用于治療癌癥的抗密蛋白-18的單克隆抗體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供抗體，所述抗體可作為治療劑用于治療和／或預(yù)防與表達(dá)CLD18的細(xì)胞相關(guān)的疾病，包括腫瘤相關(guān)疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌及其轉(zhuǎn)移形式。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于治療癌癥的抗密蛋白-18的單克隆抗體
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00880018036.5的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)PCT / EP2008 / 004197的中國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]與常規(guī)藥物相比，基于抗體的癌癥療法具有較高特異性和較低副作用譜的潛力。其原因?yàn)榭贵w對(duì)正常細(xì)胞及贅生性細(xì)胞的精確區(qū)分以及以下事實(shí)，即其作用模式依賴(lài)于毒性較低的免疫學(xué)抗腫瘤機(jī)制，例如補(bǔ)體活化和細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的募集。
[0003]基于抗體的療法的靶標(biāo)必須具有特定的性質(zhì)，這形成了正確區(qū)分正常細(xì)胞及贅生性細(xì)胞的基礎(chǔ) 。顯然，排他性地局限在腫瘤細(xì)胞中并且在正常組織中完全檢測(cè)不到的靶標(biāo)對(duì)于開(kāi)發(fā)高效且安全的抗體療法而言是很理想的。另一方面，高水平的過(guò)表達(dá)也可以是治療窗和低副作用的基礎(chǔ)，例如由于基因擴(kuò)增而成為抗體曲妥珠單抗(trastuzumab,Here印tin，赫塞汀)優(yōu)良靶標(biāo)的2型人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER-2)。
[0004]已獲批準(zhǔn)或正在臨床開(kāi)發(fā)的用于腫瘤療法之抗體的其他靶標(biāo)具有不基于靶分子在腫瘤細(xì)胞上數(shù)量性過(guò)表達(dá)的獨(dú)特性質(zhì)。對(duì)于針對(duì)蛋白聚糖MUC-1的抗體，靶標(biāo)主鏈中的肽重復(fù)表位在腫瘤細(xì)胞中是低糖基化的，從而改變成其正常狀態(tài)的對(duì)應(yīng)物(counterpart)。對(duì)于針對(duì)CD20 (利妥昔單抗(rituximab))、CD52 (Campath-1H)和CD22 (依帕珠單抗(epratuzumab))的抗體,抗體祀標(biāo)在腫瘤細(xì)胞和正常淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平相當(dāng)。這種情況下，抗體對(duì)正常細(xì)胞的去除可以被耐受，因?yàn)榘袠?biāo)陰性的干細(xì)胞恢復(fù)了正常的淋巴細(xì)胞譜?？贵w祀標(biāo)可接近性差異的另一些實(shí)例為癌胚抗原(carcinoembryonal antigen, CEA)和碳酸酐酶IX(carboanhydrase IX,CA9)。這兩種抗原分別在結(jié)腸和腎的正常上皮中表達(dá)。然而，經(jīng)放射性標(biāo)記的成像抗體確實(shí)良好區(qū)分了腫瘤及正常組織，而且細(xì)胞毒性抗體可以被良好地耐受。這很可能是由于CA9和CEA在正常上皮組織中限制性表達(dá)在IgG抗體無(wú)法接近的腔側(cè)。上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule, Ep-CAM)這種抗原也屬于這一類(lèi)別。作為上皮細(xì)胞的同型細(xì)胞粘附分子，它定位在細(xì)胞間隙中。有意思的是，盡管高親和力抗Ep-CAM抗體毒性極高，但中等親和力的抗體卻可以被良好地耐受。這提示了 Ep-CAM靶標(biāo)在正常細(xì)胞上的可接近性，但也表明抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué)可能打開(kāi)治療窗。
[0005]一種可能性是參與細(xì)胞/細(xì)胞粘附的其他上皮細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)對(duì)于抗體策略也可能有意義，因?yàn)樗鼈冊(cè)谡＝Y(jié)構(gòu)的上皮中幾乎無(wú)法接近抗體，但在腫瘤細(xì)胞中卻暴露出來(lái)。因此，我們對(duì)參與組織上皮組織結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)作為治療性抗體靶標(biāo)的適用性進(jìn)行了分析。一種特別引起我們注意的蛋白質(zhì)是密蛋白18(claudinl8)。
[0006]密蛋白18 (CLD18)分子(Genbank 登記號(hào):剪接變體 I (CLD18A1):NP_057453、ΝΜ_016369,以及剪接變體 2 (CLD18A2):ΝΜ_001002026、ΝΡ_001002026)是分子量約為27.9 / 27.72kD的整合型跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和內(nèi)皮的緊密連接中的整合膜蛋白。緊密連接在相鄰細(xì)胞之間組織起膜內(nèi)顆?；ヂ?lián)鏈的網(wǎng)。在緊密連接中，閉合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白組分。由于其強(qiáng)的細(xì)胞間粘附特性，它們產(chǎn)生了防止和控制溶質(zhì)的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)并限制膜脂和蛋白質(zhì)側(cè)向擴(kuò)散以維持細(xì)胞極性的主要屏障。形成緊密連接的蛋白質(zhì)關(guān)鍵性地參與了組織上皮組織結(jié)構(gòu)。我們推測(cè)，這些蛋白質(zhì)在構(gòu)造良好的上皮中幾乎無(wú)法接近抗體，但在腫瘤細(xì)胞中則開(kāi)始暴露出來(lái)。
[0007]CLD18是一種四次跨膜蛋白，因此具有四個(gè)疏水區(qū)。我們得出的數(shù)據(jù)表明CLD18展示若干不同構(gòu)象，這些構(gòu)象可被抗體選擇性靶向。一種構(gòu)象(CLD18-構(gòu)象-1)顯示，全部四個(gè)疏水區(qū)均作為常規(guī)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TM),并形成兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)(環(huán)I由疏水區(qū)I和疏水區(qū)2環(huán)繞而成；環(huán)2由疏水區(qū)3和疏水區(qū)4環(huán)繞而成)，像對(duì)絕大多數(shù)密蛋白家族成員所描述的那樣。另一種構(gòu)象(CLD18-構(gòu)象-2)顯示，像對(duì)另一種四次跨膜家族成員PMP22所描述的那樣(Taylor等，J.Neurosc.Res.62:15-27，2000)，第二個(gè)和第三個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域不完全跨過(guò)質(zhì)膜，從而第一個(gè)和第四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間的部分(環(huán)D3)在細(xì)胞外。第三種構(gòu)象(CLD18-構(gòu)象-3)顯示了被作為常規(guī)跨膜結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)和第四個(gè)疏水區(qū)所環(huán)繞并具有兩個(gè)內(nèi)部疏水區(qū)的大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。由于環(huán)D3中存在典型的N-糖基化位點(diǎn)，密蛋白-18的拓?fù)鋵W(xué)變體CLD18拓?fù)?2和CLD18拓?fù)?3帶有額外的細(xì)胞外N-糖基化位點(diǎn)。
[0008]兩種不同剪接變體的存在給CLD18分子增添了另一層水平上的復(fù)雜性，這兩種變體描述于小鼠和人中(Niimi，Mol.Cell.Biol.21:7380-90, 2001)。剪接變體 CLD18A1 和CLD18A2在包括第一個(gè)TM和環(huán)I的N端前21個(gè)氨基酸中存在差異，而C端的一級(jí)蛋白質(zhì)序列則相同。
[0009]CLD18A1在正常肺和胃的上皮中選擇性表達(dá)，而CLD18A2僅在胃細(xì)胞中表達(dá)(Niimi, Mo 1.Cell.Biol.21 =7380-90,2001)。最重要的是，CLD18A2 局限在已分化的胃上皮短壽細(xì)胞中，但在胃干細(xì)胞區(qū)`中不存在。我們使用靈敏的RT-PCR顯示，兩種變體在任何其他正常人器官中均完全檢測(cè)不到，但在若干癌癥類(lèi)型中強(qiáng)烈表達(dá)，包括胃、食管、胰腺和肺的腫瘤以及人癌癥細(xì)胞系。表達(dá)主要是在這些適應(yīng)癥的腺癌亞型中。
[0010]該蛋白質(zhì)的分子量在一些癌癥和鄰近的正常組織中存在差異。在健康組織中觀察到的較高分子量的蛋白質(zhì)可以通過(guò)用去糖基化化合物PNGase F處理組織裂解液而轉(zhuǎn)變成與癌癥中所觀察到相同的分子量。這提示與其正常組織對(duì)應(yīng)物相比，CLD18在癌癥中N-糖基化較少。這種結(jié)構(gòu)差異很可能產(chǎn)生改變的表位。經(jīng)典的N-糖基化基序在該分子環(huán)D3結(jié)構(gòu)域的116位氨基酸中。
[0011]本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“CLD18”和“CLD18變體”應(yīng)包括(i) CLD18剪接變體；(ii)CLD18N-糖基化變體；(iii)CLD18構(gòu)象變體；(iv)位于細(xì)胞間緊密連接中的游離CLD18和同型/異型相關(guān)變體以及(v)CLD18的癌癥相關(guān)變體和CLD18非癌細(xì)胞相關(guān)變體。
[0012]CLD18的分子和功能特征使得該分子對(duì)基于抗體的癌癥療法非常有意義。特別是(i)絕大多數(shù)毒性相關(guān)正常組織中不存在CLD18 ;(ii)CLD18A2變體的表達(dá)局限在作為已分化胃細(xì)胞的可分散細(xì)胞群體中，這些細(xì)胞可由靶標(biāo)陰性的胃干細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充；(iii)正常及贅生性細(xì)胞之間潛在差異性糖基化的線索；(iv)不同構(gòu)象拓?fù)鋵W(xué)情況的存在。此外，CLD18作為緊密連接蛋白的作用可能進(jìn)一步促成良好的治療窗。由于腫瘤細(xì)胞表達(dá)密蛋白，但經(jīng)常不像正常上皮組織中可見(jiàn)的那樣通過(guò)密蛋白的同型和異型相關(guān)聯(lián)形成經(jīng)典的緊密連接，因此腫瘤細(xì)胞具有適用于胞外抗體結(jié)合及免疫療法的可觀的游離密蛋白庫(kù)。有可能在健康上皮中密蛋白的結(jié)合表位被屏蔽在緊密連接中，使這些抗體無(wú)法接近。
[0013]另外，根據(jù)本發(fā)明所觀察到的不僅由于原發(fā)腫瘤還由于來(lái)自表達(dá)CLD18A2的原發(fā)腫瘤(特別是胃腫瘤)之轉(zhuǎn)移腫瘤的質(zhì)膜高表達(dá)，使得CLD18A2特異性抗體成為用于預(yù)防、治療和/或診斷癌癥轉(zhuǎn)移的有價(jià)值的工具，特別是來(lái)源于胃腫瘤的轉(zhuǎn)移，例如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和庫(kù)肯勃氏瘤(Krukenberg tumor)。
[0014]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用于治療其中有CLD18表達(dá)的疾病(例如腫瘤疾病)的抗體。本文所述抗體還可用于診斷這些疾病。
[0015]發(fā)明概述
[0016]本發(fā)明一般地提供抗體，所述抗體可用作治療劑用于治療和/或預(yù)防與表達(dá)CLD18的細(xì)胞相關(guān)的疾病，包括腫瘤相關(guān)疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌例如非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌及其轉(zhuǎn)移，特別是胃癌轉(zhuǎn)移例如庫(kù)肯勃氏瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
[0017]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及能夠結(jié)合CLD18的抗體。優(yōu)選地，該抗體能夠結(jié)合細(xì)胞表面所表達(dá)的CLD18，優(yōu)選地結(jié)合位于CLD18的細(xì)胞外部分的一個(gè)或多個(gè)表位，優(yōu)選地在第一細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中(CLD18的29至78位氨基酸)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合選自SEQ IDNO: 151、153、155、156和157的一個(gè)或多個(gè)肽。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合癌細(xì)胞，特別是上文所說(shuō)癌癥類(lèi)型的細(xì)胞，優(yōu)選地基本上不結(jié)合非癌細(xì)胞。優(yōu)選地，所述抗體與表達(dá)CLD18的細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的結(jié)合介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合CLD18A1和⑶L18A2，更優(yōu)選地結(jié)合CLD18A2，但不結(jié)合CLD18A1。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體與CLD-構(gòu)象-1的環(huán)I或環(huán)2結(jié)合并對(duì)其具有特異性。在另一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與CLD-構(gòu)象-2的環(huán)D3結(jié)合并對(duì)其具有特異性，特別是在環(huán)D3中116位的潛在N-糖基化位點(diǎn)處或其周?chē)Y(jié)合。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對(duì)環(huán)D3中116位潛在N-糖基化位點(diǎn)未發(fā)生糖基化的形式具有特 異性。
