專利名稱：殘粒樣脂蛋白中膽固醇的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殘粒樣脂蛋白(remnant-like lipoprotein)中膽固醇的測(cè)定方法以及測(cè)定試劑。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，伴隨著高齡化，成人病的患病率一直急劇上升。眾所周知?jiǎng)用}硬化在其中，特別是循環(huán)系統(tǒng)疾病，例如心臟病、腦血管系疾病(腦梗等)的發(fā)病中占重要位置。
一方面，膽固醇在血管壁的蓄積對(duì)動(dòng)脈硬化癥的發(fā)展起重要作用，其中涉及到血液中存在的各種脂蛋白。脂蛋白以膽固醇、膽固醇酯、中性脂肪、磷脂以及載脂蛋白為構(gòu)成成分，在這些脂蛋白中，高密度脂蛋白(HDL)中的膽固醇被認(rèn)為是動(dòng)脈硬化癥的危險(xiǎn)因子的負(fù)因子，低密度脂蛋白(LDL)中的膽固醇被認(rèn)為是動(dòng)脈硬化癥的危險(xiǎn)因子的正因子，它們?cè)谂R床檢查領(lǐng)域被頻繁測(cè)定。
但是，近年顯示，與LDL中的膽固醇相比較，如殘粒樣脂蛋白的因脂質(zhì)代謝等生成的脂蛋白中的膽固醇是作為動(dòng)脈硬化癥的危險(xiǎn)因子的更加密切的指標(biāo)。由于這種觀點(diǎn)，高效、簡(jiǎn)便測(cè)定生物樣品中脂蛋白中的膽固醇正在成為一個(gè)課題。
以往，關(guān)于殘粒樣脂蛋白中膽固醇的酶測(cè)定方法，有關(guān)于以下方法的報(bào)道(參考專利文獻(xiàn)1和2，非專利文獻(xiàn)1)，使用固定有脂蛋白中的構(gòu)成載脂蛋白的抗體的凝膠、磷脂分解酶或者表面活性劑，提高測(cè)定的選擇性，通過(guò)使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶發(fā)揮作用，將膽固醇酯變換成膽固醇，再測(cè)定生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶。
但是，在該方法中，在對(duì)殘粒樣脂蛋白的選擇性、操作上的簡(jiǎn)便性·測(cè)定時(shí)間的長(zhǎng)度等方面有優(yōu)點(diǎn)也有缺點(diǎn)，不能說(shuō)十分理想。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開(kāi)平2001-231597號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本專利第2949354號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1動(dòng)脈硬化，25(9，10)，371(1998)
發(fā)明的揭示本發(fā)明的目的在于，提供更加簡(jiǎn)便且高精度測(cè)定殘粒樣蛋白質(zhì)中膽固醇的方法以及進(jìn)行該方法的試劑。
本發(fā)明人，根據(jù)上述情況，著眼于大多膽固醇酯酶除了具有酯酶活性之外，還具有脂蛋白脂肪酶活性，研究了各種測(cè)定脂蛋白中膽固醇時(shí)的條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇與膽固醇酯酶活性相比較，脂蛋白脂肪酶活性的比率更高的膽固醇酯酶，在使用其和膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶測(cè)定脂蛋白中膽固醇時(shí)，對(duì)殘粒樣脂蛋白的選擇性高，可以從高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、乳靡微粒(CM)、超低密度脂蛋白(VLDL)、CM殘粒、VLDL殘粒、中密度脂蛋白(IDL)殘粒等含有脂蛋白的生物樣品中選擇性測(cè)定殘粒樣脂蛋白中的膽固醇。
即，本發(fā)明涉及殘粒樣脂蛋白中膽固醇的測(cè)定方法，它是使含有脂蛋白的被測(cè)樣品與膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶作用，再通過(guò)測(cè)定生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶來(lái)測(cè)定脂蛋白中膽固醇的方法，其特征在于，使用脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12～7000的膽固醇酯酶。
