RNFTNCPLWVTSCH168)。因此另一方面，本發(fā)明也涉及到上述方法，其中融合多肽包含CSFV的N^自我蛋白酶的衍生物，該衍生物除至少一個半胱氨酸殘基如上所述被替換之外，還有至少一個疏水氨基酸殘基被替換為親水殘基。在本發(fā)明中，優(yōu)選一種CSFV的N^自我蛋白酶的衍生物，其中除了至少一個半胱氨酸如上所述被替換之外，下列氨基酸中至少其中之一也被替換V24，A27，L32，G54，L75，A109,V114,V121，L143,1155以及F158。優(yōu)選下列氨基酸被蘇氨酸(T)替換所形成的衍生物丙氨酸(A)109，纈氨酸(V)114，異亮氨酸(I)155和苯基丙氨酸(F)158。因此在另一方面，本發(fā)明優(yōu)先涉及到上述方法，其中融合多肽包含CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物，其中除至少一個如上所述半胱氨酸殘基被替換之外，下列氨基酸也被替換為蘇氨酸(T):丙氨酸(A)109，纈氨酸(V)114，異亮氨酸(I)155和苯基丙氨酸(F)158。另外，在本發(fā)明中更優(yōu)選具有下列氨基酸序列的CSFV的NPTO自我蛋白酶的衍生物SEQIDN04:(IH/IELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDGRSGNHLGPVSGIY1KPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKWGRVTGSDGKLYHIYVEVDG日UKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSCH16B)。因此，在另一方面，本發(fā)明更加優(yōu)先涉及到上述方法，其中融合多肽包含具有SEQIDNO4中所示氨基酸序列的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物。在本發(fā)明中，更優(yōu)選一種CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物，此衍生物除至少一個半胱氨酸如上所述被替換之外，下列氨基酸丙氨酸(A)109，纈氨酸(V)114，異亮氨酸(I)155，苯基丙氨酸(F)158被替換為蘇氨酸(T);精氨酸(R)53被替換為谷氨酸(E),甘氨酸(G)54被替換為天冬氨酸(D)，精氨酸(R)57被替換為谷氨酸(E)，亮氨酸(L)143被替換為谷氨酰胺(Q)。在本發(fā)明中，最優(yōu)選的CSFV的NpTO自我蛋白酶的衍生物具有下列氨基酸序列SEQIDNO5:(1H/IELNHFELLYKrSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIE7TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGmKPGPVVYQDYTGPVYHRARJEFFDETQFEErTKR'GRVTGSDGKLYHtYVEVDG日LLKQAKRGTPRaKyVTRNTTNCPLWVTSC"(1明)。因此，在另一最優(yōu)選的方面，本發(fā)明同樣涉及上述方法，其中融合多肽含序列SEQIDNO5所示的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物。在另一同樣優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及到上述制備異源蛋白的方法，其中融合多肽含有CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物，此衍生物的氨基酸序列為SEQIDNO5，其中將天門冬素(N)35替換為蘇氨酸(T)，將蘇氨酸(T)158替換為絲氨酸(S)。在本發(fā)明上述方面的方法中所使用的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物也是本發(fā)明的一部分，其氨基酸序列如下所示SEQIDNO32:(1)"MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDD，ETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGmKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDG日LLKQAKRGTPRTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168)。在另一優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及上述制備異源蛋白(heterologousprotein)的方法，其中融合多肽含有CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物，此衍生物的氨基酸序列為SEQIDN032，其中將丙氨酸(A)28替換為谷氨酸(E)，將絲氨酸(S)71替換為苯基丙氨酸(F)，將精氨酸(R)150替換為組氨酸(H)。在本發(fā)明上述方面的方法中所使用的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物也是本發(fā)明的一部分，其氨基酸序列如下所示SEQIDNO33:(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDD1ETTLRDLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIWEVDG日LLKQAKRGTPHTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168)。制備胰島素原時，在本發(fā)明所述的方法中，將序列為SEQIDNO32的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物與至少具有胰島素原，優(yōu)選與胰島素原，更優(yōu)選與人類胰島素原，最優(yōu)選與重組人類胰島素原前三位氨基酸的蛋白質(zhì)融合。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物除至少一個半胱氨酸殘基如上所述被替換之外，下列氨基酸至少其中之一也被替換精氨酸(R)53，糖基乙酸(G)54，精氨酸(R)57，蘇氨酸(T)109、114、155、158，亮氨酸(L)143。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物除至少一個半胱氨酸殘基如上所述被替換之外，下列氨基酸分別被替換為精氨酸(R)53被替換為谷氨酸(E)，糖基乙酸(G)54被替換為天冬氨酸(D)，精氨酸(R)57被替換為谷氨酸(E)，蘇氨酸(T)109、114、155、158被替換為絲氨酸(S)，亮氨酸(L)被替換為谷氨酰胺(Q)或天門冬素(N)或天冬氨酸(D)或絲氨酸(S)或組氨酸。在本發(fā)明上述方面的方法中優(yōu)選使用的CSFV的Npro自我蛋白酶的衍生物也是本發(fā)明的一部分，其氨基酸序列如下所示SEQID92:(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTOPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDG曰LLKSAKR(3TPRTLKWSRNSTNCPLWVTSCH1助)。SEQD95:(1>MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDD，ETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTOPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRK3RVTGSDGKLYHIYVEVDG日LLKNAKRQTPRTLKWSRNSTNCPLWVrSc-(168)。SEQD96:(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLR3NPSEVHPQS7LKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGmKPGPVYYQDYTOPVYHRAPLEFFDESQFEESTKR!GRVTGSDGKLYHlYVEVDG日LLKDAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)。SEQD97:(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLR3NPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDG日LLKHAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSCH168)SEQID98:(1)4/1ELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIErrLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSG,YIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGCVTGS0GKLYHIYVEVDG日LLKQAKRGTPRTUCWSRNSTNCPLWVTSO068)表達(dá)載體編碼作為融合多肽的一部分的所需要的多肽，其可以通過自我蛋白水解剪切下來。在本發(fā)明中，可以使用上述表達(dá)載體制備一系列的所需要的多肽。例如，具備藥理活性的多肽，其選自干擾素、白介素、生長荷爾蒙、生長因子(growthfactor)、細(xì)胞因子、酶、酶抑制劑、抗體和抗體片段，諸如此類，例如干擾素a2A、干擾素oc2B、白介素-3、白介素-6、人類生長荷爾蒙、胰島素(原)、胰島素樣生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、干擾素卩l(xiāng)、牛促生長激素(bovinesomatropin)、豬促生長激素(porcinesomatropin)、白介素11、白介素-2、抗原結(jié)合片段(Fab-fragment)、以及小肽如降鈣素、甲狀旁腺荷爾蒙(PTH)、或胰增血糖素、CD40配基可溶形式、血漿酶原激活劑、性類固醇結(jié)合蛋白、表皮生長因子以及組織因子細(xì)胞外域(tissuefactorextracellulardomain)。另外，所需的多肽也可以是其他任意形式的多肽，尤其是特別適合用于分析方法的多肽，例如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)。在本發(fā)明的方法所使用的表達(dá)載體中，融合多肽需與至少一個表達(dá)控制序列(expressioncontrols叫uence)可操作地相連。牛寺別地表達(dá)控制序列為，啟動子(如lac，tac，T3，T7，trp，gac，vhb，lambdapL或phoA啟動子)，核糖體結(jié)合部位(如屬于上述啟動子的自然核糖體結(jié)合部位，cro或合成核糖體結(jié)合部位)，或轉(zhuǎn)錄中止子(如rrnBTlT2或bla)。載體也可能包含編碼融合結(jié)構(gòu)域的序列，如下所述，其位于融合多肽的N端，并要求其固定在親和色譜體系中，例如，多聚氨基酸如多熔素，或者用于免疫親和色譜的所謂的"抗原決定基標(biāo)記(epitopetags)",己知的可用于特殊單克隆抗體的抗原決定基標(biāo)記包括FLAG,流行性感冒病毒血凝素(HA)和原癌基因標(biāo)記。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，表達(dá)載體為質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞也就是表達(dá)菌株(expressionstrain),其培養(yǎng)是按照已知的微生物方法(microbiologicalpractice)進(jìn)行的。宿主菌株(Hoststrain)是在營養(yǎng)基上由簡單生物群培養(yǎng)而成的，當(dāng)然也可以使用低溫保存的細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞銀行)。通常需要經(jīng)過多級工藝培養(yǎng)菌株來獲得足夠的生物量以備后用。在小規(guī)模制備情況下，可以在搖瓶中，大部分情況下使用復(fù)合培養(yǎng)基(例如LB肉湯培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。也可以使用成分明確的培養(yǎng)基(例如檸檬酸鹽培養(yǎng)基)。由于在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中融合多肽為不溶的包涵體的形式，所以培養(yǎng)需要在相對高溫的條件下進(jìn)行(例如30°C或者37°C)。誘導(dǎo)系統(tǒng)非常適用于制備包涵體(例如含有trp，lac，tac，phoA啟動子)。