[0018]優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體與CLD18A2的結(jié)合涉及一個(gè)或多個(gè)選自下列的氨基酸:CLD18A2(SEQ ID NO:2)的42位Ala、45位Asn和56位Glu。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體不結(jié)合CLD18A2變體或其片段，其中這些位置的一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選全部氨基酸被不同氨基酸所替換，特別是被CLD18A1(SEQ ID NO:8)中對(duì)應(yīng)位置的氨基酸(Ala42Ser，Asn45Gln和Glu56Gln)所替換。
[0019]本發(fā)明抗體對(duì)細(xì)胞的殺傷優(yōu)選通過(guò)該抗體與所述細(xì)胞表達(dá)之CLD18的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)，更優(yōu)選通過(guò)該抗體與所述細(xì)胞表達(dá)之CLD18A2的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體與所述細(xì)胞表達(dá)之CLD18A1的結(jié)合不誘導(dǎo)殺傷所述細(xì)胞。這種對(duì)細(xì)胞的殺傷可如上所述在治療上應(yīng)用。特別地，對(duì)細(xì)胞的殺傷可用于治療或預(yù)防癌癥，特別是癌癥轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性散播。
[0020]所述表達(dá)CLD18的細(xì)胞優(yōu)選為癌細(xì)胞，特別是選自致瘤性的胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膀胱癌細(xì)胞。
[0021]優(yōu)選地，本發(fā)明抗體通過(guò)誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)介導(dǎo)的裂解、抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)介導(dǎo)的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用來(lái)介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的殺傷，優(yōu)選通過(guò)誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的裂解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解來(lái)介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的殺傷。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不誘導(dǎo)CDC介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。
[0023]優(yōu)選地，ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞裂解在效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)發(fā)生，所述效應(yīng)細(xì)胞在一些具體實(shí)施方案中選自單核細(xì)胞(monocyte)、單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell)、NK細(xì)胞和PMN,吞噬作用是通過(guò)巨噬細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0024]本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體或者是抗體片段，并且可選自 IgGl、IgG2 (優(yōu)選 IgG2a 和 IgG2b)、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、分泌性 IgA、IgD和IgE抗體。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的所有方面，CLD18優(yōu)選為人CLD18，優(yōu)選人CLD18A2，并且CLD18A2優(yōu)選具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，CLD18A1優(yōu)選具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
[0026]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與活細(xì)胞表面上存在的CLD18的天然表位結(jié)合。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對(duì)癌細(xì)胞(優(yōu)選胃癌細(xì)胞)具有特異性。
[0027]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，CLD18表達(dá)于細(xì)胞表面上。
[0028]本發(fā)明的抗體可通過(guò)包括以下步驟的方法獲得:用具有選自SEQ ID NO:2、4、6、16、18、20、21-23和26-31、151、153和155-157的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽或者其免疫原性片段或衍生物、或者表達(dá)所述蛋白質(zhì)或多肽或者其免疫原性片段或衍生物的核酸或宿主細(xì)胞來(lái)免疫動(dòng)物。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體對(duì)上述蛋白質(zhì)、多肽或其免疫原性片段或衍生物具有特異性。對(duì)于免疫接種所用的蛋白質(zhì)或肽來(lái)說(shuō)，衍生物涉及這些蛋白質(zhì)或肽的變體，其具有與其所來(lái)源的蛋白質(zhì)或肽相同或相似的免疫原性。特別地，在用于免疫接種以產(chǎn)生抗體(特別是單克隆抗體)時(shí)，蛋白質(zhì)或肽的衍生物提供具有與在免疫接種中使用所述蛋白質(zhì)或肽時(shí)所獲得抗體相同的特異性。例如，這些衍生物可包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、替換或添加。特別地，它可包括在N-端或C-端或兩端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如半胱氨酸)，或者用絲氨酸殘基替換半胱氨酸殘基。本文所示數(shù)據(jù)顯示了 CLD18內(nèi)對(duì)抗體結(jié)合不重要的殘基。因此，本文所述用于免疫接種的CLD蛋白、肽、其免疫原性片段或衍生物可在對(duì)抗體結(jié)合不關(guān)鍵的所述氨基酸位置摻入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。
[0029]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方`案中，本發(fā)明的抗體通過(guò)登記號(hào)為 DSM ACC2737 (182-D1 106-055)、DSM ACC2738 (I 82-D 11 O6-056)、DSMACC2739 (182-D1106-057)、DSMACC2740 (182-D1106-058)、DSM ACC2741 (182-D1106-059)、DSM ACC2742 (182-D1 106-062)、DSM ACC2743 (I 82-D I I O 6-O 67 )、D SMACC2745(182-D758-035)、DSMACC2746 (182-D758-036)、DSM ACC2747 (182-D758-040)、DSMACC2748(182-D1106-061)、DSM ACC2808(182-D1106-279)、DSM ACC2809(182-D1106-294)或 DSMACC2810(182-D1106-362)的克隆來(lái)產(chǎn)生。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與治療劑如毒素、放射性同位素、藥物或細(xì)胞毒劑偶聯(lián)。
[0031]本發(fā)明的另一方面涉及能產(chǎn)生本發(fā)明抗體的雜交瘤。優(yōu)選雜交瘤的登記號(hào)為 DSM ACC2737 (182-D1106-055)、DSMACC2738 (182-D1106-056)、DSMACC2739(182-D1106-057)、DSM ACC2740(182-D1106-058)、DSM ACC2741(182-D1106-059)、DSM ACC2742 (I 82-D I I 06-062)、DSMACC2743 (182_D1 106-067)、DSMACC2745(182-D758-035)、DSM ACC2746(182-D758-036)、DSM ACC2747(182-D758-040)、DSMACC2748(182-D1106-061)、DSMACC2808(182-D1106-279)、DSM ACC2809 (182-D1106-294)或DSM ACC2810(182-D1106-362)。
[0032]本發(fā)明的抗體在本文中通過(guò)參考該抗體的命名(如182-D758-035)和/或通過(guò)參考產(chǎn)生該抗體的克隆(如26D12)來(lái)命名。
[0033]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明抗體和/或其與治療劑的綴合物以及可藥用載體的藥物組合物。
[0034]本發(fā)明的另一方面涉及殺傷表達(dá)CLD18(優(yōu)選CLD18A2)的細(xì)胞和/或抑制其生長(zhǎng)的方法，包括使所述細(xì)胞接觸有效量的本發(fā)明抗體和/或其與治療劑的綴合物。CLD18優(yōu)選在所述細(xì)胞的表面上表達(dá)。
[0035]本發(fā)明的另一方面涉及治療或預(yù)防與表達(dá)CLD18(優(yōu)選CLD18A2)的細(xì)胞相關(guān)的疾病或病癥的方法，包括對(duì)對(duì)象施用本發(fā)明的抗體、其與治療劑的綴合物或者包含本發(fā)明抗體或其與治療劑之綴合物的藥物組合物。優(yōu)選地，所述疾病或病癥為腫瘤相關(guān)疾病，在一些具體實(shí)施方案中選自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌，以及來(lái)自其轉(zhuǎn)移。CLD18優(yōu)選在所述細(xì)胞的表面上表達(dá)。
[0036]優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體能夠區(qū)分不同細(xì)胞類(lèi)型(包括癌細(xì)胞和非惡性細(xì)胞)所表達(dá)的CLD18變體。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠與CLD18A2結(jié)合，但不與CLD18A1結(jié)合，或者與CLD18A1結(jié)合的特異性低于與CLD18A2結(jié)合的特異性。
[0037]本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”優(yōu)選表示特異性結(jié)合?！疤禺愋越Y(jié)合”指試劑(如抗體)與其特異性靶標(biāo)(如表位)的結(jié)合強(qiáng)于與其他靶標(biāo)的結(jié)合。如果試劑與第一靶標(biāo)結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)低于與第二靶標(biāo)結(jié)合的解離常數(shù)，則其與第一靶標(biāo)的結(jié)合強(qiáng)于與第二靶標(biāo)的結(jié)合。優(yōu)選地，試劑特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)(Kd)低于該試劑非特異性結(jié)合的靶標(biāo)的解離常數(shù)(Kd)的I / 10以下，優(yōu)選I / 20以下，更優(yōu)選I / 50以下，甚至更優(yōu)選I / 100、I / 200、I / 500 或 I / 1000 以下。
[0038]優(yōu)選地，本`發(fā)明的抗體具有CLD18(優(yōu)選CLD18A2)的解離常數(shù)，其為10_6M或更低，優(yōu)選10_7m或更低，更優(yōu)選10_8M或更低，或者優(yōu)選10_9M或更低。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體具有CLD18 (優(yōu)選CLD18A2)的解離常數(shù)，其在10_8M至10_9M的范圍內(nèi)。
[0039]本發(fā)明的抗體通過(guò)結(jié)合CLD18(優(yōu)選表達(dá)在所述細(xì)胞表面上)介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18(優(yōu)選表達(dá)CLD18A2)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(⑶C)，如CLD18表達(dá)細(xì)胞發(fā)生至少約20-40%的⑶C介導(dǎo)裂解，優(yōu)選約40-50%的⑶C介導(dǎo)裂解，更優(yōu)選高于50%的⑶C介導(dǎo)裂解。這樣的抗體在本文中通過(guò)以下抗體進(jìn)行示例:37H8、38G5、38H3、39F11、61C2、26B5、26D12、28D10、163E12、175D10、45C1、125E1、 ch_163E12和ch-175D10。作為誘導(dǎo)CDC的替代或補(bǔ)充，本發(fā)明的抗體可在效應(yīng)細(xì)胞(如單核細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、NK細(xì)胞和PMN)存在下誘導(dǎo)CLD18表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。這樣的抗體在本文中通過(guò)以下抗體進(jìn)行示例:37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、61C2、26B5、26D12、28D10、42E12、163E12、175D10、45C1 和 125E1。本發(fā)明的抗體可具有以下能力:誘導(dǎo)CLD18表達(dá)細(xì)胞的凋亡、誘導(dǎo)CLD18表達(dá)細(xì)胞的同型粘附和/或在巨噬細(xì)胞存在下誘導(dǎo)CLD18表達(dá)細(xì)胞的吞噬作用。本發(fā)明的抗體可具有一種或多種上述功能特性。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體誘導(dǎo)CLD18表達(dá)細(xì)胞的CDC介導(dǎo)之裂解和ADCC介導(dǎo)之裂解，更優(yōu)選誘導(dǎo)CLD18表達(dá)細(xì)胞的ADCC介導(dǎo)之裂解，而不誘導(dǎo)所述細(xì)胞的CDC介導(dǎo)之裂解。本發(fā)明抗體的示例性靶細(xì)胞包括但不僅限于表達(dá)CLD18(優(yōu)選CLD18A2)的癌細(xì)胞，如致瘤性的胃癌、胰腺癌、食管癌和肺癌細(xì)胞。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷是CLD18A2特異性的，即本發(fā)明抗體介導(dǎo)殺傷(優(yōu)選⑶C和/或ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞裂解)表達(dá)CLD18A2的細(xì)胞，但是不介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18A1而不表達(dá)CLD18A2的細(xì)胞。上述抗體可在例如以下癌癥的治療或預(yù)防中用于介導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞:胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌和/或其轉(zhuǎn)移。