另外，本發(fā)明涉及殘粒樣脂蛋白中膽固醇的測(cè)定試劑，其中含有脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12～7000的膽固醇酯酶，以及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
通過(guò)使用本發(fā)明的測(cè)定方法及測(cè)定試劑，可以極簡(jiǎn)便且靈敏度良好地在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定殘粒樣脂蛋白中的膽固醇。


圖1使用LP酶時(shí)的LDL的反應(yīng)特異性的顯示圖。
圖2使用LP酶時(shí)的HDL的反應(yīng)特異性的顯示圖。
圖3本發(fā)明方法中，對(duì)非結(jié)合-VLDL、結(jié)合-VLDL的反應(yīng)特異性的顯示圖。
圖4添加抗體時(shí)，對(duì)非結(jié)合-VLDL及結(jié)合-VLDL的反應(yīng)性的顯示圖。
圖5本發(fā)明測(cè)定方法及已有的測(cè)定方法(RLP-II)中，測(cè)定血液中的殘粒樣脂蛋白的相關(guān)性的顯示圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的殘粒樣脂蛋白中膽固醇的測(cè)定方法是使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶起作用，再測(cè)定生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶的方法，其中使用了脂蛋白脂肪酶(LPL)與膽固醇酯酶(CE)的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12～7000的膽固醇酯酶。
眾所周知，膽固醇酯酶是將脂蛋白中含有的膽固醇酯加水分解，從而生成膽固醇的酶，但是大多數(shù)的該酶除了具有該酯酶活性之外，還具有脂蛋白脂肪酶活性，即加水分解中性脂肪的脂肪酶活性。本發(fā)明中，必須使用脂蛋白脂肪酶活性較膽固醇酯酶活性更強(qiáng)的酶，具體使用脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12～7000的膽固醇酯酶，通過(guò)這樣，該酶選擇性與殘粒樣脂蛋白作用，將該蛋白質(zhì)中的膽固醇酯選擇性加水分解，結(jié)果，可以選擇性地僅測(cè)定目標(biāo)殘粒樣脂蛋白中的膽固醇。
在此，脂蛋白脂肪酶活性指的是通過(guò)使用了橄欖油乳的脂蛋白脂肪酶活性分析法算出的活性單位(Horiuchi Y.et al.J Biochem 1976；80367-370.)、膽固醇酯酶活性是指通過(guò)使用了小牛血清的CEN活性分析法算出的活性單位(KamenoY.et al.Jap J Clin Path 1976；24650.)。
脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性(以下也簡(jiǎn)稱為“活性比率”))為12～7000，優(yōu)選為20～1000，更優(yōu)選為28～800。
作為具有所述活性比率的膽固醇酯酶，可例舉如LP(旭化成藥業(yè)公司制、活性比率460～800)、LPBP(旭化成藥業(yè)公司制、活性比率5600～6900)、CEN(旭化成藥業(yè)公司制、活性比率13.0～16.0)、CE(天野酶公司制、活性比率13.0～16.0)、COE311(東洋紡公司制、活性比率28.0～35.0)或者與這些具有同等活性比率的酶。
該膽固醇酯酶只要是滿足該條件的酶，可以是來(lái)自微生物或來(lái)自動(dòng)物的任一種。
另外，膽固醇酯酶的使用量依賴于被測(cè)樣品中的殘粒樣脂蛋白的含量或物理性狀，通常使用0.1～200單位/mL即可，優(yōu)選可以在1～100單位/mL的范圍內(nèi)使用。通常，對(duì)于健康人，可以在1～5單位/mL左右得到良好的測(cè)定結(jié)果。
另外，高脂血癥患者中優(yōu)選使用50單位/mL以上，特別是對(duì)于一直以來(lái)希望具有簡(jiǎn)便的測(cè)定方法的III型家族性高脂血癥患者。另外確認(rèn)了，一般來(lái)說(shuō)健康孕婦的血中膽固醇值上升，如果使用本發(fā)明的膽固醇酯酶，能夠以20單位/mL的用量得到良好的測(cè)定值。
本發(fā)明的殘粒樣脂蛋白中膽固醇的測(cè)定方法中，可以用抗載脂蛋白B-100抗體、抗載脂蛋白A-I抗體對(duì)被測(cè)樣品施加前處理。通過(guò)添加所述的抗體，可以提高膽固醇對(duì)構(gòu)成成分具有載脂蛋白B-100的LDL、VLDL以及構(gòu)成成分具有載脂蛋白A-I的HDL、CM的膽固醇酯酶的選擇性。