在大規(guī)模制備情況下，多級體系由大量的生物反應(yīng)器(發(fā)酵罐)組成，優(yōu)先使用成分明確的培養(yǎng)基。另外，通過在培養(yǎng)基基中添加特殊的營養(yǎng)(分批加入)還可以大大增加生物量和生產(chǎn)量。此外，此方法與使用搖瓶培養(yǎng)類似。在本發(fā)明的方法中，包涵體以一種已知的方式從宿主細(xì)胞中分離出來。例如，在發(fā)酵開始之后，通過離心法、微過濾法、絮凝法或這幾種方法的結(jié)合得到宿主細(xì)胞，優(yōu)選使用離心法。潮濕的細(xì)胞群通過機(jī)械、化學(xué)或物理的方法得以破碎，例如高壓均質(zhì)器，砂摩機(jī)，弗氏細(xì)胞壓碎器，壓碎器，滲壓震擾法，去污劑，酶解或者上述幾種方法的結(jié)合。優(yōu)選使用高壓均質(zhì)器使細(xì)胞分裂。在重組融合多肽以包涵體的形式聚集的優(yōu)選實(shí)施例中，可以通過例如高壓彌散或者更好是低轉(zhuǎn)速的簡單離心過濾獲得包涵體。通過離心過濾或者微過濾或兩者結(jié)合可以將包涵體分離出來?？梢酝ㄟ^在一系列的緩沖液中對包涵體進(jìn)行多級重懸浮來提高所需的多肽的純度，例如使用NaCl(例如0.5-1.0M)和/或去污劑(例如TritonXIOO)。優(yōu)選使用一系列的緩沖液進(jìn)行多級清洗來改善包涵體的純度(例如先用0.5%的脫氧膽酸，之后用兩遍1M的NaCl溶液，最后用蒸餾水)。這樣就可以將大多數(shù)雜質(zhì)多肽從包涵體中清除出來。在準(zhǔn)備親和色譜時，需要對分離出來的包涵體進(jìn)行溶解。本發(fā)明涉及上述方法，在此方法中優(yōu)先使用色譜體系，制備好的融合多肽在離液序列高且抑制自我蛋白水解活行的環(huán)境下進(jìn)行溶解。本文中使用的術(shù)語"離液序列高"(高濃度離液)(chaotropic)意為不能或幾乎不能觀察到分子內(nèi)部作用的環(huán)境?？梢酝ㄟ^例如加入去污劑、酒精、尿素或者胍鹽酸的方法形成此環(huán)境。適用于不同多肽的上述環(huán)境也不盡相同。如何確定適用于各種多肽的上述環(huán)境屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的工作范疇。使用高濃度離液劑(chaotropicagent)將包涵體溶解。包涵體溶解之后，可以得到一實(shí)質(zhì)上降低了分子內(nèi)和分子間作用的單分子懸浮液。優(yōu)選的溶劑為尿素、胍鹽酸和強(qiáng)離子去污劑，例如N-月桂酰肌氨酸(N-lauroylsarcosine)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施例中，也可以使用pH值呈堿性的含水酒精溶液，或者pH值呈堿性的水溶液來溶解包涵體。本文中使用的術(shù)語"溶解"意為用于溶解包涵體的方法。溶解之后可以得到一具有分子內(nèi)和分子間最小作用的多肽單分子懸浮液。，在本發(fā)明中，當(dāng)存在氧化半胱氨酸殘基時，優(yōu)選使用pH值為7.3的含有50mMTris/HCl，8M尿素，添加有還原劑例如50mMDTT的懸浮液溶解包涵體。必要的時候可以通過例如離心分離法除去部分不溶物質(zhì)。當(dāng)失活的融合多肽在細(xì)胞內(nèi)以可溶的狀態(tài)制備出來之后，對澄清的細(xì)胞勻漿進(jìn)行前面所述的操作以得到溶解出來的包涵體。溶解的多肽被進(jìn)一步稀釋，之后進(jìn)入色譜體系被固定在親和色譜柱上。在本發(fā)明中，可以調(diào)節(jié)色譜體系，從而可以選擇性地識別出具有自我蛋白水解功能的融合多肽部分，并在使變性、離液序列高的環(huán)境中將其固定在色譜柱上。在上述環(huán)境中，融合多肽變性并失活。當(dāng)融合多肽被固定在色譜柱上時，將使失活、離液序列高的環(huán)境改變?yōu)槭箯?fù)性、cosmotropic的環(huán)境，融合多肽便可恢復(fù)其原本的結(jié)構(gòu)，并重新激活自我蛋白水解功能。在此環(huán)境改變的過程中，具有自我蛋白水解功能的部分仍然被固定在色譜柱上。本文中使用的術(shù)語"cosmotropic"意為促進(jìn)分子間相互作用并促使生物結(jié)構(gòu)形成的環(huán)境。適用于不同分子的上述環(huán)境也不盡相同。作為陰離子的檸檬酸鹽、硫酸鹽和作為陽離子的四元胺或銨的cosmotropic作用最強(qiáng)。其他一些試劑，如去污劑或氧化還原系統(tǒng)也可用于促進(jìn)再折疊的進(jìn)行。如何確定適用于各種多肽的上述環(huán)境屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的工作范疇。在本發(fā)明框架中，理論上所有的色譜體系都可以在離液序列高的環(huán)境(chaotropiccondition)下選擇性的固定融合多S太，并在cosmotropiccondition(的環(huán)境)下繼續(xù)與其保持固定。在優(yōu)選的實(shí)施例中，色譜體系的基質(zhì)為色譜柱形式，也可以選擇其他形式的基質(zhì)，如色譜?；蛴袡C(jī)物質(zhì)，例如用親和肽修改過的聚乙烯乙二醇。適用于本發(fā)明的色譜體系基于纖維素結(jié)合域(cellulosebindingdomain),可以是使用例如多聚精氨酸或多聚賴氨酸等的聚陽離子標(biāo)記的陽離子交換色譜體系，也可以是使用例如多聚天門冬素等聚陰離子標(biāo)記的陰離子交換色譜。在本發(fā)明中，親和色譜體系優(yōu)選選自固定金屬離子色譜(IMAC)、陽離子交換色譜、陰離子交換色譜、纖維素結(jié)合域色譜以及肽親和色譜。所使用的親和色譜體系優(yōu)選陽離子交換色譜，在該色譜中融合多肽含有聚陽離子標(biāo)記(polycaticmictag),更優(yōu)選使用聚精氨酸或者聚賴氨酸作為親和標(biāo)記。對于陽離子交換色譜體系，表達(dá)的融合多肽包括N端聚陽離子標(biāo)記，例如聚精氨酸或者聚賴氨酸標(biāo)記。包含從宿主細(xì)胞中提取出來的表達(dá)的融合多肽的溶液，(過濾之后)被裝載在色譜柱上，色譜柱中填有適用于陽離子交換色譜的介質(zhì)，例如SP凝膠FF，CM凝膠FF，F(xiàn)mctogdEMDS03_。優(yōu)選使用傳導(dǎo)性較低的緩沖液。裝載好之后將未固定的物質(zhì)洗脫出來，之后使用尿素含量較低的緩沖液進(jìn)行再折疊。當(dāng)尿素含量低于0.5M時，目標(biāo)蛋白被剪切并從色譜柱中洗提(eluted)出來。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施例中，也可選擇陰離子交換色譜體系，在此色譜體系中，融合多肽需含有聚陰離子標(biāo)記。優(yōu)選多聚天門冬素作為親和標(biāo)記。在一個更為優(yōu)選的實(shí)施例中，也可以使用固定金屬離子親和色譜體系(IMAC)達(dá)到上述固定特性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，選擇固定金屬離子親和色譜(IMAC)作為親和色譜體系，融合多肽包含金屬螯合親和標(biāo)記。在上述情況下，融合多肽被識別出來，并通過其金屬螯合親和標(biāo)記被固定在色譜體系中。在本發(fā)明的一個更為優(yōu)選的實(shí)施例中，金屬螯合親和標(biāo)記為聚組氨酸親和標(biāo)記。IMAC是基于組氨酸或其他特殊氨基酸(天然蛋白質(zhì)表面的氨基酸或者通過DNA重組技術(shù)而得的氨基酸)以及各種固定金屬離子，例如銅，鎳，鋅或鐵離子的共價結(jié)合。已知的適用于IMAC的色譜材料(chromatographicmaterials)同樣適用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，使用Ni2+-ChelatingSepharoseFastflow(GEHealthcare,Uppsala,SE)作為基質(zhì)(matrix)。另外，也可以選擇免疫親和色譜，使用N端帶有上述抗原決定基標(biāo)記的融合多肽，通過該標(biāo)記的抗體識別所述功能將其固定在色譜基質(zhì)上。另外，在本發(fā)明中，使用寡肽配基的親和色譜體系也具有所需的固定特性。本文使用的術(shù)語"寡肽"(oligopeptides)意為至少包含三個氨基酸的蛋白質(zhì)化合物。這種寡肽長度通常不超過35個氨基酸的長度。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，在親和色譜體系中使用5到12個氨基酸長度的寡肽配基，更優(yōu)選6到8個氨基酸長度且包含一個色氨酸殘基的寡肽配基，在離液序列高的環(huán)境下，寡肽配基選擇性的與融合多肽上具有自我蛋白水解功能的部分結(jié)合，當(dāng)環(huán)境變化為cosmotropic環(huán)境時，寡肽配基與具有自我蛋白水解功能的部分依然保持結(jié)合。例如從抗體中得知，在這種形式的親和色譜中使用到某些多肽與其他多肽之間的特殊的結(jié)合。寡肽也可用作親和配基。這些分子具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性、功效和選擇性，并具有較低的價格，并且通常為無毒性的。這些特性在生物制藥工藝中是非常大的優(yōu)勢。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何從組合肽文庫或生物庫中尋找直接針對目標(biāo)分子的寡肽配基。根據(jù)本發(fā)明，寡肽配基的篩選需要在離液序列高的環(huán)境中進(jìn)行。現(xiàn)有技術(shù)己知的合成肽的方法可以用于制備本發(fā)明中所需的寡肽配基。優(yōu)選使用SPOT合成法、PIN合成法、teabag合成法、RuiwuLiu等人在ExperimentalHematology31(2003)11-30中所述的mixandsplit、法、JosephA.Buettner等人在Int.J.PeptideProteinRes.47(1996)，70-83中所述的PELICAN法制備寡肽配基?？梢允褂靡恍┻B接化學(xué)物(linkerchemistries)來固定(anchoring)第一個氨基酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，可以分別制備配基，然后將其一一固定在色譜基質(zhì)上。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施例中，可以將肽配基直接在色譜基質(zhì)上合成。寡肽配基具有高度特異性。本發(fā)明中所合成的寡肽的特性在于，在使變性環(huán)境下，此寡肽可以選擇性的結(jié)合NP"5、N^衍生物及其融合多肽。在本發(fā)明中，上述寡肽配基直接針對具有自我蛋白酶解功能的融合多肽部分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，寡肽配基具有選自如下的氨基酸序列:SEQIDNO6:VSIFEW，SEQIDNO7:AVS舊WY,SEQIDNO8:AVSFIWY，SEQIDNO9:VSFIWYK，SEQIDN010:ASRFWYA，SEQIDN011:AFYTWYA,SEQIDN012:AFYRWYK,SEQIDNO13:AFYRWY,SEQIDNO14:AFYRWYA，SEQIDNO15:AVSIFEWY，SEQDNO16:AVSRNWY，SEQIDNO17:ASRFWY,SEQIDNO化AFYRWYAA,SEQ,DNO19:AFYRWY，SEQ'DNO20:ASRFWYM，SEQIDNO21:AFYRWYAA,SEQIDNO22:AFYSWYAA。在本發(fā)明中，可以使用具有自由N端的寡肽配基或具有封閉N端的寡肽配基，通過例如乙?；饔玫靡孕纬煞忾]的N端。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施例中，使用氨基酸序列為SEQIDNO5的天然的CSFV的Npro，結(jié)合使用氨基酸序列選自SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13和SEQIDNO14的寡肽配基。因此，本發(fā)明還提供了含有固相的親和基質(zhì)(affinitymatrix)以及含有偶聯(lián)在這個固相的肽鍵的親和配基，其中含有肽鍵的親和配基選自以下配基a)含有通式為4X2X3X4的肽，其中&至X4為氨基酸殘基，&至X4中至少有兩個殘基為W、Y或F;b)含有通式為X5X6X7Xs的肽，其中Xs至Xs為氨基酸殘基，X5至X8中至少有一個殘基為W，X5至X8中至少有一個殘基為E或D;以及c)由R、K、E和D組成的氨基酸單體和由Y、F和W組成的氨基酸單體構(gòu)成的聚氨基酸，優(yōu)選聚KY，聚KF，聚KW，聚RY，聚RF，聚RW，聚EY，聚DY，聚EF，聚EW，聚DF和聚DW。條件是a)和b)所示的縮肽長度最多為35個氨基酸殘基，而且c)所示的肽長度最少為20個氨基酸殘基。這些親和配基對所述的自我蛋白酶分子，尤其是對Npro，Npro的衍生物及其融合蛋白的結(jié)合具有很高的親和性。特別的，無論是在離液序列高的環(huán)境下還是在cosmotropic的環(huán)境下，上述配基或親和基質(zhì)都可以固定Npro、Npro的衍生物及其融合蛋白，最少也能固定例如融合蛋白的Npro。