[0040]本發(fā)明的抗體可根據(jù)其結(jié)合特性及其介導(dǎo)效應(yīng)子對(duì)CLD18表達(dá)細(xì)胞的功能的能力分類(lèi)到不同類(lèi)別中。本發(fā)明抗體可根據(jù)以下特征分類(lèi):
[0041].對(duì)表達(dá)CLD18A1或CLD18A2之細(xì)胞的結(jié)合特性和/或介導(dǎo)的對(duì)所述細(xì)胞的效應(yīng)子功能(區(qū)分CLD18剪接變體)，
[0042].對(duì)表達(dá)糖基化或非糖基化CLD18變體之細(xì)胞的結(jié)合特性和/或介導(dǎo)的對(duì)所述細(xì)胞的效應(yīng)子功能(區(qū)分有無(wú)N糖基化的CLD18變體)，
[0043].對(duì)癌細(xì)胞或正常細(xì)胞類(lèi)型的結(jié)合特性和/或介導(dǎo)的對(duì)所述細(xì)胞的效應(yīng)子功能(區(qū)分腫瘤細(xì)胞表達(dá)的或正常非惡性細(xì)胞表達(dá)的CLD18變體)，
[0044].對(duì)被緊密連接的形成所屏蔽的CLD18表位的結(jié)合特性，
[0045].在活細(xì)胞上誘導(dǎo)CLD18聚集體形成的能力，和
[0046].與非人CLD18變 體特別是來(lái)自小鼠、大鼠、兔和靈長(zhǎng)類(lèi)的CLD18結(jié)合的能力。
[0047]本發(fā)明的抗體可具有一種或多種以下特性，其中給出本發(fā)明抗體(24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、9E8、19B9、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch_43All、ch_45Cl、ch_125El、ch-163E12、ch-166E2、ch-175D10)的具體實(shí)例作為參考:
[0048]a)與 CLD18A2 以及 CLD18A1 結(jié)合(如 26D12、28D10、37H8、38H3、39F11、61C2 和41C6)
[0049]b)與 CLD18A2 結(jié)合但不與 CLD18A1 結(jié)合(如 26B5、37G11、38G5、42E12 和 43A11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch_43All、ch_45Cl、ch_125El、ch_163E12、ch_166E2、ch-175D10)
[0050]c)與腫瘤細(xì)胞天然表達(dá)的CLD18結(jié)合但不與非癌細(xì)胞或組織(如胃和肺細(xì)胞)天然表達(dá)的 CLD18 結(jié)合(如 26B5、75B8、24H5、39F11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10)
[0051]d)介導(dǎo)⑶C誘導(dǎo)的針對(duì)表達(dá)CLD18A2細(xì)胞的殺傷，而不針對(duì)表達(dá)CLD18A1的細(xì)胞(如 26D12、28D10、37H8 和 39F11、163E12、ch_125El、ch_163E12、ch_175D10)
[0052]e)介導(dǎo) ADCC 誘導(dǎo)的對(duì)表達(dá) CLD18 細(xì)胞的殺傷(如 26B5、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、47D12 和 61C2、ch_163E12、ch_175D10)
[0053]f)介導(dǎo)ADCC誘導(dǎo)的對(duì)表達(dá)CLD18細(xì)胞的殺傷，但不介導(dǎo)⑶C介導(dǎo)的殺傷(如37G1U42E12 和 43A11)
[0054]g)介導(dǎo)ADCC誘導(dǎo)的和CDC誘導(dǎo)的對(duì)表達(dá)CLD18A2細(xì)胞的殺傷(如37H8、38H3、39F11、ch-163E12、ch_175D10)。
[0055]如本文所述示例的，本發(fā)明的抗體還包括以下分子，其
[0056]a)與已分化的正常胃細(xì)胞結(jié)合，但不與胃干細(xì)胞結(jié)合(如39F11)
[0057]b)不與正常胃組織以及其他正常器官結(jié)合，而是排他性地與癌細(xì)胞結(jié)合(如26B5)
[0058]c)與包含CLD18第116位非糖基化Asn的表位結(jié)合
[0059]d)與人及小鼠CLD18結(jié)合，使得可以在小鼠中充分進(jìn)行臨床前毒性研究。[0060]本發(fā)明的抗體可來(lái)自不同物種，包括但不僅限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。本發(fā)明的抗體還包括嵌合分子，其中來(lái)自一個(gè)物種(優(yōu)選人)的抗體恒定區(qū)與來(lái)自另一物種的抗原結(jié)合位點(diǎn)相組合。此外，本發(fā)明的抗體包括人源化分子，其中來(lái)自非人物種的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與人來(lái)源的恒定區(qū)和框架區(qū)相組合。
[0061]本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體，并包括IgG2a(如IgG2a、κ、λ)、IgG2b (如IgG2b、κ、X)、IgG3(如IgG3、κ、λ)和IgM抗體。然而，本發(fā)明也包括其他抗體同種型，包括IgGl、IgAU IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗體。所述抗體可以是完整抗體或其抗原結(jié)合片段，包括如Fab、F(ab' )2、Fv、單鏈Fv片段，或者是雙特異性抗體。此外，所述抗原結(jié)合片段包括包含以下部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白:(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽(如重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))，(?)與該鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和(iii)與該CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。這樣的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白在US2003 / 0118592和US2003 / 0133939中有進(jìn)一步公開(kāi)。
[0062]本發(fā)明的抗體優(yōu)選以約1-1OOnM或更小的解離平衡常數(shù)(Kd)與CLD18解離。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體不與相關(guān)細(xì)胞表面抗原交叉反應(yīng)，因此不抑制其功能。
[0063]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可通過(guò)一種或多種以下特性進(jìn)行表征:
[0064]a)對(duì)CLD18的特異性，特別是對(duì)CLD18A2的特異性；
[0065]b)對(duì)CLD18特別是CLD18A2的結(jié)合親和性為約IOOnM或更小，優(yōu)選約5_10nM或更小，更優(yōu)選約1_3ηΜ或更小，
[0066]c)介導(dǎo)對(duì)⑶55 / 59陰性或⑶55 / 59陽(yáng)性細(xì)胞的高水平⑶C的能力；
[0067]d)抑制表達(dá)CLD18的細(xì)胞生長(zhǎng)的能力；
[0068]e)誘導(dǎo)表達(dá)CLD18的細(xì)胞`凋亡的能力；
[0069]f)對(duì)表達(dá)CLD18的細(xì)胞誘導(dǎo)同型粘附的能力；
[0070]g)在效應(yīng)細(xì)胞存在下對(duì)表達(dá)CLD18的細(xì)胞誘導(dǎo)ADCC的能力；
[0071]h)延長(zhǎng)具有表達(dá)CLD18之腫瘤細(xì)胞的對(duì)象存活的能力；
[0072]i)清除表達(dá)CLD18之細(xì)胞的能力；
[0073]j)清除表達(dá)低水平CLD18之細(xì)胞的能力，和/或
[0074]k)在活細(xì)胞表面聚集CLD18的能力。
[0075]本發(fā)明的抗CLD18抗體可進(jìn)行衍生、連接或共表達(dá)以得到其它的結(jié)合特異性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供雙特異性或多特異性分子，其包含至少一種對(duì)CLD18的第一結(jié)合特異性(如抗CLD18抗體或其模擬體)以及對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的第二結(jié)合特異性，如對(duì)Fe受體(例如Fe- Y受體，如Fe- Y RI或其他Fe受體)或T細(xì)胞受體(如CD3)的結(jié)合特異性。
[0076]因此，本發(fā)明包括與CLD18以及Fe受體或T細(xì)胞受體(如⑶3)均結(jié)合的雙特異性和多特異性分子。Fe受體的實(shí)例為IgG受體、Fe- Y受體(Fe- Y R)如Fe- y RI (⑶64)、Fe-YRII(CD32)和Fe-yRIII(CD16)。也可靶向其他Fe受體，如IgA受體(如Fca RI)。所述Fe受體優(yōu)選位于效應(yīng)細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或活化單個(gè)核細(xì)胞的表面上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雙特異性和多特異性分子在Fe受體中不同于免疫球蛋白Fe (如IgG或IgA)結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)處與該受體結(jié)合。因此，所述雙特異性和多特異性分子的結(jié)合不被生理水平的免疫球蛋白所封閉。
[0077]在另一方面中，本發(fā)明的抗CLD18抗體與其他功能分子如其他肽和蛋白質(zhì)(如Fab'片段)進(jìn)行衍生、連接或共表達(dá)。例如，本發(fā)明的抗體可以與一種或多種其他分子實(shí)體功能性連接(例如通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)連接等)，所述分子實(shí)體例如其他抗體(如用于產(chǎn)生雙特異性或多特異性抗體)、毒素、細(xì)胞配體或抗原(如用于產(chǎn)生免疫綴合物，如免疫毒素)。本發(fā)明的抗體可以與其他治療部分連接，如放射性同位素、小分子抗癌藥物、重組細(xì)胞因子或趨化因子。因此，本發(fā)明包括多種抗體綴合物、雙特異性和多特異性分子以及融合蛋白，它們均與CLD18表達(dá)細(xì)胞結(jié)合，并可用于將其他分子靶向到這些細(xì)胞。 [0078]在另一個(gè)方面，本發(fā)明還包括來(lái)源于非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的CLD18-結(jié)合蛋白，特別是單鏈蛋白質(zhì)。這些結(jié)合蛋白及其制備方法描述于例如Binz et al.(2005)NatureBiotechnology23(10): 1257-1268，其通過(guò)參考并入本文。應(yīng)理解，本文提供的有關(guān)免疫球蛋白或免疫球蛋白來(lái)源結(jié)合分子的教導(dǎo)相應(yīng)地也適用于來(lái)源于非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合分子。特別地，使用這些來(lái)源于非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合分子有可能阻斷表達(dá)所述靶標(biāo)的細(xì)胞的CLD18，由此帶來(lái)如本文所述的本發(fā)明抗體的治療作用，特別是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。盡管不是必須的，但是有可能將抗體的效應(yīng)子功能賦予這些非免疫球蛋白結(jié)合分子，其通過(guò)例如與抗體的Fe區(qū)域融合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0079]在另一方面中，本發(fā)明提供組合物，如藥物和診斷組合物/試劑盒，其包含與一種本發(fā)明抗體或本發(fā)明抗體組合配制在一起的可藥用載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該組合物包含抗體組合，所述抗體與不同的表位結(jié)合，或者具有不同的功能特征，例如誘導(dǎo)CDC和/或ADCC以及誘導(dǎo)凋亡。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案中，抗體可組合使用，例如作為包含兩種或更多種抗CLD18單克隆抗體的藥物組合物使用。例如，可將具有不同但互補(bǔ)的活性的抗CLD18抗體組合在單一治療中，以實(shí)現(xiàn)所需療效。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物包含介導(dǎo)⑶C的抗CLD18抗體與誘導(dǎo)凋亡的其他抗CLD18抗體的組合。在另一實(shí)施方案中，該組合物包含在效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)高效殺傷靶細(xì)胞的抗CLD18抗體與抑制CLD18表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)的其他抗CLD18抗體的組合。