所述抗體處理技術(shù)在日本專利第2949354號(hào)公報(bào)中被公開(kāi)了，然而，作為操作方法通過(guò)向被測(cè)樣品中添加抗體結(jié)合凝膠再放置數(shù)小時(shí)，將殘粒樣脂蛋白與其它脂蛋白(HDL、LDL、VLDL、CM)分離，因此膽固醇酯酶的選擇性繼發(fā)性地提高。但是，如果使用本發(fā)明的膽固醇酯酶，沒(méi)有必要將抗體用凝膠固定化，僅僅添加該抗體，就可以抑制該酶對(duì)殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白的作用，結(jié)果可以提高對(duì)殘粒樣脂蛋白的選擇性。因此，在上述方法中，必須在添加凝膠固定化抗體之后長(zhǎng)時(shí)間靜置，而根據(jù)本發(fā)明的方法，可以通過(guò)抗體和脂蛋白的結(jié)合達(dá)到目的，因此可以在添加后數(shù)分鐘就進(jìn)行后續(xù)的操作，因而在操作方法的簡(jiǎn)便性·測(cè)定精度·時(shí)間的縮短的方面得到飛躍的改善。
作為使用抗體，只要是對(duì)載脂蛋白B-100或載脂蛋白A-I的抗體，就沒(méi)有特別的限定，可以使用多克隆抗體、單克隆抗體或它們的組合的任一種，作為一個(gè)示例，可例如作為載脂蛋白B-100識(shí)別抗體的JI-H(日本抗體研究所制)、作為載脂蛋白A-I識(shí)別抗體的H-12(日本抗體研究所制)。另外，由于抗體添加量依賴于被測(cè)樣品中的HDL、LDL、VLDL或CM的量，因此只要添加能夠與該脂蛋白相結(jié)合的量即可。
作為膽固醇氧化酶，只要是具有氧化膽固醇生成過(guò)氧化氫的能力的酶即可，沒(méi)有特別的限定，可例舉如來(lái)自微生物或動(dòng)物的膽固醇氧化酶。
作為膽固醇脫氫酶，只要是具有氧化膽固醇還原氧化型輔酶能力的酶即可，沒(méi)有特別的限定，可例舉如來(lái)自微生物或動(dòng)物的膽固醇脫氫酶。
上述膽固醇氧化酶及膽固醇脫氫酶的使用量在反應(yīng)液中分別優(yōu)選為0.01～200U/mL、更加優(yōu)選為0.1～100U/mL。
在本發(fā)明的測(cè)定方法中，除了膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶之外，為了提高該酶的特異性、穩(wěn)定性，還可以添加使用各種金屬離子，特別是Ca離子。
另外，膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶只要具有同等的活性，可以為被以聚乙二醇為主成分的基團(tuán)、水溶性寡糖殘基、磺丙基等化學(xué)修飾了的酶，也可以為由基因操作獲得的具有同等活性的改良酶。
本發(fā)明的酶反應(yīng)可以在水性介質(zhì)中進(jìn)行，特別優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行。
作為緩沖液，可例舉如三(羥甲基)氨基甲烷、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑以及Good’s緩沖液等。作為Good’s緩沖液，可例舉如N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺基)亞氨二醋酸(ADA)、N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、2-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-N，N’-二(2-羥丙基-3-磺酸)(POPS)等。
另外，緩沖液的pH為4～10，優(yōu)選為5～9。緩沖液的使用濃度優(yōu)選為5～500mM，更優(yōu)選為10～200mM，特別優(yōu)選為20～100mM。
本發(fā)明的測(cè)定方法中，使用膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶時(shí)，通過(guò)膽固醇的反應(yīng)由氧生成過(guò)氧化氫。生成的過(guò)氧化氫可以例如在過(guò)氧化物酶的存在下，使用4-氨酰安替比林基和酚類、4-氨酰安替比林和Trinder’s試劑或者高靈敏度的發(fā)色團(tuán)(chromogen)來(lái)定量。
作為酚類，可例舉如苯酚、4-氯酚、對(duì)甲酚、3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