a)和b)所示的肽(這里也可稱作"寡肽")的長度為優(yōu)選5至12個氨基酸殘基，更優(yōu)選6至8個氨基酸殘基。寡肽中最好至少有一個帶正電荷的氨基酸。c)所示的聚氨基酸長度優(yōu)選至少35個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少50個氨基酸殘基，最優(yōu)選至少100個氨基酸殘基。優(yōu)選的聚氨基酸為例如用作培養(yǎng)基的商用聚氨基酸，如聚KW，4:1(MW20.000-50.000Da;SIGMA產(chǎn)品No.P9285)，聚KY，4:1(MW20.000-50.000Da;SIGMA產(chǎn)品No.P4695)或聚KF，1:1(MW20.000-50.000Da;SIGMA產(chǎn)品No.P3150)。本發(fā)明中所涉及的親和配基需要經(jīng)過化學(xué)修飾，特別是乙?；?、酯化、酰胺化、氧化、還原或通過連接分子制備。優(yōu)選通過共價鍵將親和配基與固相基質(zhì)相連。目前已經(jīng)投入使用的基質(zhì)材料都適宜用作固相基質(zhì)。優(yōu)選的是固相基質(zhì)，其選自色譜材料，尤其是基于纖維素、瓊脂糖、丙烯酰胺、聚苯乙烯二乙烯基苯(poly(styrene-divinylbenzene))的載體(support)或乙烯基乙二醇異丁烯酸酉旨(ethyleneglycol畫methacrylatecopolymers)、微量滴定板、硝化纖維膜、微芯片、玻片或金屬涂層載體。本發(fā)明中用到一系列種類的固相載體，例如基于纖維素、瓊脂糖(瓊脂糖凝膠或Macro-Prep凝膠)、右旋糖苷(交聯(lián)葡聚糖凝膠)、丙烯酰胺(Sephacryl，Trisacrylgels)、無水硅酸(TSK，SW凝膠)、聚苯乙烯二乙烯基苯(poly(styrenedivinylbenzene))(Source或Poros凝膠)、乙烯基乙二醇異丁烯酸酯(ToyopearlHW，TSK，PW，fractogelEMD凝膠)或以上物質(zhì)混合物的載體，尤其是基于瓊脂糖和右旋糖苷(Superdex凝膠)的載體。優(yōu)選已經(jīng)通過美國權(quán)威機(jī)構(gòu)(FDA食品藥物管理局)或歐盟辦事處驗(yàn)證的，可用于人類或牲畜的載體。另外，所選的載體必須與本發(fā)明中的親和配基相固定，最好是通過共價結(jié)合的方式(載體要功能化)。作為基質(zhì)的主要成分，固相基質(zhì)可以包括目前已知的，適用與蛋白質(zhì)或其他生物分子固相分離的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以是天然的也可以是合成的，可以是有機(jī)的也可以是無機(jī)的，例如，天然的或合成的多聚糖，如瓊脂和瓊脂糖；纖維素，纖維素醚，如羥丙基纖維素，羧甲基纖維素；淀粉；樹脂如瓜爾豆膠，阿拉伯膠，茄替膠，黃芪膠，剌槐豆膠，黃原膠；果膠；粘蛋白；右旋糖苷；殼質(zhì)；殼聚糖；藻酸鹽；角叉(菜)膠；肝磷脂；白明膠；以及合成聚合物，例如聚酰胺如聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺；聚酰亞胺；聚酯；聚醚；聚乙烯基化合物，如聚乙烯醇和聚苯乙烯；聚烯烴；無機(jī)材料如硅土材料如二氧化硅，包括無定形二氧化硅和石英；硅石；金屬硅，可控孔度玻璃(controlledporeglasses)和陶瓷；金屬氧化物和硫化物，以及上述或天然或合成或有機(jī)或無機(jī)的材料的組合。基質(zhì)的主要成分(backbone)優(yōu)選瓊脂，瓊脂糖，纖維素，纖維素醚例如羥丙基纖維素，羧甲基纖維素，聚酰胺例如聚丙烯酰胺，聚乙烯乙醇，硅石以及可控孔度玻璃。作為基質(zhì)的主要成分，尤其引人注意的固相材料有例如瓊脂或瓊脂(聚)糖珠粒，如瑞典PharmaciaBiotech公司的Sepharose珠粒和Superose珠粒，美國Biorad公司的BiogelA;右旋糖苷粒如PharmaciaBiotech公司的ephadex;纖維素珠粒和纖維素膜如捷克斯洛伐克Secheza公司的Perioza纖維素；復(fù)合珠粒，如PharmaciaBiotech公司的Sephacryl和Superdex;合成有機(jī)聚合物珠粒如美國Toso-Haas公司的Fractogel;美國PerceptiveBiosystem公司的POROS介質(zhì)，Biomd公司的Bio-Rex，Bio-GelP和MarcroPrep，TESSEK公司的HEMA和Separon，美國BioSepra公司的HyperD和Trisaciyl介質(zhì)，美國3M公司的Enzacryl和Azlactone;硅石粒如英國Bioprocesing公司的可控孔度玻璃和PROSEP，BioSepra公司的Spherocil;以及粒狀或膜狀的涂層硅石合成物，如美國ArborTechnologies公司的ACTI-DISK,ACTI-MOD和CycloSep。典型情況下，固相基質(zhì)主要成分以及具有特別功能的固相基質(zhì)可以是例如不規(guī)則顆粒狀，圓球狀，膜狀或片狀，模制的表面或棒狀。固相材料可被設(shè)計(jì)為對蛋白質(zhì)部分滲透或完全滲透或不滲透。在本發(fā)明的一個特別引人注意的實(shí)施例中，基質(zhì)呈不規(guī)則顆粒狀或圓球狀，大小在l-10000nm之間，優(yōu)選10-1000pm之間，例如在高操作性能中使用大小在10-60pm之間的基質(zhì)，在介體用途(preparativepurpose)中使用大小在50-500nm或優(yōu)選50-30(Hmi之間的基質(zhì)?；|(zhì)還有一種非常有趣的形態(tài)，是由控制密度顆粒聚結(jié)組成的密度可控的基質(zhì)。上述聚結(jié)非常適用于大規(guī)模操作過程中的液化床色譜和膨脹床色譜以及各種間歇式色譜的非填裝(non-packed)色譜柱，例如攪拌槽中的單批吸收過程。在本發(fā)明中，親和配基可以通過任何種類的已知的合適的共價鍵與固相基質(zhì)相連，通過親和配基與固相基質(zhì)的直接化學(xué)反應(yīng)或使用已知的合適的反應(yīng)物預(yù)先激活固相基質(zhì)或配基都可以將基質(zhì)主要成分與配基固定起來。合適的激活反應(yīng)物有，例如表氯醇，表溴醇，烯基縮水甘油醚(allyl-glycidylether);雙環(huán)氧化物如丁二醇二縮水甘油醚(butanedioldiglycidylether);鹵丁二烯脂肪族化合物如二氯丙醇，二乙烯砜；羰二咪唑；醛式氫如戊二醛；醌；溴化氰；高碘酸鹽如高碘酸鈉；碳二亞胺；氯三嗪如氰尿酰氯；磺酰氯如甲苯磺酰氯和三氟乙烷磺酰氯(tresylchlorides);N羥基琥珀酰亞胺；2-氟-l-甲基吡啶甲苯畫4國石黃酸酯(2畫fluoro-l-methylpyridinlumtoluene-4-sulfonates);唑酮；馬來酰亞胺；二硫吡啶以及酰肼。在這些激活反應(yīng)物中，優(yōu)選具有不同于單鍵的隔離劑群組SPl(leavingaspacergroupSPldifferentfromasinglebond)激活反應(yīng)物，例如表氯醇，表溴醇，丙烯基縮水甘油醚；雙環(huán)氧化物；鹵丁二烯脂肪族化合物；聯(lián)乙烯砜；醛；醌；溴化氰；氯三嗪；唑酮；馬來酰亞胺；二硫吡啶以及酰肼。特別受人關(guān)注的激活反應(yīng)物為環(huán)氧化合物，例如表氯醇，烯基縮水甘油醚和丁二醇二縮水甘油醚。在本發(fā)明中，所有可以固定肽配基的基質(zhì)都可以用在肽親和色譜體系中。優(yōu)選德國達(dá)姆施塔特Merck公司的Fractogelepoxy(M)或"整體式色i普介質(zhì)"("monolithicchromatographymedium")CIM-epoxy。配基可以直接固定在經(jīng)化學(xué)激活的色譜基質(zhì)的主要成分上，也可以通過隔離劑(spacer)或連接劑(linker)與色譜基質(zhì)主要成分上固定。當(dāng)通過隔離劑連接時，結(jié)合在色譜基質(zhì)上的隔離劑需經(jīng)過化學(xué)激活，以便使配基固定。優(yōu)選Fractogelepoxy基質(zhì)與隔離劑結(jié)合使用。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施例中，隔離劑是通過色譜基質(zhì)首先與二氨基二丙胺(diaminodipropylamine(DADPA))發(fā)生反應(yīng)之后再與琥珀酐(SA)發(fā)生反應(yīng)形成的。形成的隔離劑的終端羧基經(jīng)過化學(xué)激活之后與一個終端氨基相連。配基被固定在基體上或者通過其含有的隔離劑的反應(yīng)基團(tuán)固定在隔離劑上。針對肽配基的反應(yīng)基團(tuán)可以是氨基團(tuán)，羧基團(tuán)或者巰基團(tuán)。在本發(fā)明中，優(yōu)選通過氨鍵使肽固定在基質(zhì)或隔離劑上。在本發(fā)明中，親和基質(zhì)尤其是用于親和色譜材料的親和基質(zhì)，優(yōu)選符合上面a)和b)所定義的寡肽。本文使用的術(shù)語"寡肽"意為含有至少三個氨基酸的蛋白質(zhì)化合物。通常情況下，寡肽的長度不超過35個氨基酸長度，最好為4至20個氨基酸殘基。本發(fā)明中親和色譜體系所使用的寡肽配基優(yōu)選長度為5至12個氨基酸，更優(yōu)選6到8個氨基酸，最好包含一個色氨酸殘基，配基在離液序列高的環(huán)境下選擇性的固定在具有自我蛋白水解功能的融合多肽部分，當(dāng)環(huán)境改變?yōu)閏osmotropic時，配基與具有自我蛋白水解功能的融合多肽的部分仍然保持固定。以抗體為例所知，在親和色譜中使用到某些多肽與其他多肽之間的特殊的固定。寡肽也可用作親和配基。這些分子具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性、功效和選擇性，并具有較低的價格，并且通常為無毒性的。這些特性在生物制藥工藝中是非常大的優(yōu)勢。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何從組合肽文庫或生物文庫中尋找直接針對目標(biāo)分子的寡肽配基。根據(jù)本發(fā)明，寡肽配基的篩選需要在離液序列高的環(huán)境中進(jìn)行。在本發(fā)明中，親和配基一個顯著的特性是，它可以在使變性環(huán)境下，例如4M尿素，與NpTO和Npro融合蛋白(以及其突變物或包含其突變物的蛋白質(zhì))相固定?，F(xiàn)有技術(shù)已知的合成縮氨酸的方法可以用來制備本發(fā)明中所述的寡肽配基。優(yōu)選通過SPOT合成法、PIN合成法、teabag合成法、RuiwuLiu等人在ExperimentalHematology31(2003)11-30中所述的mixandsplit合成法或Jos印hA.Buettner等人在Int.J.PeptideProteinRes.47(1996),70-83中所述的PELICAN合成法制備寡肽配基?？梢允褂靡恍┻B接劑化學(xué)物來固定(anchoring)第一個氨基酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，可以先分別制備配基然后再將其固定在色譜基質(zhì)上，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施例中，可以將肽配基直接合成在色譜基質(zhì)上。寡肽配基有很強(qiáng)的特異性。本發(fā)明中所合成的寡肽的顯著特征是，它可以在使變性的環(huán)境下與NPr。、N^衍生物及其融合多肽相連。在本發(fā)明中，寡肽直接針對具有自我蛋白水解功能的融合多肽部分。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實(shí)施例中，其中寡肽的氨基酸序列可以從下列序列中選擇VSIFEW，AVSIEWY，AVSFIWY，VSFIWYK，ASRFWYA，AFYTWYA，AFYRWYK，AFYRWY，AFYRWYA，AVSIFEWY，AVSRNWY，ASRFWY，AFYRWYAA，AFYRWY，ASRFWYAA，AFYRWYAA及AFYSWYAA。在本發(fā)明中，寡肽配基可以帶有一個自由N端也可以帶有一個封閉N端，通過例如乙?；饔眯纬煞忾]的N端。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施例中，使用序列為SEQIDNO5(由于這個突變體的衍生物具有在53至57位"EDD正"部分序列(替代"RGDIR"野生型)這個突變體(和含有這個部分的其他突變物)稱為"EDDIE-突變體)，的天然CSFV的NPr。的衍生物與選自下列氨基酸序列的寡肽配基相結(jié)合ASRFWYA，AFYTWYA，AFYRWYK，AFYRWY和AFYRWYA。