[0080]本發(fā)明還包括同時(shí)或依次施用兩種或更多種本發(fā)明的抗CLD18抗體，其中至少一種所述抗體為嵌合抗CLD18抗體，且至少一種其他抗體為人抗CLD18抗體，所述抗體結(jié)合CLD18中相同或不同的表位。優(yōu)選地，首先施用本發(fā)明的嵌合CLD18抗體，其后施用本發(fā)明的人抗CLD18抗體，其中所述人抗CLD18抗體優(yōu)選長(zhǎng)期施用，即作為維持療法。
[0081]本發(fā)明的抗體、免疫綴合物、雙特異性和多特異性分子以及組合物可用于抑制表達(dá)CLD18 (特別是CLD18A2)之細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或選擇性殺傷表達(dá)CLD18 (特別是CLD18A2)之細(xì)胞的多種方法中，所述方法通過(guò)使所述細(xì)胞接觸有效量的抗體、免疫綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺傷細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括殺傷表達(dá)CLD18的細(xì)胞，任選地在效應(yīng)細(xì)胞存在下進(jìn)行殺傷，例如通過(guò)CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通過(guò)兩種或更多種這些機(jī)制的組合。可以使用本發(fā)明抗體來(lái)抑制或殺傷的CLD18表達(dá)細(xì)胞包括癌細(xì)胞，如致瘤性的胃、胰腺、食管、肺、卵巢、結(jié)腸、肝、頭頸和膽囊細(xì)胞。
[0082]因此，本發(fā)明的抗體可用于治療和/或預(yù)防多種涉及CLD18表達(dá)細(xì)胞的疾病，這通過(guò)給患這些疾病的患者施用抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢灾委?如改善)或預(yù)防的示例性疾病包括但不僅限于致瘤性疾病?？梢灾委熀?或預(yù)防的致瘤性疾病的實(shí)例包括胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌及其轉(zhuǎn)移。
[0083]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，施用抗體的對(duì)象還另外用化學(xué)治療劑、放射或調(diào)節(jié)(如增強(qiáng)或抑制)Fe受體(如Fe- Y受體)表達(dá)或活性的藥劑(如細(xì)胞因子)進(jìn)行治療。用于在治療期間施用的典型細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-Y (IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。典型治療劑包括抗腫瘤劑如阿霉素、順鉬、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、吉西他濱和環(huán)磷酰胺。
[0084]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用人CLD18或其肽片段優(yōu)選是CLD18A2或其肽片段免疫非人動(dòng)物如小鼠以獲得抗體的免疫策略。用于免疫的優(yōu)選肽為選自SEQ ID NO:2,
4、6、16、18、20-23、26-31、151、153和155-157的肽，或包含所述序列的肽。因此，在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體為通過(guò)用選自SEQ ID NO:2、4、6、16、18、20-23、26-31、151、153和155-157，或使用包含所述序列的肽進(jìn)行免疫而獲得的抗體。類(lèi)似地,可以在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生針對(duì)CLD18的抗體。所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是基因組中包含編碼全部或部分抗體的重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的小鼠。
[0085]可以用CLD18抗原和/或核酸和/或表達(dá)CLD18或其肽片段的細(xì)胞的經(jīng)純化或富集的制劑來(lái)免疫野生型以及非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)選地，所述非人動(dòng)物能夠通過(guò)進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生多種抗CLD18的人單克隆抗體同種型(如IgG、IgA和/或IgM)。同種型轉(zhuǎn)換可通過(guò)如經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換而發(fā)生。
[0086]因此，在另一方面中，本發(fā)明提供來(lái)自上述非人動(dòng)物的分離的B細(xì)胞。接著可通過(guò)與永生化細(xì)胞融合而使所述分離的B細(xì)胞永生化，以提供本發(fā)明抗體的來(lái)源(如雜交瘤)。這樣的雜交瘤(即產(chǎn)生本發(fā)明抗體的雜交瘤)也包括在本發(fā)明的范圍中。
[0087]如本文所示例的`，本發(fā)明的抗體可直接得自表達(dá)該抗體的雜交瘤，或者可以克隆并在宿主細(xì)胞(如CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)中重組表達(dá)。宿主細(xì)胞的其他實(shí)例為微生物，如大腸桿菌，以及真菌，如酵母。作為替代，它們可在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物中重組產(chǎn)生。
[0088]用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體的優(yōu)選雜交瘤為在DSMZ (Mascheroder Weglb,31824Braunschweig, Germany ;新地址:Inhoffenstr.7B, 31824Braunschweig, Germany)測(cè)序或保藏的雜交瘤，其命名和登記號(hào)如下:
[0089]a.182-D1106-055，登記號(hào) DSM ACC2737，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0090]b.182-D1106-056，登記號(hào) DSM ACC2738，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0091]c.182-D1106-057，登記號(hào) DSM ACC2739，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0092]d.182-D1106-058，登記號(hào) DSM ACC2740，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0093]e.182-D1106-059，登記號(hào) DSM ACC2741，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0094]f.182-D1106-062，登記號(hào) DSM ACC2742，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0095]g.182-D1106-067，登記號(hào) DSM ACC2743，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0096]h.182-D758-035，登記號(hào) DSM ACC2745，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0097]1.182-D758-036，登記號(hào) DSM ACC2746，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0098]j.182-D758-040，登記號(hào) DSM ACC2747，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0099]k.182-D1106-061，登記號(hào) DSM ACC2748，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0100]1.182-D1106-279，登記號(hào) DSM ACC2808，保藏于 2006 年 10 月 26 日[0101]m.182-D1106-294，登記號(hào) DSM ACC2809，保藏于 2006 年 10 月 26 日
[0102]n.182-D1106-362，登記號(hào) DSM ACC2810，保藏于 2006 年 10 月 26 日。
[0103]本發(fā)明優(yōu)選的抗體為通過(guò)上述雜交瘤產(chǎn)生并可得自上述雜交瘤的抗體(即對(duì)于182-D1106-055 的情況為 37G11，對(duì)于 182-D1106-056 的情況為 37Η8，對(duì)于 182-D1106-057的情況為38G5，對(duì)于182-D1106-058的情況為38Η3，對(duì)于182-D1106-059的情況為39F11,對(duì)于 182-D1106-062 的情況為 43Α11,對(duì)于 182-D1106-067 的情況為 61C2,對(duì)于182-D758-035 的情況為 26Β5，對(duì)于 182-D758-036 的情況為 26D12，對(duì)于 182-D758-040 的情況為28D10，對(duì)于182-D1106-061的情況為42Ε12，對(duì)于182-D1106-279的情況為125Ε1，對(duì)于182-D1106-294的情況為163Ε12，對(duì)于182-D1106-362的情況為175D10)及其嵌合及人源化形式。
[0104]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括含有如下重鏈恒定區(qū)(CH)的抗體，所述重鏈恒定區(qū)包含來(lái)自人重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，如SEQID NO:46或150所示氨基酸序列或其片段。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括含有如下輕鏈恒定區(qū)(CL)的抗體，所述輕鏈恒定區(qū)包含來(lái)自人輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，如SEQ ID NO:41或148所示氨基酸序列或其片段。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括含有如下重鏈恒定區(qū)(CH)并含有如下輕鏈恒定區(qū)(CL)的抗體，所述重鏈恒定區(qū)包含來(lái)自人重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，如SEQ ID NO:46或150所示氨基酸序列或其片段，所述輕鏈恒定區(qū)包含來(lái)自人輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，如SEQ ID NO:41或148所示氨基酸序列或其片段。
[0105]包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO:45所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:150所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO:149所示核酸序列的核酸編碼。包含S EQ ID NO:41所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO:40所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:148所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO:147所示核酸序列的核酸編碼。
[0106]在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合形式的抗體包括這樣的抗體，其包含重鏈和/或輕鏈，所述重鏈含有選自SEQ ID N0:115、116、117、118、119、120及其片段的氨基酸序列，所述輕鏈含有選自SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129及其片段的氨基酸序列。
[0107]在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合形式的抗體包括這樣的抗體，其包含選自以下可能性(i)至(ix)的重鏈和輕鏈的組合:
[0108]⑴包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:122所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0109](ii)包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:121所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0110](iii)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:123所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0111](iv)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:126所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0112](V)包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:125所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0113](vi)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:124所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0114](vii)包含SEQ ID NO: 120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:127所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0115](viii)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:128所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，和 [0116](ix)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:129所示氨基酸序列或其片段的輕鏈。