作為T(mén)rinder′s試劑(同人化學(xué)研究所第19版總目錄，2002年)，可例舉如N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基替苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基-m-甲苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-m-甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-m-茴香胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基替苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-m-3-磺丙基-3-甲氧基苯胺(APPS)、N-乙基-N-3-磺丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-2-羥基-3-磺丙氧基-3-甲氧基苯胺等苯胺類，或者N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N’-乙?；叶返?。
作為高靈敏度的生色團(tuán)，可例舉如在日本專利特公昭60-33479號(hào)公報(bào)中揭示的10-(N-甲基氨甲?；?-3，7-二(二甲氨基)酚噻嗪(MCDP)、日本專利特公平4-27839中揭示的二[3-二(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]氨基(BCMA)、在日本專利特開(kāi)昭62-296號(hào)公報(bào)中揭示的化合物等。作為這些生色團(tuán)的濃度，優(yōu)選為0.01～10mg/mL。
另外，使用膽固醇酯酶及膽固醇脫氫酶時(shí)，通過(guò)膽固醇的反應(yīng)，由氧化型輔酶的NAD(P)生成還原型輔酶的NAD(P)H。可以通過(guò)測(cè)定在約300～500nm、優(yōu)選為330～400nm、特別優(yōu)選為約340nm下的反應(yīng)液的吸光度，來(lái)定量NAD(P)H。另外，NAD(P)H的定量還可以通過(guò)添加心肌黃酶、四唑鹽，生成甲 色素，再進(jìn)行比色確定甲 色素來(lái)進(jìn)行。
反應(yīng)在10～50℃、優(yōu)選為30～40℃、通常為37℃下進(jìn)行1～30分鐘、優(yōu)選為2～10分鐘即可。
本發(fā)明的試劑含有脂蛋白脂肪酶活性較膽固醇酯酶活性更強(qiáng)的膽固醇酯酶，以及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
另外，例如在被測(cè)樣品中存在大量殘粒樣脂蛋白以外的脂蛋白時(shí)等，為減小這些脂蛋白的影響而利用前述抗載脂蛋白B-100抗體及抗載脂蛋白A-I抗體進(jìn)行前處理時(shí)，該試劑優(yōu)選為包括含有該抗體的第1試劑、含有上述酶溶液的第2試劑。這時(shí)，優(yōu)選為向被測(cè)樣品中添加第1試劑，使之在25～40℃下反應(yīng)1～10分鐘之后，再添加第2試劑，使之在25～40℃反應(yīng)2～20分鐘。
另外，該測(cè)定試劑中還可以根據(jù)需要含有用于溶解生物樣品中的球蛋白等蛋白質(zhì)的各種鹽類、脂蛋白促凝劑、其它酶等。
作為所述鹽類，可例舉如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、酢酸鎂、氯化鋰、硫酸鋰、硫酸銨、硝酸鎂、硝酸鈣等，可以使用0～100mM。作為脂蛋白促凝劑，可例舉如磷鎢酸鹽、硫酸葡聚糖鹽、肝素等聚陰離子，鎂、鈣、鈷等2價(jià)金屬鹽。另外，作為其它酶，可例舉如抗壞血酸氧化酶等。
另外，本發(fā)明中應(yīng)用的被測(cè)樣品沒(méi)有特別的限定，具體地講，在生物樣品中可以使用全血或者血漿、血清等血液級(jí)分。
實(shí)施例以下，例舉實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1(1)試樣的制備將血清成分分離成LDL級(jí)分及HDL級(jí)分，進(jìn)行各脂蛋白的測(cè)定。該蛋白質(zhì)的分離方法如下所示。
分別制備抗載脂蛋白B-100抗體結(jié)合親和柱、抗載脂蛋白A-I抗體結(jié)合親和柱，添加血清，回收結(jié)合級(jí)分，分別為L(zhǎng)DL、HDL。