優(yōu)選親和配基選自VSDDWY，VSEDWY，VSIDWY，VSYDWY，VSVDWY，VSWDWY，VSYDWY，VSFDWY，VSDEWY，VSEEWY，VSIEWY，VSYEWY，VSVEWY，VSWEWY，VSYEWY，VSFEWY，DDDDWY，DDEDWY，DDIDWY，DDYDWY，DDVDWY，DDWDWY，DDYDWY，DDFDWY，VSIFWE，F(xiàn)SIFEW，WSIFEW，VSLIWY，VSLIDW，VSLIEW，VSLIWE，F(xiàn)SLEEW，VSDLDW，VSDLEW，VSYIDW，VSYIWE(上述所有氨基酸在pH值為5.5時固定Npra)，VSIDWY，VS正WY，VSIWWY，VSIIWY，VSYIWY，VSVIWY，VSFIWY，VSFIWE，VSIFEW，VSIFWE，F(xiàn)SIFEW，WSIFEW，VSLIWY，VSLIDW，VSLFEW，VSLIWE，F(xiàn)SUEW，WSL正W，F(xiàn)SYFEW，F(xiàn)SFYEW，WSFYEW，F(xiàn)SYIEW，WSYIEW(上述所有氨基酸在pH值為7.3時固定Npro)，AFYTWYA，AFYRWYK，AFYRWY，AFYRWYA，AFFRWYA，AFGRWYA，AFHRWYA，AFIRWYA，AFLRWYA，AFMRWYA！AFNRWYA！AFPRWYA，AFQRWYA！AFRRWYA！AFSRWYA賃AFTRWYAAFVRWYAAFYRWYA，AFYFWYA，AFYGWYA，AFYLWYA，AFYMWYA，AFYNWYA，AFYPWYA，AFYTWYA，AFYVWYA，AFYWWYA，AFYYWYA，AKWFRYA，VSRNWY,ASRNWYA，ASRFWYA，F(xiàn)SRNWYA，VFRNWYA，VWRNWYA，VYRNWYA，VSRAWYA，VSRFWYA，VSRWWYA，VSRYWYA，VSRNFYA，VSRNYYA，VSRNWFA，VSRNWWA(上述所有氨基酸對于在53至57位氨基酸殘基上具有EDDIE序列的NpTO突變體具有極強(qiáng)的親和力)，Ac-AFYTWYAK,Ac-AFYRWYKK，Ac-AFYRWYK，Ac-AFYRWYAK，Ac-AFFRWYAK，Ac-AFGRWYAK，Ac-AFHRWYAK，Ac-AFIRWYAK，Ac-AFLRWYAK，Ac-AFMRWYAK，Ac-AFNRWYAK，Ac-AFPRWYAK，Ac-APQRWYAK，Ac-AFRRWYAK，Ac-AFSRWYAK，Ac-AFTRWYAK，Ac-AFVRWYAK，Ac-AFYRWYAK，Ac-AFYFWYAK，Ac-AFYGWYAK，Ac-AFYLWYAK，Ac-AFYMWYAK，Ac-AFYNWYAK，Ac-AFYPWYAK，Ac-AFYTWYAK，Ac-AFYVWYAK，Ac-AFYWWYAK，Ac-AFYYWYAK，Ac-AKWFRYAK，Ac-VSRNWYK，Ac-ASRNWYAK，Ac-ASRFWYAK，Ac-FSRNWYAK，Ac-VFRNWYAK，Ac-VWRNWYAK，Ac-VYRNWYAK，Ac-VSRAWYAK，Ac-VSRFWYAK，Ac-VSRWWYAK，Ac-VSRYWYAK，Ac-VSRNFYAK，Ac-VSRNYYAK，Ac-VSRNWFAK，Ac-VSRNWWAK，YWKA，Ac-YWKAK，YKYA，Ac-YKYAK，YWRA，Ac-YWRAK，ARWY，Ac-ARWYK，YWRA，Ac-YWRAK(由于N端乙酰化作用和C端賴氨酸化作用(lysination)，上述所有肽已經(jīng)改進(jìn)了對底物的固化能力)。任何可以固定肽配基的基質(zhì)都能使用于本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)的肽親和色譜。優(yōu)選德國達(dá)姆施塔特Merck公司的Fractogelepoxy(M)或CIM-epoxy的"整體式色譜介質(zhì)"。配基可以直接固定在經(jīng)過化學(xué)激活的色譜基質(zhì)的主要成分上，也可以通過隔離劑或連接劑固定。當(dāng)通過隔離劑連接時，結(jié)合在色譜基質(zhì)上的隔離劑需經(jīng)過化學(xué)激活，以便使配基連接。Fractogelepoxy基質(zhì)與隔離劑結(jié)合使用效果更好。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，隔離劑是通過色譜基質(zhì)首先與二氨基二丙胺(diaminodipropylamine)(DADPA)發(fā)生反應(yīng)之后再與琥珀酐(SA)發(fā)生反應(yīng)得來的。隔離劑的終端羧基經(jīng)過化學(xué)激活之后優(yōu)選與一個終端氨基相連。通過隔離劑的反應(yīng)基團(tuán)配基被固定在基體上，或者固定在隔離劑上。針對肽配基的反應(yīng)基團(tuán)可以是氨基團(tuán)，羧基團(tuán)或者巰基團(tuán)。在本發(fā)明中，優(yōu)選通過氨鍵使肽固定在基質(zhì)或隔離劑上。當(dāng)融合多肽被固定在色譜體系中后，未被固定的雜質(zhì)成分便能夠很容易的從色譜柱上清洗下來。這些雜質(zhì)成分可能是例如宿主細(xì)胞多肽以及聚集在包涵體內(nèi)或吸附在包涵體上的核酸，這些核酸被溶解之后依然存在于多肽溶液之中，還有酶細(xì)胞破壞之后的殘余成分。清洗之后，固定在色譜柱上就只剩下融合多肽，因此接下來的步驟都是在純化的體系中進(jìn)行的。融合多肽在離液序列高、使失活的環(huán)境下固定在色譜柱上。固定之后將環(huán)境改變?yōu)閏osmotropic環(huán)境，以進(jìn)行誘導(dǎo)再折疊。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，融合多肽的再折疊操作是通過改變緩沖液將離液序列高的環(huán)境改變至cosmotropic的環(huán)境得以進(jìn)行的?？梢灾饾u地或瞬間將離液序列高的緩沖液替換成cosmotropic的緩沖液。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，可以將離液序列高的緩沖液逐漸替換為cosmotropic緩沖液，此時緩沖液的作用類似一個塞子(plug)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施例中，也可以將離液序列高的緩沖液瞬間替換為cosmotropic緩沖液。緩沖液交換過程中如果調(diào)節(jié)溫度將會大大促進(jìn)融合多肽在色譜柱上的固定和/或再折疊和剪切?？梢允褂美缋鋮s套/加熱套的方法。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施例中，使用冷卻套/加熱套作為溫度調(diào)節(jié)；如果能預(yù)先將緩沖液的溫度控制在所需范圍之內(nèi)更好，這樣就可以達(dá)到溫度調(diào)節(jié)的目的了。當(dāng)填充層中的環(huán)境改變時，融合多肽開始進(jìn)行再折疊，并激活其具有自我蛋白水解功能部分的活性。之后，在自我蛋白水解部分的特異性所決定的位置上，將融合多肽c端的所需要的多肽剪切下來，因此所需的多肽便形成了一個同源N端。根據(jù)融合多肽再折疊的時間，當(dāng)填充層中所有離液序列高的緩沖液都被替換時，慢慢減小cosmotropic緩沖液中移動相的速度或?qū)⑵渫Ｖ?。?dāng)再折疊進(jìn)行完畢后，通過繼續(xù)添加cosmotropic緩沖液將剪切下來的所需要的多肽清洗出來。通過傳統(tǒng)的方法將融合多肽N端具有自我蛋白水解功能的部分以及未剪切的融合多肽洗脫出來，例如，使用較高的鹽濃度，改變pH值或NaOH使色譜材料再生?？梢允褂媚軐⒆晕业鞍酌笍奈絼┥蟿冸x的緩沖液來清洗填充層，使色譜材料再生。這些緩沖液包括酸溶液、堿溶液或有機(jī)溶劑。在填充層中重新添加起始緩沖液/離液序列高的緩沖液便可進(jìn)入新一輪的循環(huán)。因?yàn)橛袝r剪切速度無法達(dá)到預(yù)期高度值，所以可以將再生階段中從色譜柱上清洗下來的未剪切的融合多肽再次返回至下一循環(huán)。根據(jù)所選的緩沖液不同，所得的多肽可能為部分再折疊或完全再折疊。在本發(fā)明中，被洗脫出來的所需多肽可能為部分再折疊或完全再折疊，當(dāng)然完全再折疊最好。在本發(fā)明中，有可能存在融合多肽上自我蛋白水解功能的部分可以完全再折疊，而所需的多肽保持部分未再折疊。當(dāng)所需的多肽具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)如二聚體或三聚體，或者包括彌補(bǔ)基(prostheticgroup)或輔助因素(cofactor)時，就可能產(chǎn)生上述現(xiàn)象。需要特殊的環(huán)境才能對該種所需的多肽進(jìn)行完全再折疊?？梢酝ㄟ^例如質(zhì)子力(protonicstrength)和pH值或完全清除再折疊過程中通常添加的去污劑等采用分別的步驟來形成上述特殊的環(huán)境，使得折疊逐漸得以完全進(jìn)行。在本發(fā)明中，可以對環(huán)境進(jìn)行任意修改使得融合多肽保持吸附在色譜柱上。本發(fā)明也闡述了用于本發(fā)明中的寡肽配基和上述CSFV的1ST。的衍生物。本發(fā)明同樣涉及寡肽配基和上述CSFV的N^的衍生物在本發(fā)明中的用途。除非特別說明，這里所用到的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義均與本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的含義相同。通過下列實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了更進(jìn)一步的描述，該實(shí)施例僅以說明使用并無限制。特別的，下列實(shí)施例涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1:通過使用肽親和色譜和不同種類的融合多肽制備本發(fā)明異源多肽的方法。1.1.使用瘟病毒的NPr。自我蛋白酶制備異源多肽本實(shí)施例描述了瘟病毒自我蛋白酶6xHis-NpTO的融合多肽GFPmut3.1的制備過程，從而，再折疊和剪切是在肽親和基質(zhì)上進(jìn)行的。以下實(shí)施例中，用于與Npro的融合構(gòu)建的GFPmut3.1是GPF的突變體，GFP非常適用于在大腸桿菌中制備。GFPmut3.1具有下列氨基酸序列替代S2被替換為R，S65被替換為G，S72被替換為A。整個融合結(jié)構(gòu)的第178至415位氨基酸序列被命名為6H-sNp-Gmut3.1-Pet30a，參見Gmut3.1的氨基酸序列。在1.2.1.1和1.2.1.2中描述了6H-sNp-Gmut3.1-Pet30a載體的結(jié)構(gòu)。在以下的1.2.2中描述了宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程。l.1.l色譜裝置實(shí)施例1中所使用的色譜是通過AeKTA100Explorer色譜體系(AmershamBiosciences)實(shí)現(xiàn)的。將制備好的肽親和吸附劑填入HR5色譜柱中(5mmi.d.，AmershamBiosciences)。凝膠體積約為lml。l.1.2寡肽配基的準(zhǔn)備實(shí)施例1中所使用的寡肽配基按如下方法制備固相肽的合成是在433A肽合成器(AppliedBiosystem，維也納，奧地利)中通過Fmoc-protected氨基酸(Bachem，Bubendorf，瑞士)的1-羥基-1H-苯并三唑/N,N，-二環(huán)己基碳酰亞胺(1-hydroxy-1H-benzotriazol/N，N'-dicyclohexylcarbodiimide(HOBt/DCC))活化作用得以進(jìn)行。肽在4-羥甲基-苯氧基甲基-共聚苯乙^4-hydroxymethyl-phenoxymethyl-copolystyrene-)l%二乙烯基苯樹脂(HMP樹脂，Wang樹脂)上合成。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)為酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的叔丁基(T-Bu)，谷氨酸、天冬氨酸的OtBu，賴氨酸、色氨基酸的tert-丁氧基羰基(tert-butoxycarbonyl)(Boc)，以及半胱氨酸、組氨酸、天門冬素、谷氨酰胺的三苯甲基(Trt)。對于第一個氨基酸的偶合使用4-二甲基氨基吡啶(DMAP)作為催化劑。第一個氨基酸偶合之后，使用苯甲酸酐進(jìn)行加帽步驟(cappingstep)。使用20%的哌啶完成Fmoc基的脫保護(hù)。通過含有95%的三氟乙酸(TFA)，2.5%的水和2.5%的三異丙基硅烷(TIS)的剪切混合物的反應(yīng)進(jìn)行側(cè)鏈的脫保護(hù)及其從樹脂上的剪切。使用二氯甲洗脫之后，通過多次進(jìn)行醛醚沉淀法然后再進(jìn)行凍干法便可純化粗氨基酸(crudepeptide)。使用帶有P3500泵(AmershamBiosciences,烏普薩拉，瑞士)和Luna15|iC18(2)250x21.2mm色譜柱(Phenomenex，Torrence，力口拿大，美國)的反相高效液相色譜，使用線性梯度為5-50。/。的乙腈和水(0.1。/。TFA)，其流量為30ml/min，便可對氨基酸進(jìn)行進(jìn)一步的純化。使用帶有HP1090液相色譜(HewlettPchard，美國)和Luna3pCI8(2)100x4.6mm色譜柱的分析反相高效液相色譜，使用線性梯度為每分鐘1°/。