[0117]上文使用的“片段”或“氨基酸序列的片段”涉及抗體序列的一部分，即代表N和/C端縮短的抗體序列的序列，其在替換抗體中的所述抗體序列時(shí)保留所述抗體對(duì)CLD18的結(jié)合，并優(yōu)選保留所述抗體如本文所述的功能，例如CDC介導(dǎo)的裂解或ADCC介導(dǎo)的裂解。優(yōu)選地，氨基酸序列的片段含有來(lái)自所述氨基酸序列的至少80 %、優(yōu)選至少90 %、95 %、96%、97%、98%或 99%的氨基酸殘基。選自 SEQ ID NO:115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128和129的氨基酸序列的片段優(yōu)選涉及其中除去了 N端17、18、19、20、21、22或23個(gè)氨基酸的所述序列。本文所述氨基酸序列的片段可分別由編碼所述氨基酸序列的核酸序列的片段編碼。
[0118]包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:100所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:101所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:102所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQID NO:104所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:103所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:105所示核酸序列的核酸編碼。
[0119]包含SEQ ID NO:122所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:107所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:121所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:106所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:123所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:108所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:126所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQID NO:111所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:125所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:110所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:124所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:109所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO: 127所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:112所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:128所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:113所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:129所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:114所示核酸序列的核酸編碼。
[0120]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變區(qū)(VH)，其含有選自SEQID NO:132、133、134、135、136、137及其片段的氨基酸序列。
[0121]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變區(qū)(VL)，其含有選自SEQID NO:138、139、140、141、142、143、144、145、146 及其片段的氨基酸序列。
[0122]在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括這樣的抗體，其包含選自以下可能性(i)至(ix)的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的組合:
[0123]⑴包含SEQ ID NO: 132所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:139所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0124](ii)包含SEQ ID NO: 133所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:138所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0125](iii)包含SEQ ID NO:134所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:140所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0126](iv)包含SEQ ID NO: 136所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0127](V)包含SEQ ID NO: 135所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:142所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0128](vi)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0129](vii)包含SEQ ID NO:137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:144所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0130](viii)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:145所示氨基酸序列或其片段的VLJP
[0131](ix)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:146所示氨基酸序列或其片段的VL。
`[0132]包含SEQ ID NO:132所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID N0:55所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:133所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID N0:56所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:134所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO:57所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:136所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO:59所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ IDNO:58所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:137所示氨基酸序列的VH可由包含SEQID NO:60所示核酸序列的核酸編碼。
[0133]包含SEQ ID NO:139所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID N0:62所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:138所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:61所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:140所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:63所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:66所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:142所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ IDNO:65所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的VL可由包含SEQID NO:64所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:67所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:145所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:68所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:69所示核酸序列的核酸編碼。
[0134]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含VH，其含有選自以下實(shí)施方案(i)至(vi)的CDR1、CDR2和CDR3互補(bǔ)性決定區(qū)組:
[0135](i)CDRl:SEQ ID NO:115 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:115 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:115 的 116-125 位，
[0136](ii)CDRl:SEQ ID NO:116 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:116 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:116 的 116-126 位，
[0137](iii)CDRl:SEQ ID NO:117 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:117 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:117 的 116-124 位，
[0138](iv)CDRl:SEQ ID NO:118 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:118 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:118 的 116-126 位，
[0139](v)CDRl:SEQ ID NO:119 的 44-51 位，CDR2:SEQ ID NO:119 的 69-76 位，CDR3:SEQ ID NO:119 的 115-125 位，
[0140](vi)CDRl: SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位。
[0141]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含VL，其含有選自以下實(shí)施方案(i)至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互補(bǔ)性決定區(qū)組:
[0142](i)CDRl:SEQ IDNO:121 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:121 的 76-78 位，CDR3:SEQID NO:121 的 115-123 位，
[0143](ii)CDRl:SEQ ID NO:122 的 49-53 位，CDR2:SEQ ID NO:122 的 71-73 位，CDR3:SEQ ID NO:122 的 110-118 位，
[0144](iii)CDRl:SEQ ID NO:123 的 47-52 位，CDR2:SEQ ID NO: 123 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:123 的 109-117 位，
[0145](iv)CDRl:SEQ ID NO:124 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:124 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:124 的 115-123 位，
[0146](v)CDRl:SEQ ID NO:125 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:125 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:125 的 115-123 位，
[0147](vi)CDRl:SEQ ID NO:126 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:126 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:126 的 115-122 位，
[0148](vii)CDRl:SEQ ID NO:127 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:127 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:127 的 115-123 位，