再利用離心分離法(Havel R.J.et al.J Clin InVest 1955；341345.、120000rpm，1.5hr，4℃)將VLDL的級(jí)分分離(全部-VLDL)后，在免疫吸附法(抗載脂蛋白B-100抗體結(jié)合親和柱)中結(jié)合的級(jí)分為結(jié)合-VLDL，未結(jié)合而通過(guò)的級(jí)分為非結(jié)合-VLDL(殘粒樣脂蛋白成分)。在實(shí)施例2和3的測(cè)定時(shí)，使用膽固醇濃度調(diào)整至40mg/d的樣品。
(2)測(cè)定試劑的制備如下所示，制備殘粒樣脂蛋白中的膽固醇測(cè)定試劑。
表1試劑1(抗體前處理時(shí))Good’s緩沖劑pH6.8(PIPES，同仁化學(xué)公司制)50mMHDAOS(同仁化學(xué)公司制)1mM抗載脂蛋白B-100單克隆抗體(JI-H，日本抗體研究所制)100μg/mL抗載脂蛋白A-I單克隆抗體(H-12，日本抗體研究所制) 100μg/mL表2試劑2Good’s緩沖劑pH6.8(BES，同仁化學(xué)公司制) 50mM膽固醇酯酶LP(旭化成藥業(yè)公司制)，或者CE(天野酶公司制) 20單位/mL4-氨酰安替比林(關(guān)東化學(xué)公司制) 3mM過(guò)氧化物酶(天野酶公司制) 10單位/mL膽固醇氧化酶(天野酶公司制) 6單位/mL(3)測(cè)定方法·結(jié)果進(jìn)行抗體前處理時(shí)，將210μL的試劑1放入分光光度計(jì)的測(cè)定池，添加血清20μL攪拌之后，升溫至37℃。接著，5分鐘之后(反應(yīng)點(diǎn)17)添加70μL事先加熱到37℃的試劑2，在之后的5分鐘(反應(yīng)點(diǎn)33)內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。在主波長(zhǎng)572nm及副波長(zhǎng)748nm的測(cè)定波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。
以反應(yīng)點(diǎn)17-33的吸光度變化率作為評(píng)價(jià)基準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
實(shí)施例2(1)膽固醇酯酶對(duì)LDL及HDL的反應(yīng)特異性將用0.1％的表面活性劑(Emulgen，花王公司制)處理后的LDL及HDL，以及沒(méi)有處理的溶液作為被測(cè)樣品，進(jìn)行膽固醇的測(cè)定。使用LP酶(旭化成藥業(yè)公司制、活性比率512)或者CE酶(天野酶公司制，活性比率14.3)作為膽固醇酯酶。將LDL示于圖1，將HDL示于圖2。測(cè)定方法如實(shí)施例1。兩種情況均顯示出，與膽固醇總反應(yīng)量(表面活性劑處理)相比較，使用LP酶時(shí)的反應(yīng)性顯著降低。另外，使用CE酶時(shí)較LP酶顯示更高的吸收。
實(shí)施例3(2)非結(jié)合-VLDL(殘粒樣脂蛋白級(jí)分)、結(jié)合-VLDL的反應(yīng)特異性使用LP酶檢測(cè)本發(fā)明測(cè)定方法中VLDL級(jí)分的反應(yīng)特異性。另外，測(cè)定方法如實(shí)施例1。圖3顯示沒(méi)有添加抗載脂蛋白B-100抗體(JI-H)及抗載脂蛋白A-I抗體(H-12)的反應(yīng)性，圖4顯示添加了抗體的反應(yīng)性。向第1液中添加抗體以使JI-H及H-12的終濃度均為100μg/mL。圖3、圖4中，非結(jié)合-VLDL及結(jié)合-VLDL均顯示了大致相同的反應(yīng)曲線，確認(rèn)了可以選擇性測(cè)定殘粒樣脂蛋白中的膽固醇。另外，添加抗體時(shí)，結(jié)合-VLDL的反應(yīng)性進(jìn)一步降低至約1/3，酶反應(yīng)受到抑制。
因此，明確了可以通過(guò)添加抗體來(lái)更高精度地測(cè)定殘粒樣脂蛋白。
實(shí)施例4與市售殘粒樣脂蛋白中膽固醇測(cè)定試劑盒的比較(1)使用以往的殘粒樣蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(RLP-C II、日本抗體研究所社制)，以及各種膽固醇酯酶(LP活性比率512(旭化成藥業(yè)公司制)、LPBP活性比率6296(旭化成藥業(yè)公司制)、CEBPM活性比率11.2(東洋紡公司制)、CEN活性比率14.3(旭化成藥業(yè)公司制)、COE311活性比率31.8(東洋紡公司制))，在與實(shí)施例3相同的條件下，測(cè)定VLDL級(jí)分中殘粒樣脂蛋白中的膽固醇，求其相關(guān)性。將結(jié)果示于表3。
結(jié)果確認(rèn)了，使用除CEBPM之外的4種酶時(shí)，測(cè)定值與已有的市售試劑盒之間存在相關(guān)性。
表3