的乙腈，便可確定氨基酸的純度。可通過激光解吸附電離-飛行時間質(zhì)譜儀(ThermoBioanalysis，Hempstead,英國)輔助基質(zhì)來測定同源性和同一性。l.1.3親和基質(zhì)的制備實(shí)施例1中所使用的親和基質(zhì)按如下方法制備lOgFractogelepoxy(M)(Merk，達(dá)姆施塔特，德國)與50ml1M的二氨基二丙胺(Diaminodipropylamine(DADPA))在室溫條件下反應(yīng)48個小時。反應(yīng)完畢之后,用50ml10mM的HCL和3遍50ml的水清洗凝膠。凝膠在水中重懸浮，加入0.1M的NaOH和2g琥珀酐(succinicanhydrid)將pH值調(diào)節(jié)至7.0。溫和攪拌30min之后再加入10M的NaOH和2g琥珀酐(succinicanhydrid)使pH值達(dá)到7.0。再經(jīng)過30min的溫和攪拌之后，使用50ml0.1M的NaOH，50ml的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)，三遍50ml的水和20%的乙醇清洗凝膠。經(jīng)過抽吸干燥(suctiondrying)之后在4°C條件下保存凝膠。1.1.4羧基的激活和肽的固定實(shí)施例1中的親和基質(zhì)通過如下方法被激活如1.1.3中所述，lg濕Fractogel經(jīng)過DADPA-SA隔離劑(spacer)修飾之后，再用5ml的乙腈清洗兩遍?；罨饔猛ㄟ^將3ml0.1M的琥珀酰亞胺基三氯乙烷碳酸酯(Succinimidyltrichloroethylcarbonate)和0.1M的三乙胺在乙腈中溶解3個小時得以進(jìn)行。最后使用乙腈和ImM的HCL清洗凝膠。肽AFYRWYA以3mg/ml的濃度溶解在PBS中。迅速將5ml肽溶液加入凝膠中并使其反應(yīng)24個小時。將肽VSFIWYK溶解在含有0.1M三乙胺的二甲基甲酰胺(DMF)中。將5ml肽溶液迅速加入凝膠中并使其反應(yīng)24個小時。通過對樣品偶合前后進(jìn)行反相高效液相色譜分析便可確定偶合產(chǎn)率。肽在CIM-epoxy上的固定將肽溶解在100mM的pH值為10.0，含有0.15M的NaCL的Na2CCb緩沖液中。由廠商提供的卡盤(cartrige)中安裝有一個CIM-盤，在室溫下使用PI泵(AmershamBiosciences)緩慢的循環(huán)抽取肽溶液使其經(jīng)過CIM-盤，此過程持續(xù)48個小時。通過對樣品偶合前后進(jìn)行反相高效液相色譜分析便可確定偶合產(chǎn)率。偶合完成之后在pH值為10.0的條件下使用0.5M的乙醇胺對剩余的環(huán)氧基進(jìn)行48個小時的嵌段(block)。l.1.5融合多肽的表達(dá)在10升的發(fā)酵罐培養(yǎng)含有具有6xHis-tag和C端融合的GFPmut3.1的NproN端的自我蛋白酶，表達(dá)融合多肽大腸桿菌重組體HMS174(DE3)。融合多肽的氨基酸序列如下所示SEQIDNO23:1MHHHHELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRG6061DIRTTIiBDLPPKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEE"FDEAQFCEV120121TKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNPENCMiWVTSCSGTMRK180181GEBLFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTT240241FGrcVQCFRRYPDHMKQHDFFKSflMPEGYVQEMIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVHRI300301ELKGIDFKEDGNILGHKLETtNTOSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQ360361QNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSRLSKDPNEKRDHHVLLEFVTAAGITBGMDELYK細(xì)菌宿主細(xì)胞，也就是表達(dá)菌株(expressionstrain),其培養(yǎng)是按照已知的微生物學(xué)方法實(shí)踐(microbiologicalpractice)進(jìn)行的。一般情況下，表達(dá)菌株是由單克隆在培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成的，當(dāng)然也可以使用低溫的細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞銀行)。通常需要經(jīng)過多級工藝培養(yǎng)菌株來獲得足夠的生物量以備后用。在小規(guī)模培養(yǎng)情況下，可以在搖瓶中進(jìn)行，大多數(shù)情況使用復(fù)合培養(yǎng)基(例如LB肉湯培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。也可以使用成分明確的培養(yǎng)基培養(yǎng)基(例如檸檬酸鹽培養(yǎng)基)。首先要對宿主細(xì)胞(使用單克隆接種或低溫培養(yǎng)(cryo-culture)的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行接種)進(jìn)行小體積的預(yù)培養(yǎng)(pre-culture)，一般情況下，此培養(yǎng)過程中的溫度對于后續(xù)的表達(dá)結(jié)果不是關(guān)鍵的，所以慣常在相對高的溫度下(例如30。C或37°C)進(jìn)行培養(yǎng)。主要的培養(yǎng)過程是在較大的體積(例如500ml)內(nèi)進(jìn)行的，此過程尤其需要保證良好的通風(fēng)(與內(nèi)含物的體積對比，高速旋轉(zhuǎn)大體積搖瓶)。由于希望表達(dá)以不溶的包涵體的形式進(jìn)行，所以大部分情況下，主要的培養(yǎng)過程也需在相對較高的溫度(例如3(TC或37°C)下進(jìn)行。誘導(dǎo)系統(tǒng)非常適用于制備包涵體(例如含有trp，lac，tac，phoA啟動子)。當(dāng)達(dá)到對數(shù)生長晚期(latelogarithmicphase)時(通常為當(dāng)搖瓶中的光學(xué)密度為0.5至1.0時)，添加誘導(dǎo)物(例如吲哚丙稀酸，異丙基-P-D-硫代半乳糖苷二IPTG)然后持續(xù)進(jìn)行1到5小時的孵育(incubation)。在此期間，大多數(shù)的NpTO融合多肽以包涵體的形式在細(xì)胞質(zhì)中沉淀下來?？梢允占罱K形成的細(xì)胞并對其進(jìn)行進(jìn)一步的處理。在大規(guī)模培養(yǎng)情況下，多級體系由大量的生物反應(yīng)器(發(fā)酵罐)組成，在這種情況下優(yōu)先使用成分明確的培養(yǎng)基以改進(jìn)整個方法的工藝工程控制(processengineeringcontrol)。另夕卜，通過在培養(yǎng)基中定量添加特殊的營養(yǎng)(分批次(fedbatch))還可以大大增加生物量和生產(chǎn)量。此外，此工藝與使用搖瓶培養(yǎng)類似。例如，使用一個初期發(fā)酵罐和一個主要發(fā)酵罐，選擇與搖瓶工藝內(nèi)相似的培養(yǎng)溫度。在初期發(fā)酵罐中使用在搖瓶中由單克隆或低溫培養(yǎng)物(cryoculture)培養(yǎng)得來的所謂的接種物(inoculum)進(jìn)行接種(inoculate)。在發(fā)酵罐中，尤其是在主要培養(yǎng)過程中必須還保證良好的通風(fēng)以及充足的誘導(dǎo)物濃度。然而，在某些情況下，誘導(dǎo)期的時間必須明顯大于搖瓶過程中的時間。最終形成的細(xì)胞被進(jìn)行進(jìn)一步處理。l.1.6包涵體的分離收集最終形成的細(xì)胞之后，將細(xì)胞(濕重850g)懸浮在pH值為8.0的含有2500ml的50mM的Tris/HCL，5mM的EDTA和1%的TritonX-100的溶液中。冷的懸浮液在800bar的壓強(qiáng)下三次通過APV-2000高壓均質(zhì)器(Invensys)使細(xì)胞得以破裂。在經(jīng)過高壓均質(zhì)器的過程中，用冰塊冷凍懸浮液，用Ultraturrax使細(xì)胞均質(zhì)化。對勻漿進(jìn)行低速(JLA10.500，7500rpm，30min)離心分離以獲得含有重組融合多肽的包涵體。1.1.7包涵體的溶解將圓顆粒(pellet)懸浮在pH值為8.0的含有2500ml的50mM的Tris/HCL，5mM的EDTA和1%的TritonX-100的溶液中，然后進(jìn)行離心分離。重復(fù)進(jìn)行此步驟。通過水洗步驟之后，圓顆粒(pellet)便懸浮在水中。得到的包涵體懸浮液被儲存在-2(TC的環(huán)境下以備進(jìn)一步使用。在室溫條件下，使用pH值為7.3的含有50mMTris/HCL、IOM尿素和50mM的DTT的溶液以1:5的比例對包涵體懸浮液進(jìn)行稀釋。通過離心分離將不溶解的成分清除出來。獲得約為15mg/ml的多肽濃度。使用pH值為7.3的含有50mMTris/HCL、100mM的NaCL和4M的尿素的溶液對多肽溶液進(jìn)行稀釋直至多肽濃度達(dá)到約2mg/ml。l.1.8融合多肽在色譜柱上的固定將0.5ml的多肽溶液加入Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK(0.5x0.5cm)基質(zhì)中，借此該多肽的制備及結(jié)合按照l丄2和l丄3中所述的方法進(jìn)行。使用pH值為7.3的50mMTris/HCL、100mM的NaCl和4M的尿素以50cm/h的流速對色譜柱進(jìn)行平衡。注入樣品之后，該流速增加至150cm/h。l.1.9未固定雜質(zhì)的清洗使用5倍色譜柱體積的平衡緩沖液對未固定成分進(jìn)行清洗。之后更換為再折疊緩沖液，特別是pH值為7.3的含有0.5M的Tris/HCl、2mM的EDTA、3%的丙三醇和5mM的DTT的緩沖液，該緩沖液體積為4.5倍色譜柱體積。1.1.10再折疊、剪切和洗脫將離液序列高的環(huán)境改變至cosmotropic環(huán)境之后，通過停止緩沖液的流動使融合多肽在色譜樹脂上進(jìn)行25個小時的再折疊?；钚缘淖晕业鞍酌笇端的GPFmut3.1剪切下來。使用再折疊緩沖液以50cm/h的低流速進(jìn)行洗脫，經(jīng)熒光測試器以及SDS-PAGE確定，洗脫出的物質(zhì)為純凈的天然GPFmut3.1。l.l.ll再生使用0.1M的NaOH，以50cm/h的低流速對色譜樹脂進(jìn)行再生操作。1.2使用瘟病毒的Npro自我蛋白酶的衍生物制備異源多肽本實(shí)施例描述了瘟病毒Npro自我蛋白酶的突變體(6xHis-NproEDDIE)的融合多肽GPFmut3.1的制備，此制備過程中，再折疊和酶切都是在肽親和基質(zhì)上進(jìn)行的。寡肽配基和親和基質(zhì)的制備如實(shí)施例1.1中所述，使用與實(shí)施例1中相同的色譜裝置。1.2.1質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)1.2.1.17H-Np-Gmut3.1-pET30a質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)一個含有截去N端的(N-terminallytruncated)、N端帶有7-Histag的!ST基因的DNA片段從NP6-pET(Sandoz)質(zhì)粒上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并經(jīng)由Ndel和Kpnl(Asp718)限制位點(diǎn)(restrictionsites)被插入到pET-30a(#69909-3，2002-2003catalogue,Novagen，CNBioscience公司，MerckKgaA，達(dá)姆施塔特，德國)中。引物對T7,ET(SEQIDN024):5'-GAAATTAATACQACTCACTATAGO"3';NTR<Kpn(SEQIDNO25):5'-ATACGGTACCAGAGCAACTAGTTACCCATAATW通過接合反應(yīng)(ligationreaction)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5alpha(#10643-013，Invitrogencatalogue2003，InvitrogenLifeTechnologiesCorporation,1600FaradayAvenue,POBox6482Carlsbad,加利福尼亞，92008)，從轉(zhuǎn)化的克隆體中分離出來DNA質(zhì)粒，經(jīng)測序確認(rèn)所得為7H-NpTO-pET30a質(zhì)粒。