[0149](viii)CDRl:SEQ ID NO:128 的47-58位，CDR2:SEQ ID NO:128 的76-78位，CDR3:SEQ ID NO:128 的 115-123 位，和
[0150](ix)CDRl:SEQ ID NO:129 的 47-52 位，CDR2:SEQ ID NO:129 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:129 的 109-117 位。
[0151]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含VH和VL，其分別含有選自以下實(shí)施方案⑴至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互補(bǔ)性決定區(qū)組:
[0152](i)VH:CDR1:SEQ ID NO: 115 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:115 的 70-77位，CDR3:SEQ ID N0:115的116-125位，VL:CDR1:SEQ ID NO:122 的 49-53 位，CDR2:SEQ ID NO:122的 71-73 位，CDR3:SEQ ID NO:122 的 110-118 位，
[0153](ii)VH:CDR1:SEQ ID NO:116 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:116 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:116 的 116-126 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:121 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:121 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:121 的 115-123 位，[0154](iii) VH:CDR1:SEQ IDNO:117 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:117 的 70-77 位，CDR3:SEQ IDNO:117 的 116-124 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:123 的 47-52 位，CDR2:SEQ IDNO:123 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:123 的 109-117 位，
[0155](iv)VH:CDR1:SEQ ID NO:119 的 44-51 位，CDR2:SEQ ID NO:119 的 69-76 位，CDR3:SEQ ID NO:119 的 115-125 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:126 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:126 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:126 的 115-122 位，
[0156](v)VH:CDR1:SEQ ID NO: 118 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:118 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:118 的 116-126 位，VL:CDR1:SEQ ID NO: 125 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:125的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:125 的 115-123 位，
[0157](vi)VH:CDR1:SEQ ID NO: 120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO: 120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:124 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:124 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:124 的 115-123 位，
[0158](vii) VH:CDR1:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:127 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:127 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:127 的 115-123 位，
[0159](viii) VH:CDR1:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:128 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:128 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:128 的 115-123 位，和
[0160](ix)VH:CDR1:SEQ ID NO: 120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO: 120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:129 的 47-52 位，CDR2:SEQ IDNO:129 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:129 的 109-117 位。
`[0161]在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體優(yōu)選包含針對(duì)CLD18的單克隆抗體(優(yōu)選本文所述針對(duì)CLD18的單克隆抗體)中重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，優(yōu)選至少包含CDR3可變區(qū)，并且優(yōu)選包含本文所述重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R)，優(yōu)選至少包含⑶R3可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)選自本文所述的CDR1、CDR2和CDR3互補(bǔ)性決定區(qū)組。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體優(yōu)選包含針對(duì)CLD18的單克隆抗體(優(yōu)選本文所述針對(duì)CLD18的單克隆抗體)重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的互補(bǔ)性決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，并優(yōu)選包含本文所述重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)的互補(bǔ)性決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3。
[0162]在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述包含一個(gè)或多個(gè)⑶R、一組⑶R或⑶R組的組合的本發(fā)明抗體包含與其介入構(gòu)架區(qū)(intervening framework region)在一起的所述⑶R。優(yōu)選地，該部分還將包含第一個(gè)和第四個(gè)構(gòu)架區(qū)中其一或其二的至少約50%，所述50%為第一個(gè)構(gòu)架區(qū)的C端50%和第四個(gè)構(gòu)架區(qū)的N端50%。構(gòu)建通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明抗體可能導(dǎo)致在可變區(qū)的N端或C端引入接頭編碼的殘基，所述接頭的引入是為了便于克隆或其他操作步驟，包括引入接頭以連接本發(fā)明的可變區(qū)與其他蛋白質(zhì)序列，所述其他序列包括免疫球蛋白重鏈、其他可變結(jié)構(gòu)域(例如在雙抗體的產(chǎn)生中)或蛋白質(zhì)標(biāo)簽。
[0163]在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述包含一個(gè)或多個(gè)⑶R、一組⑶R或⑶R組的組合的本發(fā)明抗體在人抗體構(gòu)架中包含所述CDR。[0164]本文中提到的在其重鏈中包含特定鏈或特定區(qū)域或特定序列的抗體優(yōu)選涉及所述抗體的所有重鏈均包含所述特定鏈、區(qū)域或序列的情況。相應(yīng)地，這也適用于抗體的輕鏈。
[0165]本發(fā)明還涉及核酸，其包含編碼如本文所述抗體或其部分(如抗體鏈)的基因或核酸序列。該核酸可以包含在載體中，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或者例如在遺傳工程中常規(guī)使用的其他載體。所述載體可包含其他基因，例如允許在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中和在適當(dāng)?shù)臈l件下選擇該載體的標(biāo)記基因。此外，所述載體還可包含允許編碼區(qū)在適當(dāng)宿主中正確表達(dá)的表達(dá)控制元件。這樣的控制元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可包括啟動(dòng)子、剪接盒以及翻譯起始密碼子。
[0166]優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸與允許在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的上述表達(dá)控制序列有效連接。確保在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的控制元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0167]用于構(gòu)建本發(fā)明核酸分子、構(gòu)建包含上述核酸分子的載體、將載體引入正確選擇的宿主細(xì)胞、引起或?qū)崿F(xiàn)表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是公知的。
[0168]本發(fā)明的另一方面涉及包含本文所述核酸或載體的宿主細(xì)胞
[0169]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)在以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求中將十分明顯。
[0170]附圖詳述
[0171]圖1顯示轉(zhuǎn)染了與綠色熒光染料偶聯(lián)的CLD18A2的HEK293細(xì)胞的免疫熒光分析，所述細(xì)胞與用SEQ ID NO : 15進(jìn)行DNA免疫后的小鼠血清進(jìn)行了反應(yīng)，所述SEQ ID NO:15是與輔助表位(helper epitope)相融合的。
[0172]圖 2 顯示轉(zhuǎn)染了 CLD18A2-myc(SEQ ID NO:3)的 HEK293 細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的 HEK293細(xì)胞的Western印跡分析，所述分析使用單克隆小鼠抗c_myc抗體9E11 (Serotec, CRLMCA2200)進(jìn)行。
[0173]圖3顯示使用轉(zhuǎn)染了 CLD18A2的CHO細(xì)胞和多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)進(jìn)行的免疫熒光分析。
[0174]圖4A和B顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的雜交瘤上清液24H5和85A3與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了人CLD18A2和熒光標(biāo)記的HEK293細(xì)胞的結(jié)合。圖4C顯示雜交瘤上清液45C1、125E1、163E12、166E2和175D10與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人CLD18A2并用碘化丙錠(propidium iodide)復(fù)染的HEK293細(xì)胞的結(jié)合。
[0175]圖5顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的雜交瘤上清液24H5(A)、9E8(B)、26B5(C)和19B9 (D)與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了熒光標(biāo)記以及人CLD18A2或CLD18A2_Myc或CLD18A2-HA的HEK293細(xì)胞的結(jié)合。
[0176]圖6A和B顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的雜交瘤上清液37H8、43A11、45C1和163E12與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人CLD18A2或CLD18A1的HEK293細(xì)胞的結(jié)合。
[0177]圖7顯示CLD18A2同工型(isoform)特異性單克隆抗體37G11的免疫熒光分析，所述分析通過(guò)在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)條件下染色分別轉(zhuǎn)染了 CLD18A2(A、C)和CLD18A1 (B、D)的HEK293細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。
[0178]圖8顯示CLD18單克隆抗體26B5的免疫熒光分析，所述分析通過(guò)在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)條件下染色分別轉(zhuǎn)染了 CLD18A2(A、C)和CLD18A1 (B、D)的HEK293細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。[0179]圖9.細(xì)胞系 RT-PCR
[0180]使用CLD18A2特異性引物的RT-PCR分析顯示在4/5的測(cè)試細(xì)胞系中有明確的表達(dá)。
[0181]圖10顯示DAN-G細(xì)胞(亞克隆F2)和多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)的免疫熒光分析。