脂蛋白脂肪酶(LPL)活性由LP活性分析法(橄欖油乳)來(lái)測(cè)定。膽固醇酯酶(CE)活性由CE活性分析法(小牛血清)來(lái)測(cè)定。
(2)使用以往的殘粒樣蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(RLP-C II、日本抗體研究所公司制)以及本發(fā)明的測(cè)定方法(使用LP(旭化成藥業(yè)公司制，活性比率512)作為膽固醇酯酶)，測(cè)定臨床待測(cè)品的殘粒樣脂蛋白中的膽固醇，求其相關(guān)性。
將健康人14例、包括2例III型高脂血癥的高脂血癥患者20例、冠狀動(dòng)脈疾病患者65例的99例作為對(duì)象，利用RLP-C II法和直接RLP-C法同時(shí)測(cè)定，比較檢測(cè)其相關(guān)性。結(jié)果得到回歸曲線y＝0.987x+0.326、相關(guān)系數(shù)r＝0.962的良好的相關(guān)性(圖5)。
權(quán)利要求
1.殘粒樣脂蛋白中膽固醇的測(cè)定方法，它是使含有脂蛋白的被測(cè)樣品與膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶作用，再通過(guò)測(cè)定生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶來(lái)測(cè)定脂蛋白中的膽固醇的方法，其特征在于，使用脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12～7000的膽固醇酯酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為28～800。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，膽固醇酯酶選自LP、LPBP、CEN、CE及COE311。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用抗載脂蛋白B-100抗體、抗載脂蛋白A-I抗體對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行前處理。
5.殘粒樣脂蛋白中的膽固醇測(cè)定試劑，其特征在于，含有脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12～7000的膽固醇酯酶，以及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于，脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為28～800。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于，膽固醇酯酶選自LP、LPBP、CEN、CE及COE311。
8.殘粒樣脂蛋白中的膽固醇測(cè)定試劑，其特征在于，包括含有抗載脂蛋白B-100抗體、抗載脂蛋白A-I抗體的第1試劑，以及含有權(quán)利要求5～7中任一項(xiàng)所述測(cè)定試劑的第2試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供操作更加簡(jiǎn)便且高精度測(cè)定樣品中的殘粒樣脂蛋白質(zhì)中膽固醇的方法以及測(cè)定試劑。該殘粒樣脂蛋白中膽固醇的測(cè)定方法是使含有脂蛋白的被測(cè)樣品與膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶作用，再通過(guò)測(cè)定生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶來(lái)測(cè)定脂蛋白中的膽固醇的方法，其特征在于，使用脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率(脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12～7000的膽固醇酯酶。
文檔編號(hào)G01N33/92GK101065495SQ20058004071
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2005年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者中野隆光, 新見(jiàn)學(xué), 荻原富美子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Jimro