GFPmut3.1質(zhì)粒也可以通過pGFPmut3.1質(zhì)粒(#6039-1，catalogue1999，BDBiosciencesClonetech，1020EastMeadowCircle,PaloAlto，加拿大94303-4230，美國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對GFPF>Kpn(SEQIDNO26):5'-GAAAGGTACCATGCOTAAAGGAGAAG~3'GFPR>Sal(SEQIDNO27):5'-TAAGTCGACTTATTTGTATAGTTCATCCATGO>3'通過凝膠離析并經(jīng)由Kpnl-Sa/1限制位點(diǎn)(restrictionsites)克隆到7H-N^-pET30a結(jié)構(gòu)中，結(jié)果在剪切位點(diǎn)之后形成SGT(絲氨酸-氨基乙酸-蘇氨酸)氨基酸序列。經(jīng)證實(shí)，7H-Np-Gmut3.1-pET30a結(jié)構(gòu)的氨基酸序列如上所示。1.2.1.26H-sNp-Gmut3.1-pET30a質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)Npro-胰島素原的DNA序列(SEQIDNO28):ATGGAACTCAATCATTTCGAACTGCTCTACAAAACTAGCAA6CAAAAACCTGTTGGCGTTGAAGA6CCG6TCTACGATACTGCAGGTCGTCCTCTmTGGGAATCCGTCCGAAGTGCACCCCCA6TCAACCCTCAA6CTTCCCCATGACCGCGGACGCGGTGACATTCGTACAACGCTGCGCGATCTGCCTCGTAAAGGCGATTGTCGCTCTGGAAACCACCTAGGTCCGGTGTC6GGCATTTACATTAAACCAGGTCCCGTCTATTACCAAGACTACACTGGTCCGgTTTACCATCGTOCACCTCTGGAATTCTTTGATGAAGCTCAATnTQCGAAGTGACTAAACGTATTGGCCGTGTAACCGGTTCGGACGGGAAACTGTACCACATCTAC|GTGTGCGTTGATgGCTGTATCCTGCTGAAACTCGCOAAGCGCG6AACCCCTCGCACCCT6AAATGQATCCGTAACTTCACTAACTGTCCACTOTG6GTCACTAGTTCCTTCGTTAACCAACATCTGTGCGGTTCACACCTTGTGGAAGCCCTGTATCTGGTGTGTGGCGAACGCGGATTCTTTTATACCCCGMAACGCGGCGCGAAGCCGAAGATCTTCAGGTTGGTCAAGTCGAACTGGGCGGAGGTCCGGGAGCCGGGAGCCTGCAACCGCTGGCGCTTGAAGGGTCGCTGCAAAAACGCGGTATTGTTGAACAGTGCTGTACCTCCATCTGCTCTCTGTATCAGCTGGAAAACTACTGCAATTAATAA該DNA序列經(jīng)過定制合成(custom-synthesized)并被插入到OperonBiotechnologies公司(1000AtlanticAvenue，Suite108Alameda,加拿大94501，美國)的pUC119(NCBI弁U07650:NationalCenterforBiotechnologyInformationPlasmidDatabase，NationalLibraryofMedicine,Building38A，Bethesda，馬里蘭20894，美國)中。從這種質(zhì)粒，粗體表示的N^-胰島素原(pro-insulin)的序列可以通過下列引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增6H"N"""f-Ndel(SEQIDNO29):5'-CTCTCATATGCATCACCATCATCATCACGAACTCAATCAT7TCGAACTGCTC-3"和lns-R-Sall{SEQIDNO30):5.-CTTTCGTCGACTTATTAATTGGAGTAGTTTTc-3通過瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取(gelextraction)分離最終獲得的片段，并通過新形成的Ndd和Sail(粗體字母)的限制位點(diǎn)(restrictionsites)接合到pET30a載體(#69909-3，2002-2003catalog,Novagen，CNBiosciences公司，MerkKgaA，達(dá)姆施塔特，德國)中，并在同樣的限制位點(diǎn)處剪切形成6H-slSr-Ins-Pet30a。所述的6H-sNpro-Ins-Pet30a在Spel和Sa/1的限制位點(diǎn)上被剪切，通過凝膠電泳和凝膠提取(extraction)將較長的片段分離出來，從而刪除胰島素原序列。插入之前的準(zhǔn)備工作是使用相同的酶消化載體7HNp-Gmut3.1-pET30a(結(jié)構(gòu)見12丄1)并使用凝膠提取(gelextraction)將編碼GFPmut3.1的準(zhǔn)確的DNA片段分離出來。將DNA片段接合在準(zhǔn)備好的載體中，得到6H-sNp-Gmut3.1-pET30a結(jié)構(gòu)。其DNA序列如1.2.1.1中所示。1.2.1.3S-Np-Ins-Pet30a的結(jié)構(gòu)對含有Npro-pro-insulin的DNA序列的構(gòu)造進(jìn)行定制合成(custom-synthesized),并將其插入至ljOperonBiotechnologies公司的pUC119中。使用下列引物對對所需的N^-pro-insulin的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增N"^-F"Ndel<SEQIDNO31):5'"CGCGACATATGGAACTCAATCATTTCGAAC-3'和lns<R~Sal，(SEQIDNO30)經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取分離最終形成的片段，并通過新形成的Ndel和Sail(粗體字母)的限制位點(diǎn)接合在載體pET30a中，并在相同的限制位點(diǎn)剪切。sNpra-Ins-pET30a質(zhì)粒的DNA序列如1.2丄1中所示。1.2.1.46H-EDDIE-sGmut3.1-Pet30a質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)對含有Npro-pro-insulin的DNA序列的構(gòu)造進(jìn)行定制合成，并將其插入到OperonBiotechnologies公司的pUC119中。使用下列引物對對所需的Npro-pro-insulin的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增『F"Nde'(SEQIDNO31)和N^"R-Sal1(SEQIDNO32):5.-CGCAGAGATG7TGGTCGACGCTGCAACTAGTG-3'經(jīng)由新形成的Ndel和Sail(粗體字母)的限制位點(diǎn)將其插入到形成pET30a載體中形成S-NP-6H-pET30a。對S-Np-6H-pET30a使用兩個標(biāo)準(zhǔn)50jilPCR反應(yīng)擴(kuò)增Npro的序列第一個反應(yīng)使用50pmol的Npro-F-Ndd引物(見表1)和50pmol回向突變引物(3'-)，5單位的TaqDNA聚合酶(#GC002004，2004catalog,Genecraft，Treskow街10，D-48163明斯特，德國)，lxPCR緩沖液(弁GC00206，2004catalog,Genecraft)和20nmol的各種dNTP混合物(#GC013004，2004catalog,Genecraft);第二個反應(yīng)使用50pmol的Npro-R-S引物見下表1)和50pmol正向突變引物(5，-)，5單位的TaqDNA聚合酶，lxPCR緩沖液和20nmol的各種dNTP混合物。PCR反應(yīng)在一個加熱的熱循環(huán)罩中進(jìn)行，其內(nèi)使用下列程序94℃:3min;25個循環(huán)94℃:30sec，54℃;30sec，68℃:lmin;最后在68℃下孵育7min。按照廠商建議(QIAquick⑧Spin手冊，2002年7月)使用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN股份有限公司，Qiagen街l，D40724Hilden，德國，Cat.Nr.28106，QiagenProductGuide2004)清除游離引物。將百分之一的兩種PCR聯(lián)合起來并使用50pmol的Npro-F-Ndel引物(SEQIDNO.31)和50pmol的Npra-R-Sall引物(SEQIDNO32)、5單位的TaqDNA聚合酶(Genecraft)、lxPCR緩沖液(Genecraft)和20nmol各種dNTP混合物(Genecraft)將其在加熱的熱循環(huán)套中擴(kuò)增，熱循環(huán)套中使用下列程序94℃:3min;25個循環(huán)94℃:30sec，54℃:30sec，68℃:lmin;最后在68℃下孵育7min。按照廠商建議使用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN)清除游離引物。經(jīng)由Ndel和Sail限制位點(diǎn)，PCR片段被插入到pET30a載體中。之后此構(gòu)造被用于突變步驟。氨基酸通過六個連貫的步驟一個接著一個的改變，各自引物的選擇如下表l中所示。通過上述DNA序列分析(見1.2丄1)可以控制每一個步驟中出來的質(zhì)粒。通過下列引物對的簡單PCR反應(yīng)完成最后一個突變步驟(I155T和F158T)。NIXO-F－Ndel(SEQIDNO31)和3'－155T,F158T(SEQIDNO33):5'-GCAACTAGTGACCCAGAGTGGACAGTTAGTGGTGTTACGGGTCCATTTGAGG-3'得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)由Ndel和Spel(粗體，見下表l)限制位點(diǎn)被插入到S-Np-6H-pET30a中。通過上述DNA序列分析(1.2.1.1)可以確定EDDIE-6H-pET30a構(gòu)造的序列。表1:<table><row><column>5'-C112E</column><column>SEQIDNO34:GCTCAATTTGAGGAAOTGACTAAACG</column></row><row><column>3'-C112E</column><column>SEQIDNO35:CGTTTAGTCACTTCCTCAAATTQAGC</column></row><row><column>5'一C134E</column><column>SEQIDNO36:CATCTACGTGQAGGTTGATGGC</column></row><row><column>3'一C134E</column><column>SEQIDNO37:GCCATCAACCTCCACGTAGATG</column></row><row><column>5'-C138E</column><column>SEQIDNO38:GTTOAT。GCGAGATCCTGCTG</column></row><row><column>3'一C138E</column><column>SEQIDNO39:CAGGAGGATCTCGCCATCAAC</column></row><row><column>5'一A109T,V114T</column><column>SEQ，DNO40:CTCGAATTGTTTGATGAAACCCAATTTGAGGAAACCACTMACGTATTGG</column></row><row><column>3'-A109T,V114T</column><column>SEQIDNO41:CCAATACGTTTAGTCGTTTCCTCAAATTGGGTTTCATCAMGAATTCCAG</column></row><row><column>5'_R53E.G54D,R57E</column><column>SEQIDNO42:CATGACCGCGGAGAAGATGACATTGAAACAACGCTGC</column></row><row><column>3'一R53E,G54D,R57E</column><column>SEQIDNO43:GCAGCGTTGTTTCAATGTTCACCTTCTCCGCGGTCATG</column></row><row><column>5'-L143Q</column><column>SEQIDNO44:GATCCTGCTGAAACAGGCGAAGCGCGGAAC</column></row><row><column>3'一L143Q</column><column>SEQIDNO45:GTTCCQCGCTTCGCCTGTTTCAGCAQGATC</column></row><table>在EDDIE-6H-pET30a上使用下列引物對對其進(jìn)行PCR擴(kuò)大可以使用6H-Npro-F-Ndel，(SEQIDNO29)和Npr°-R-Sal，(SEQIDN032)以及最終形成的片段，經(jīng)由S-Np-Ins-pET30a(見1.2丄3)構(gòu)造上的Ndel和Spel(粗體字母)限制位點(diǎn)來替換Npro，形成6H-EDDIE-Ins-pET30a。