[0182]圖11顯示KATO-1II細(xì)胞(亞克隆3B94D5)和多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)的免疫熒光分析。
[0183]圖12A顯示SNU-16細(xì)胞(亞克隆G5)與多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)的免疫熒光分析。圖12B顯示KATO-1II細(xì)胞與本發(fā)明單克隆抗體的免疫熒光分析。
[0184]圖13顯示CLD18在KATO-1II和NUGC-4細(xì)胞表面的表達(dá)，其通過(guò)用單克隆抗體61C2和163E12染色隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)來(lái)進(jìn)行分析。
[0185]圖 14.人 CLD18A1 (NP057453)、人 CLD18A2 (ΝΡ_001002026)、小鼠CLD18A1 (NP_062789)和小鼠 CLD18A2 (AAL15636)的蛋白質(zhì)比對(duì)。
[0186]圖15A和B顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析的雜交瘤上清液38G5、38H3、37G11、45C1和163E12分別與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了熒光標(biāo)記以及鼠CLD18A1或鼠CLD18A2的HEK293細(xì)胞的結(jié)合。
[0187]圖16.使用多克 隆抗體pl05進(jìn)行的免疫組化分析
[0188]對(duì)正常組織亞組(胃、肺、骨髓和前列腺)的免疫組化染色證實(shí)了胃組織特異性(A)。還在胃癌(上面一行)和肺癌(B)中檢測(cè)到了表達(dá)。僅分化細(xì)胞表達(dá)CLD18A2，但干細(xì)胞不表達(dá)(C)。
[0189]圖17.使用單克隆抗體39F11D7進(jìn)行的免疫組化分析
[0190](A)在正常胃粘膜中檢測(cè)到特異性蛋白質(zhì)表達(dá)，而測(cè)試的所有其他正常組織均為陰性。
[0191](B)在胃癌和肺癌中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)CLD18A2表達(dá)。
[0192]圖18.使用單克隆抗體 26B5(A)、17?10(B)、43A11(C)、163E12(D)和 45C1 (E)進(jìn)行的免疫組化分析。所有抗體均顯示HEK293-CLD18A2異種移植腫瘤和胃癌標(biāo)本的強(qiáng)染色，而用HEK293-模擬對(duì)照轉(zhuǎn)染的腫瘤則不然。
[0193]圖19是比較通過(guò)85A3、28D10、24H5或26D12誘導(dǎo)針對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人CLD18A2的HEK293的CDC之后死細(xì)胞百分比的圖，使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。
[0194]圖 20 是通過(guò) 24H5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12或61C2誘導(dǎo)針對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人CLD18A2或人CLD18A1的貼壁CHO細(xì)胞的CDC之后特異性細(xì)胞裂解百分比的圖，通過(guò)熒光測(cè)量來(lái)測(cè)定。
[0195]圖21顯示75B8(A)、28D10(B)或37H8 (C)濃度依賴(lài)性誘導(dǎo)針對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人CLD18A2的CHO細(xì)胞的⑶C，通過(guò)熒光測(cè)量來(lái)測(cè)定。
[0196]圖22顯示在MNC存在下分別由26B5、37H8、38G5、47D12和61C2誘導(dǎo)的HEK293-CLD18A2 細(xì)胞裂解。
[0197]圖23顯示在MNC存在下分別由26B5、37H8、38G5、47D12和61C2誘導(dǎo)的HEK293-CLD18A1 細(xì)胞裂解。
[0198]圖24顯示在使用HEK293-CLD18A2細(xì)胞的早期治療異種移植模型中本發(fā)明抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。
[0199]圖25A和B顯示在兩種使用HEK293-CLD18A2細(xì)胞的早期治療異種移植模型中通過(guò)使用本發(fā)明抗體治療的存活延長(zhǎng)。
[0200]圖26顯示在使用HEK293-CLD18A2細(xì)胞的深度治療(advanced treatment)異種移植模型中通過(guò)本發(fā)明抗體的存活延長(zhǎng)。
[0201]圖27A顯示在早期治療異種移植模型中通過(guò)本發(fā)明抗體的腫瘤生長(zhǎng)抑制。圖27B顯示在早期治療異種移植模型中通過(guò)本發(fā)明抗體的存活延長(zhǎng)。使用內(nèi)源表達(dá)CLD18A2的DAN-G細(xì)胞。
[0202]圖28顯示小鼠組織中的CLD18A2mRNA表達(dá)。使用CLD18A2特異性引物的RT-PCR研究顯示，在除胃以外的所有所測(cè)試正常組織中均無(wú)顯著表達(dá)。分析了以下正常組織:1:小腸，2:脾，3:皮膚，4:胃，5:肺，6:胰腺，7:淋巴結(jié)，8:胸腺，9:陰性對(duì)照。
[0203]圖29顯示正常胃中的CLD18表達(dá)。使用CLD18特異性抗體的小鼠胃免疫組化分析顯示了保守的表達(dá)模式。盡管表面上皮和更深處的隱窩(crypt)在其表面表達(dá)CLD18，但中央頸部(central neck region)為 CLD18 陰性。
[0204]圖30顯示小鼠胃組織的蘇木精和伊紅染色。顯示了用37G11處理的小鼠與僅用PBS處理的對(duì)照小鼠(C和D)相比較的胃的概況(A)和細(xì)節(jié)(B)。
[0205]圖31A和B顯示使用本發(fā)明抗體(43A11、125E1、163E12、166E2和17OT10)對(duì)分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 CLD18A1和A2的HEK293細(xì)胞以及內(nèi)源性表達(dá)的KATO-1II細(xì)胞進(jìn)行的流式細(xì)胞染色。
[0206]圖32顯示本發(fā)明嵌合抗體介導(dǎo)的對(duì)CLD18A2表達(dá)細(xì)胞的⑶C。
[0207]圖33顯示本發(fā)明嵌合抗體介導(dǎo)的對(duì)KATO-1II細(xì)胞的ADCC。
`[0208]圖34顯示在早期治療異種移植模型中用嵌合抗體ch_175D10和ch_163E12治療得到的延長(zhǎng)存活。
[0209]圖35顯示在高級(jí)治療異種移植模型中用嵌合抗體ch_175D10和ch_163E12治療得到的延長(zhǎng)存活。
[0210]圖36顯示使用抗體ch-175D10和ch_163E12的表位作圖實(shí)驗(yàn)。分析了 CLD18A2的第一細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域無(wú)修飾的氨基酸序列(上面一排，無(wú)Cys-Ser替換)或具有半胱氨酸-絲氨酸替換的氨基酸序列(下面一排，有Cys-Ser替換)。
[0211]圖37顯示CLD18A2的第一細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的三個(gè)不同蛋白質(zhì)折疊模型。
[0212]圖38A、B和C顯示，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所分析的ch-175D10、ch_163E12和ch_125El與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)志物以及鼠CLD18A1 / CLD18A2或人CLD18A1 / CLD18A2的HEK293細(xì)胞的結(jié)合。僅僅分析轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過(guò)PI染色從分析中排除死細(xì)胞。
[0213]圖39顯示CLD18A2在原發(fā)胃腫瘤和胃腫瘤轉(zhuǎn)移中的質(zhì)膜高水平表達(dá)。用GC182特異性兔抗血清對(duì)來(lái)自原發(fā)胃癌和胃癌轉(zhuǎn)移(庫(kù)肯勃氏瘤和淋巴結(jié))的非選擇樣本進(jìn)行染色。由專(zhuān)業(yè)臨床病理醫(yī)師進(jìn)行免疫組化和染色強(qiáng)度評(píng)價(jià)(陰性、弱=1，中等=2，強(qiáng)=3)和顯示質(zhì)膜染色的腫瘤細(xì)胞比例(0-100%)。每個(gè)圓圈代表獨(dú)立的腫瘤樣品。觀察到轉(zhuǎn)移中統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加的染色強(qiáng)度(P=0.034, Fisher確切檢驗(yàn))。
[0214]發(fā)明詳述
[0215]本文所述抗體可以是與CLD18上存在的表位優(yōu)選位于CLD18細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(特別是第一細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)中的表位特異性結(jié)合的分離的單克隆抗體。本發(fā)明涵蓋的分離的單克隆抗體包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體為IgGl抗體，更具體地為IgGlK或IgGlX同種型。在另一實(shí)施方案中，所述抗體為IgG3抗體，更具體地為IgG3K或IgG3X同種型。在另一實(shí)施方案中，所述抗體為IgG4抗體，更具體地為IgG4K或IgG4X同種型。在另一實(shí)施方案中，所述抗體為IgAl或IgA2抗體。在另一實(shí)施方案中，所述抗體為IgM抗體。
[0216]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的抗體，其與表達(dá)CLD18的細(xì)胞特異性結(jié)合，并且優(yōu)選地(i)與表達(dá)CLD18A2的細(xì)胞結(jié)合，并且(ii)不與不表達(dá)CLD18A2但表達(dá)CLD18A1的細(xì)胞結(jié)合。本發(fā)明的抗體優(yōu)選地⑴介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18A2的細(xì)胞，并且(ii)不介導(dǎo)殺傷不表達(dá)CLD18A2但表達(dá)CLD18A1的細(xì)胞。
[0217]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的抗體，其(i)與表達(dá)CLD18的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，(ii)不與表達(dá)CLD18的正常胃粘膜細(xì)胞結(jié)合，和/或(iii)不與表達(dá)CLD18的非癌肺組織細(xì)胞結(jié)合。
[0218]本發(fā)明還包括這樣的抗體，其⑴介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18的腫瘤細(xì)胞，(ii)不介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18的正常胃粘膜細(xì)胞，和/或(iii)不介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18的非癌肺組織細(xì)胞。
[0219]在一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(i)結(jié)合存在于CLD18A2上但不存在于CLD18A1上的表位，優(yōu)選SEQ ID NO:21、22和23，(ii)結(jié)合位于CLDl8A2環(huán)I上的表位，優(yōu)選SEQ ID NO:28, (iii)結(jié)合位于CLD18A2環(huán)2上的表位，優(yōu)選SEQ ID NO:30, (iv)結(jié)合位于CLD18A2環(huán)D3上的表位，優(yōu)選SEQ ID NO:31，(V)結(jié)合包括CLD18A2環(huán)I和CLD18A2環(huán)D3的表位，(vi)結(jié)合位于CLD18A2環(huán)D3上的非糖基化表位，優(yōu)選SEQ ID N0:29，或者(vii)結(jié)合人和小鼠CLD18中存在的表位(分別為SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:37)。
[0220]在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合存在于CLD18A2上但不存在于CLD18A1上的表位。
[0221]本發(fā)明的抗體包括全人抗體。這樣的抗體可以在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如轉(zhuǎn)基因小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠通過(guò)進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生多種針對(duì)CLD18的人單克隆抗體同種型。這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可以是如US2003 / 0017534所公開(kāi)的用于產(chǎn)生多克隆抗體的轉(zhuǎn)基因兔。
[0222]本發(fā)明抗體與CLD18抗原的結(jié)合可介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)，例如通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)。對(duì)表達(dá)CLD18的細(xì)胞的殺傷可通過(guò)一種或多種以下機(jī)制發(fā)生:表達(dá)CLD18的細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(⑶C);表達(dá)CLD18的細(xì)胞的凋亡；表達(dá)CLD18的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞吞噬作用；或者表達(dá)CLD18的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。
[0223]為了更易于理解本發(fā)明，首先定義一些術(shù)語(yǔ)。其他定義在詳述全文中公開(kāi)。