6H-EDD正-Ins載體被Spel/Sa/1消化，通過凝膠電泳和凝膠提取出較長的片段，從而刪除胰島素原序列。插入過程是在經(jīng)OperonBiotechnologies公司定制制備的pUC119中從含有合成sGFPmut3.1基因(SEQIDNO46)的構(gòu)造上，使用下列引物對(SEQIDNO47和SEQIDNO48)通過PCR得以實(shí)現(xiàn)的。SEQIDNO46TGCAGCAAAGGCQAAGAACTGTTTACCGGTGTGGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATG(3CGAT(3TGAACGGTCATAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGTGMGGCGATGCGACCTATGGTMACTGACCCT(3AAATTTATTTGCACCACCG(3CAAACTGCCGGTGCCGT(3GCCGACCCTGGTGACCACCrrTGGTTATGGCGTGCAGTGCTTTGCGCGCTATCCGGATCACATGAAACAGCATGATTTnTTAAAAGCGCQATGCCGGAA(3GTTATGTGCAGGAACGCACCAH，IIIIIAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCGGAAGTGAAATTTGAAGGTGATACCCTGGTGAACCQCATTGAACTGAMGGCATTGATnTAAAGAAQATGGTAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCQGATAAACAGAAAAACGGTATTAAAGTGAACTTTAAAATTCGCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGTGATGGCCC6GTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGCGCTQAGCAAAGATCCGAACGAAAAACGCGATCACATGGTOCTGCTGGAATTTGTGACCQCGGCGGGTATTACGCATGGCATGGATGAACTGTATAAATAATMsGFP-F"Spe,(SEQ，DNO47):5'"GGATCCACTAGTTGCAGCAAAGGCGAAW和sGFP^R-Sal(SEQIDNO48):5*>CGAGGTCOACTTATTATTTATAGAGTTCAT03'.之后，純化的PCR產(chǎn)物被Spel/Sa/1消化并被接合(ligated)在6H-EDDIE-Ins的Spel/Sa/1片段中，使用sGmut3.1替代胰島素原基，因以形成6H-EDD正-sGmut3.1-pET30a構(gòu)造。每個步驟中的DNA序列都如上所述(見1.2丄1)得以控制。1.2.2轉(zhuǎn)化在1升的細(xì)菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(在37。C、225rpm條件下生長至OD6oo-0.5)。用冰塊冷凍細(xì)胞懸浮液15分鐘(連續(xù)攪拌)，沉淀(pelleted)(4。C，2500g，10min)之后將上清液全部移除。在4°C條件下將剩下的圓顆粒(pellet)再次懸浮在1升的去離子水中，減緩攪拌速度(spundown)(4°C，2500g，lOmin)并通過間歇離心分離步驟(4。C,2500g，lOmin)使用50ml的去離子水(4°C)清洗兩遍。最后使用50ml的10%的已消毒的丙三醇溶液(4°C)清洗圓顆粒，沉淀(4。C，2500g，lOmin)之后將其再次懸浮在2.5ml的10%的已消毒的丙三醇溶液中(4°C)，然后將其冰凍并以40^1的等份儲存在-80。C條件下。使用冰塊將一等份的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞解凍，再進(jìn)行l(wèi)|_il的包含有5ng的DNA的接合反應(yīng)，并在沒有氣泡的情況下將其傳送到電極間距為lmm的電穿孔試管(electroporationcuvette)中。使用包含有BIO-RAD脈沖控制器(Bio-RadLaboratories公司，2000AlfredNobelDrive,Hercules，加拿大94547，美國；cat.n.1652077，LifeScienceResearchProducts1998)的BIO-RAD基因脈沖發(fā)生器(Bio-RadLaboratories公司，2000AlfredNobelDrive,Hercules,加拿大94547，美國；cat.n.1652098，LifeScienceResearchProducts1998)進(jìn)行電穿孑L其內(nèi)參數(shù)設(shè)置為1.5kV，25^F，2000hms，時間常數(shù)不超過4.5ms。此后立即添加180|al的TY培養(yǎng)基(1.0%w/v的蛋白胨，0.7%w/v的酵母浸出物，0.25%w/v的NaCl)，將懸浮液移至14ml的已消毒的塑料管中并孵育30min(37。C，225rpm)。之后將懸浮液放置在選擇培養(yǎng)基上。經(jīng)37°C過夜的孵育便可獲取克隆，將其移至2ml的TY培養(yǎng)基并在37°C、225rpm的條件下孵育過夜。通過標(biāo)準(zhǔn)方法使用1ml的過夜培養(yǎng)物來制備質(zhì)粒，質(zhì)粒的制備受限制性分析(restrictionanalysis)和DNA測序支配。經(jīng)過序列分析之后質(zhì)粒被用于表達(dá)菌株中更進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化(transformation)，其方法將在本文中闡述。1.2.3融合多肽的表達(dá)重組大腸桿菌HMS174(DE3)包含一個表達(dá)融合多肽的pET30質(zhì)粒，該融合多肽具有N端自我蛋白酶6H-NpTOEDDffi，C端為GFPmut3.1，其氨基酸序列如下所示，上述重組大腸桿菌的培養(yǎng)是在裝有1.8升的LB培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行的。SEQIDNO餘1MHaHHHHKUIHFBLLYKTSKQKPV6VEEPVYDT旭RPIiFGHPSEVHPQSTLKLPHDR6ED6061DIETTLRDLPRKGDCRS咖LGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEF咖TQFEET120121TKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEIIiLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSCSKGEEL180181FTGWPILVEIiDGDVNG啦SVSGEGBGDRTYGKLTLKilCTTKOjPVPHPTLVTTPGTC240241VQCFRRYPDH卿HDFFKSAM鵬YVQERTIFFKDDG咖TSABVKETBGDTLVNRIEliTO300301IDFKBD6NILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQ抑GIKVNFKIRBNIEDGSVQLADHYQQNTP360361IGDGFVLLPD朋YLSTQSALSKDPMGKRDHHVLLEFVTAAGITHOIDELYK細(xì)胞的培養(yǎng)如l丄5中所述。1.2.4包涵體的分離細(xì)胞的破碎是通過酶得以實(shí)現(xiàn)的。簡要地說，將細(xì)胞懸浮在40ml的pH值為8.2的含有20mM的Tris/HCl、5mM的EDTA、2mM的MgCl2的溶液中。添加72mg的溶解酶和300U的Benzonase。在室溫下孵育45min之后，加入1.3gNaCl和0.5mlTritonX-IOO。再過15min之后，對懸浮液進(jìn)行離心分離(BeckmanJA25.50，10000rpm，15min，4°C)以獲得包涵體。1.2.5包涵體的溶解使用20ml的0.5%的脫氧膽酸對圓顆粒進(jìn)行一次清洗，再使用20ml的lM的NaCl對圓顆粒進(jìn)行兩次清洗，之后再用水清洗。剩余的圓顆粒(濕重約為2g)被懸浮在10ml的水中并保存在-20。C條件下作進(jìn)一步的使用。使用pH值為7.3的含有50mM的Tris/HCl、10M的尿素的溶液以1:5的比例稀釋一等份的懸浮液，從而溶解包涵體。離心分離除去不溶成分之后再使用pH值為7.3的含有50mM的Tris/HCl、100mM的NaCl和4M的尿素的溶液以1:5的比例稀釋上述溶液。1.2.6包涵體的固定將2ml的多肽含量約為2mg/ml的溶液按前述的方法添加到肽親和基質(zhì)上。簡要地說，使用pH值為7.3的含有50mM的Tris/HCl、100mM的NaCl、4M的尿素的溶液平衡Fractogel-DADPA-SA-AFYRWYA。以25cm/h的低速注入2ml的樣品。1.2.7未固定的雜質(zhì)的清洗使用5倍色譜柱體積的平衡緩沖液對未固定成分進(jìn)行清洗，流速為150cm/h。之后更換為pH值為7.3的含有200mM的Tris/HCl、2mM的EDTA、10%的丙三醇的緩沖液進(jìn)行再折疊過程，該緩沖液體積為4.5倍色譜柱體積。1.2.8再折疊、剪切和洗脫停止緩沖液的流動，使固定的融合多肽進(jìn)行25h的再折疊。在再折疊過程中，固定的蛋白酶在其特異位點(diǎn)剪切并釋放出融合成分(fiisionpartner)GFPmut3.1。之后使用pH值為7.3的含有200mM的Tris/HCl、2mM的EDTA、10%的丙三醇的緩沖液以150cm/h的流速對融合多肽進(jìn)行洗脫。收集lml的片段并在280nm吸光率、488nm熒光性和520nm光發(fā)射條件下對其進(jìn)行分析。仍含有融合成分GFPmut3.1的片段通過SDS-PAGE進(jìn)行進(jìn)一步的分析以獲得純化的GFPmut3.1。1.2.9再生洗脫出剪切下來的所需的多肽之后，需要使用5倍色譜柱體積的0.1M的NaOH溶液以150cm/h的流速對色譜柱進(jìn)行再生操作。實(shí)施例2:采用固定金屬例子親和色譜制備異源多肽的方法本實(shí)施例描述了瘟病毒]Sr自我蛋白酶(6xHis-NproEDDIE)突變體的融合多肽GFPmut3.1的制備，在此制備過程中，再折疊和剪切都是在固定金屬離子色譜基質(zhì)上進(jìn)行的。His標(biāo)記被引入融合多肽中使在固定金屬離子親和色譜和多肽親和色譜中都可以使用到相同的構(gòu)造，以便對兩種方法進(jìn)行直接對比。在親和色譜中，融合多肽與寡胎配基的相互作用并不需要標(biāo)記。包涵體的制備和溶解如實(shí)施例1.2.4和1.2.5中所述。2.1色譜柱的準(zhǔn)備，融合多肽在色譜柱上的固定將ChelatingSepharoseFastflow(AmershamBiosciences)以0.5i.d.xScm的層(bed)尺寸填入色譜柱中，用水將儲藏溶液清洗出來。接著將金屬離子NP+裝載在色譜柱上。使用約三分之二的色譜柱體積的100mM的NiCl2或NiSO4。未被固定的NP+離子被清洗出來。使用pH值為7.3的含有50mM的Tris、100mM的NaCl、4M的尿素的溶液平衡色譜柱之后，0.5ml含量約為2mg/ml的多肽溶液會被固定在色譜柱上。裝載流速(loadingflowrate)為50cm/h。2.2未固定的雜質(zhì)的清洗使用5倍色譜柱體積的平衡緩沖液將未固定成分清洗出來之后，將平衡緩沖液改變?yōu)閜H值為7.3的含500mM的Tris/Acetate，0.25M的蔗糖，lmM的DTT的緩沖液。2.3再折疊、剪切和洗脫使用4.5倍色譜柱體積的緩沖液之后停止緩沖液的流動，使融合多肽進(jìn)行再折疊，在再折疊過程中自我蛋白酶將融合成分(fiisionpartner)剪切下來。再次使用lml的流速為150cm/h，pH值為7.3的含有50mM的Tris/Acetate、0.25M的蔗糖、lmM的DTT的緩沖液便可分離出所需的多肽。收集片段，并使用熒光測量裝置和SDS-PAGE對其進(jìn)行分析。2.4再生使用流速為50cm/h，pH值為3.5的含有50mM醋酸鹽、6M的氯化胍對色譜樹脂進(jìn)行再生。實(shí)施例3:NpTOEDDIE-sSPA-D在色譜柱上的剪切本實(shí)施例描述了通過瘟病毒N^自我蛋白酶(NproEDDIE)的突變體的融合蛋白表達(dá)(expression)制備葡萄球菌A蛋白質(zhì)D結(jié)構(gòu)域的過程，再折疊和剪切都是在多肽親和基質(zhì)上進(jìn)行的。通過下列方法制備包含NproEDDIE自我蛋白酶且C端連接有A蛋白質(zhì)D結(jié)構(gòu)域(sSPA-D)的被稱做NHEDDIE-sSPA-D的融合蛋白。重組大腸桿菌HMS174(DE3)包含一個表達(dá)融合多肽的pET30質(zhì)粒，其氨基酸序列如下所示，根據(jù)l丄5中所述，該重組體在101的發(fā)酵罐中培養(yǎng)。整個融合構(gòu)造的1到168位氨基酸為NproEDDIE的序列，169到229位氨基酸為sSPA-D的序列。111213141511MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTL6061RDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGR120121VTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSCADAQQNKFNKDQ180181QSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK包涵體的分離和溶解如實(shí)施例1.1中所述。融合多肽在色譜柱上的固定使用流速為150cm/h，pH值為7.3的含有50mM的Tris/HCl、lOOmM的NaCl、4M的尿素的溶液平衡Fractogel-DADPA-IT-多肽(0.5x5cm)基質(zhì)，各個多肽的選擇和結(jié)合通過之前所述的方法進(jìn)行。使用lml線流速為50cm/h的多肽溶液。當(dāng)注入樣品之后多肽溶液的流速增加至150cm/h。未固定雜質(zhì)成分的清洗使用5倍色譜柱體積的平衡緩沖液清洗未固定成分。之后更換為再折疊緩沖液，特別是pH值為7.3的含有1M的Tris/HCl、2mM的EDTA、0.25M的蔗糖、10M的a-單硫代甘油(a-monothioglycerol)的緩沖液，該緩沖液體積為6倍色譜柱體積。再折疊，剪切和洗脫當(dāng)把離液序列高的環(huán)境改變?yōu)閏osmotropic環(huán)境之后，通過停止緩沖液的流動使融合多肽在色譜樹脂上進(jìn)行25h的再折疊。具有活性的自我蛋白酶將C端連接的sSPA-D剪切下來。使用再折疊緩沖液進(jìn)行最終的洗脫得到天然的sSPA-D。使用流速為150cm/h的10CV的0.2M的NaOH對基質(zhì)進(jìn)行再生。實(shí)施例4:6His-NproEDDIE-GFPmut3.1在色譜柱上的再折疊和剪切本實(shí)施例描述了使用經(jīng)6His-NproEDDIE-GFPmut3.1融合多肽的表達(dá)制備天然GFPmiit3.1的過程，再折疊和剪切在被稱作為Actigel-polyKW的親和基質(zhì)上進(jìn)行。色譜環(huán)境與前面所述相同。實(shí)施例5:NproEDDffi-sSPA-D在色譜柱上的剪切本實(shí)施例描述了使用NpTOEDDIE-sSPA-D融合多肽的表達(dá)制備天然sSPA-D，再折疊和剪切在被稱作為Actigel-polyKY的親和基質(zhì)上進(jìn)行。色譜環(huán)境與前面所述相同。實(shí)施例6:使用陽離子交換色譜在色譜柱上進(jìn)行再折疊粗品(Crude)Npro37-6His((1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168))包涵體提取物(extracts)被懸浮在pH值為7.0的含有8M尿素、50mM的磷酸鈉溶液中。最后得到的蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/ml。2ml裝載在HiTrapSP瓊脂糖FF色譜柱(2.5x0.7cmi.d.;色譜柱體積為lml;GEHealthcare)上，首先使用與上述相同的緩沖液以50cm/h的線流速進(jìn)行平衡。之后將緩沖液改為pH值為7的包含有50mM的磷酸鈉、2mM的EDTA、5%的丙三醇、10mM的a-monothioglycerol(MTG)的緩沖液。在室溫下令蛋白質(zhì)進(jìn)行l(wèi)h的再折疊。進(jìn)一步使用再折疊緩沖液可以將經(jīng)過再折疊和剪切的蛋白質(zhì)洗脫出來。使用pH值為7的含有2M的NaCl、50mM的磷酸鈉可以進(jìn)行再生操作。通過SDS-PAGE分析可以監(jiān)控融合蛋白(6His)的再折疊。權(quán)利要求1、一種使用包含有所需多肽和連接在所需多肽N端的，具有自我蛋白水解功能的多肽的融合多肽制備具有同源N端的異源所需多肽的方法，該方法包括以下步驟a)使用親和色譜體系將融合多肽以可溶的、自我蛋白水解功能失活的形態(tài)固定，b)再折疊融合多肽，以便激活融合多肽的自我蛋白水解功能并使所需的異源多肽剪切，c)隨后洗脫所需的異源多肽，其中所述的步驟都在一個親和色譜體系中進(jìn)行。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的融合多肽是通過細(xì)菌宿主細(xì)胞中以包涵體形態(tài)的重組表達(dá)制備而成，所使用的通過含有編碼融合多肽的核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的具有自我蛋白水解功能的多肽為自我蛋白酶。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是瘟病毒屬的NPm，或其具有自我蛋白水解功能的衍生物。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的瘟病毒屬選自CSFV、BDV或者BVDV。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的N^，其氨基酸序列如下所示SEQIDN01:(1VMELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPWDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIR7TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGmKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRlGRVTQSDGKLYHfYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKW，RNFTNCPLWVTSC-(168)，或?yàn)槠渚哂凶晕业鞍姿夤δ艿难苌锏陌被嵝蛄小?、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的NPro的一種衍生物，其氨基酸序列如下所示SEQIDNO2:(1)－MELNHFELLYKreKQKPVGVEEPVYDTAQRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRK(3DCRSGNHLGPVSGmKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLE汗DEAQFEEVTKR，GRVTGSDGKLYHIWEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC"(1助)08、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的Npro的一種衍生物，其氨基酸序列如下所示SEQIDNO3:(1hMELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDG日LLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCH168)。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的N^的一種衍生物，其氨基酸序列如下所示SEQIDN04:(1H^ELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGmKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKWGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC"(168)。10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的NPre的一種衍生物，其氨基酸序列如下所示SEQIDNO5:(1J"MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVS(31YlKPGPVYYQDYTGPVYHRAPUEFFDErQFEETTKRK3RVTGSD(3KLYHIYVEVDG日LLKQAKRGTPRTIKVVTRNTTNCPLWVTSCH1肪)。11、根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述的親和色譜體系選自固定金屬離子色譜(IMAC)、陽離子交換色譜、陰離子交換色譜、纖維素結(jié)合域色譜或者肽親和色譜。12、根據(jù)權(quán)利要求ll中所述的方法，其中所述的親和色譜體系為固定金屬離子色譜，而且其中所述的融合多肽含有金屬螯合親和標(biāo)記。13、根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其中所述的金屬螯合親和標(biāo)記為多聚組氨酸。14、根據(jù)權(quán)利要求ll中所述的方法，其中所述的親和色譜體系為陽離子交換色譜，而且其中所述的融合多肽含有聚陽離子親和標(biāo)記。15、根據(jù)權(quán)利要求14中所述的方法，其中所述的聚陽離子親和標(biāo)記選自聚精氨酸或者聚賴氨酸。16、根據(jù)權(quán)利要求11中所述的方法，其中所述的親和色譜體系為陰離子交換色譜，而且其中所述的融合多肽包含有聚陰離子親和標(biāo)記。17、根據(jù)權(quán)利要求16中所述的方法，其中所述的聚陰離子標(biāo)記為聚天門冬素。18、根據(jù)權(quán)利要求11中所述的方法，其中所述的肽親和色譜體系中使用長度為5至12個氨基酸長度的、包含色氨酸殘基的寡肽配基，在離液序列高的環(huán)境中，該配基選擇性的與融合多肽上具有自我蛋白水解功能的部分固定，當(dāng)從離液序列高的環(huán)境改變至cosmotropic環(huán)境中時，該配基與融合多肽上具有自我蛋白水解功能的部分仍然保持固疋°19、根據(jù)權(quán)利要求18中所述的方法，其中所述的寡肽配基的長度為6至8個氨基酸的長度。20、根據(jù)權(quán)利要求19中所述的方法，其中所述的寡肽配基的氨基酸序列選自SEQIDNO6:VSIFEW，SEQIDNO7:AVSIEWY，SEQIDNO8:AVSFIWY，SEQIDNO9:VSFIWYK，SEQIDN010:ASRFWYA，SEQIDNO":AFYTWYA，SEQIDN012:AFYRWYK,SEQIDN013:AFYRWY，SEQIDN014:AFYRWYA，SEQIDN015:AVSIFEWY，SEQIDNO16:AVSRNWY，SEQIDNO17:ASRFWY，SEQIDNO1&AFYRWYM,SEQIDNO19:AFYRWY，SEQIDNO20:ASRFWYM，SEQIDNO21:AFYRWYAA，SEQIDNO22:AFYSWYAA。21、根據(jù)權(quán)利要求18中所述的方法，其中所述的根據(jù)SEQIDNO5的天然CSFV的N^的衍生物，用于與選自如下所示的寡肽配基相結(jié)合SEQIDNO10:ASRFWYA，SEQIDN011:AFYTWYA，SEQIDNO12:AFYRWYK，SEQIDN013:AFYRWY和SEQIDNO14:AFYRWYA。22、根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中融合多肽的再折疊步驟通過改變緩沖液將離液序列高的環(huán)境改變至cosmotropic環(huán)境得以實(shí)現(xiàn)。23、根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法中使用的寡肽配基。24、根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項(xiàng)所述的方法中使用的CSFV的Npro的衍生物。25、寡肽配基在權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述方法中的應(yīng)用。26、CSFV的Npro的衍生物在權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述方法中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種使用包含有感興趣的多肽且N端為具有自我蛋白水解功能的多肽的融合多肽來制備具有同源N端的感興趣的異源多肽的方法，這種方法包括以下三個步驟a)使用親和色譜體系將融合多肽以可熔的、自我蛋白水解功能失活的形態(tài)固定起來，b)再折疊融合多肽，以便激活融合多肽的自我蛋白水解功能并使感興趣的異源多肽剪切，c)最后洗脫感興趣的異源多肽，上述三個步驟都在親和色譜體系中進(jìn)行。文檔編號C12N15/62GK101203609SQ200680014323公開日2008年6月18日申請日期2006年4月25日優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日發(fā)明者A·容鮑爾,A·車?yán)斫z尼格,R·哈恩,W·卡爾申請人:桑多斯股份公司;奧地利勃林格殷格翰有限公司