[0224]術(shù)語(yǔ)定義 [0225]術(shù)語(yǔ)“CLD18”指密蛋白_18，并包括細(xì)胞天然表達(dá)的或轉(zhuǎn)染了 CLD18基因的細(xì)胞所表達(dá)的CLD18的任何變體(包括CLD18A1和CLD18A2)、構(gòu)象、同工型和種間同源物(specieshomologs) ο優(yōu)選地，“CLD18”指人CLD18，特別是人CLD18A2和/或人CLD18A1，更優(yōu)選人CLD18A2。人CLD18A2優(yōu)選涉及(i)包含編碼SEQ ID NO:2之氨基酸序列的核酸序列的核酸，例如包含SEQ ID NO:1核酸序列的核酸，或者(ii)包含SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且包括細(xì)胞天然表達(dá)的或轉(zhuǎn)染了 CLD18A2基因的細(xì)胞所表達(dá)的其任何變體、構(gòu)象、同工型和種間同源物。
[0226]人CLD18A1優(yōu)選涉及(i)包含編碼SEQ ID NO:8之氨基酸序列的核酸序列的核酸，例如包含SEQ ID NO:7核酸序列的核酸，或者(ii)包含SEQ ID NO:8氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且包括細(xì)胞天然表達(dá)的或轉(zhuǎn)染了 CLD18A1基因的細(xì)胞所表達(dá)的其任何變體、構(gòu)象、同工型和種間同源物。
[0227]"CLD18的變體”還包括基本由CLD18的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或胞外域組成的CLD18形式。CLD18 “細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”或“胞外域”指基本不含跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CLD18多肽形式。應(yīng)理解，所鑒定的本發(fā)明CLD18多肽的任何跨膜結(jié)構(gòu)域是根據(jù)本領(lǐng)域中用于鑒定疏水結(jié)構(gòu)域類(lèi)型的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)所鑒定的?？缒そY(jié)構(gòu)域的確切邊界可有所不同，但是大部分是相似的，在本文最初所鑒定的結(jié)構(gòu)域的任一端不超過(guò)約5個(gè)氨基酸。因此，如實(shí)施例或說(shuō)明書(shū)中所鑒定的，任選地，CLD18多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可在跨膜結(jié)構(gòu)域/細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域邊界的任一側(cè)含有約5個(gè)或更少的氨基酸，本發(fā)明涵蓋了帶有或不帶相關(guān)信號(hào)肽的這些多肽，以及編碼它們的核酸。 [0228]術(shù)語(yǔ)“CLD18變體”應(yīng)包括(i) CLD18剪接變體，(ii) CLD18翻譯后修飾變體，特別是包括N-糖基化狀態(tài)不同的變體，(iii)CLD18構(gòu)象變體，特別是包括CLD18-構(gòu)象-1、CLD18-構(gòu)象-2和CLD18-構(gòu)象-3，(iv)位于胞間緊密連接處的游離CLD18和同型/異型相關(guān)聯(lián)變體，(v)CLD18癌癥相關(guān)變體和CLD18非癌癥相關(guān)變體。
[0229]術(shù)語(yǔ)“脂筏(raft) ”指位于細(xì)胞質(zhì)膜外小葉區(qū)中的富含鞘脂和膽固醇的膜微結(jié)構(gòu)域。某些蛋白質(zhì)結(jié)合到這些結(jié)構(gòu)域中的能力及其形成“聚集體”或“病灶聚集體”的能力可影響該蛋白質(zhì)的功能。例如，CLD18分子在結(jié)合本發(fā)明抗體后遷移到這些結(jié)構(gòu)中，這在質(zhì)膜中產(chǎn)生高密度的CLD18抗原-抗體復(fù)合物。這些高密度的CLD18抗原-抗體復(fù)合物能在CDC過(guò)程中有效活化補(bǔ)體系統(tǒng)。
[0230]術(shù)語(yǔ)“構(gòu)象”和“拓?fù)洹泵枋稣系哪し肿尤绾味ㄎ辉诩?xì)胞表面的膜中，特別地，其哪個(gè)區(qū)域在胞外并因而適合結(jié)合抗體。例如，CLD18可以三種不同構(gòu)象存在，這很可能取決于它是否以同聚體或異聚體為優(yōu)勢(shì)，或者它是整合在超分子緊密連接結(jié)構(gòu)中還是“游離的”。這些不同的狀態(tài)導(dǎo)致適于結(jié)合抗體的不同表位。
[0231]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“疾病”指任何病理狀態(tài)，包括癌癥，特別是本文所述的癌癥形式。本文中任何對(duì)癌癥或特定癌癥形式的引用還包括其癌轉(zhuǎn)移。
[0232]“腫瘤”指一組異常的細(xì)胞或組織，它們通過(guò)快速、不受控制的細(xì)胞增殖來(lái)生長(zhǎng)，并在引發(fā)該新生物生長(zhǎng)的刺激停止后仍繼續(xù)生長(zhǎng)。腫瘤顯示出部分或完全缺失結(jié)構(gòu)的組織以及與正常組織的功能協(xié)調(diào)，并通常形成可以為良性或惡性的獨(dú)特組織塊。
[0233]“轉(zhuǎn)移”指癌細(xì)胞從其初始部位傳播到身體的其他部位。轉(zhuǎn)移的形成是非常復(fù)雜的過(guò)程，依賴(lài)于惡性細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中脫離、侵襲胞外基質(zhì)、透過(guò)內(nèi)皮基底膜以進(jìn)入體腔和血管以及其后由血轉(zhuǎn)運(yùn)后浸潤(rùn)靶器官。最后，新腫瘤在靶部位的生長(zhǎng)依賴(lài)于血管發(fā)生。腫瘤轉(zhuǎn)移經(jīng)常甚至在切除原發(fā)腫瘤后發(fā)生，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞或組分可能殘留并發(fā)展出轉(zhuǎn)移潛力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移”指“遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移”，這是指遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤和局部淋巴結(jié)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移”涉及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?？墒褂帽景l(fā)明抗體治療的一個(gè)具體轉(zhuǎn)移形式是來(lái)自以胃癌為原發(fā)部位的轉(zhuǎn)移。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，這些胃癌轉(zhuǎn)移是庫(kù)肯勃氏瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和/或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
[0234]庫(kù)肯勃氏瘤是不常見(jiàn)的卵巢轉(zhuǎn)移腫瘤，其占所有卵巢腫瘤的1%到2%。庫(kù)肯勃氏瘤的預(yù)后仍然非常差，尚沒(méi)有針對(duì)庫(kù)肯勃氏瘤的成熟治療。庫(kù)肯勃氏瘤是卵巢的轉(zhuǎn)移性印戒細(xì)胞腺癌。在大部分庫(kù)肯勃氏瘤病例中(70%)，胃是其原發(fā)部位。結(jié)腸、闌尾和乳腺(主要是浸潤(rùn)性小葉癌)是第二常見(jiàn)的原發(fā)部位。很少見(jiàn)報(bào)道來(lái)自膽囊、膽管、胰腺、小腸、肝胰壺腹、子宮頸和膀胱/臍尿管的庫(kù)肯勃氏瘤的病例。原發(fā)癌癥的診斷和隨后發(fā)現(xiàn)卵巢轉(zhuǎn)移的間隔通常是6個(gè)月或更短，但是也報(bào)道有更長(zhǎng)的間隔。在許多病例中，原發(fā)腫瘤非常小，可能檢測(cè)不到。僅在20%至30%的病例中得到之前的胃癌或其它器官癌癥史。
[0235]庫(kù)肯勃氏瘤是癌癥選擇性散播的例子，最常見(jiàn)為胃-卵巢軸線。此腫瘤散播軸線在歷史上引起了許多病理學(xué)家的注意，尤其是當(dāng)發(fā)現(xiàn)胃癌選擇性轉(zhuǎn)移到卵巢而不涉及其它組織時(shí)。胃癌向卵巢的轉(zhuǎn)移途徑在很長(zhǎng)時(shí)間中曾經(jīng)是一個(gè)謎，但現(xiàn)在已經(jīng)清楚逆行性淋巴散播是轉(zhuǎn)移的最可能途徑。
[0236]患有庫(kù)肯勃氏瘤的女性相對(duì)于患轉(zhuǎn)移性癌癥的患者來(lái)說(shuō)趨向于非常年輕，其通常為40多歲，平均45歲。這種年輕的年齡分布可部分地與年輕女性中胃印戒細(xì)胞瘤的頻率增加有關(guān)。常見(jiàn)癥狀通常涉及卵巢累及，最常見(jiàn)的是腹部疼痛和膨脹(主要是由于一般位于兩側(cè)并且經(jīng)常較大的卵巢實(shí)體)。其余患者具有非特異性的胃腸癥狀，或者無(wú)癥狀。另外，據(jù)報(bào)道庫(kù)肯勃氏瘤與卵巢基質(zhì)所產(chǎn)生的激素導(dǎo)致的男性化有關(guān)。50%的病例中存在腹水，并且通常顯示出惡性細(xì)胞。
[0237]在超過(guò)80 %的報(bào)告病例中，庫(kù)肯勃氏瘤是兩側(cè)的。卵巢經(jīng)常不對(duì)稱(chēng)地增大，具有圓凸的外形。切片表面是黃色或白色，它們通常是實(shí)心的，盡管它們有時(shí)是囊性的。重要的是，具有庫(kù)肯勃氏瘤的卵巢的囊表面通常是光滑的，并且沒(méi)有粘連和腹膜沉積。值得注意的是，其它轉(zhuǎn)移到卵巢的腫瘤傾向于與表面植入有關(guān)。這可以解釋為什么庫(kù)肯勃氏瘤的大致形態(tài)令人迷惑地好似原發(fā)卵巢`腫瘤。但是，庫(kù)肯勃氏瘤中的兩側(cè)對(duì)稱(chēng)與其轉(zhuǎn)移的特性相一致。
[0238]患有庫(kù)肯勃氏瘤的患者總致死率非常高。大部分患者在兩年內(nèi)死去(存活期中值:14個(gè)月)。一些研究表明在原發(fā)腫瘤是在卵巢轉(zhuǎn)移被發(fā)現(xiàn)后才鑒定出時(shí)，預(yù)后很差，并且如果始終未檢查出原發(fā)腫瘤的話，預(yù)后更差。
[0239]文獻(xiàn)中對(duì)于庫(kù)肯勃氏瘤尚未明確地建立最優(yōu)的治療策略。是否應(yīng)該手術(shù)切除尚未得到充分地認(rèn)識(shí)?；瘜W(xué)療法或放射療法對(duì)庫(kù)肯勃氏瘤患者的預(yù)后沒(méi)有顯著作用。
[0240]術(shù)語(yǔ)“治療疾病”包括疾病或其癥狀的治療、持續(xù)時(shí)間的縮短、改善、預(yù)防、延緩或抑制其發(fā)展或惡化，或者延緩其發(fā)作。
[0241]根據(jù)本發(fā)明，樣品可以是根據(jù)本發(fā)明可用的任何樣品，特別是生物樣品如組織樣品(包括體液)和/或細(xì)胞樣品，并可以常規(guī)方式獲得，例如通過(guò)組織活檢(包括鉆孔活檢)和通過(guò)收集血、支氣管吸出物、痰、尿、排泄物或其他體液來(lái)獲得。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“生物樣品”還包括生物樣品的級(jí)分。
[0242]術(shù)語(yǔ)“抗體”指包含通過(guò)二硫鍵互聯(lián)的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈或其抗原結(jié)合部分的糖蛋白。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括抗體(特別是本文所述抗體)的所有重組形式，例如在原核細(xì)胞中表達(dá)的抗體、未糖基化的抗體以及任何與抗原結(jié)合的抗體片段和下文所述的衍生物。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為稱(chēng)為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，它們散布在稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域中。每條VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，從氨基端至羧基端按以下順序排列:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)該免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。
[0243]術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指具有基本來(lái)自非人物種免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列。所述抗原結(jié)合位點(diǎn)可包含融合到恒定結(jié)構(gòu)域上的完整可變結(jié)構(gòu)域，或者僅包含移植到可變結(jié)構(gòu)域中適當(dāng)構(gòu)架區(qū)的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以是野生型的，或者通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換進(jìn)行修飾，例如進(jìn)行修飾以與人免疫球蛋白更為相近。某些形式的人源化抗體保留了全部CDR序列(例如含有來(lái)自小鼠抗體的全部六個(gè)CDR的人源化小鼠抗體)。其他形式具有一個(gè)或多個(gè)相對(duì)于原始抗體而言發(fā)生了改變的CDR。
[0244]術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中每個(gè)重鏈和輕鏈氨基酸序列的一部分與來(lái)自特定物種的抗體中相應(yīng)氨基酸序列同源，或者屬于特定的類(lèi)別，而該鏈的其余區(qū)段則與另一物種中的相應(yīng)序列同源。一般地，輕鏈和重鏈的可變區(qū)均模擬來(lái)自一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的抗體的可變區(qū)，而恒定部分則與來(lái)自另一物種的抗體序列同源。這種嵌合形式的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是可使用易于獲得的B細(xì)胞或來(lái)自非人宿主生物的雜交瘤從目前已知的來(lái)源中方便地產(chǎn)生可變區(qū)，而與其組合的恒定區(qū)來(lái)自例如人細(xì)胞制備物。所述可變區(qū)具有易于制備的優(yōu)點(diǎn)，并且特異性不受來(lái)源的影響，而由于恒定區(qū)為人類(lèi)，因此該抗體在注射時(shí)引發(fā)人對(duì)象免疫應(yīng)答的可能性將比恒定區(qū)來(lái)自非人來(lái)源時(shí)更低。然而，定義不限于此具體實(shí)例。
[0245]本文使用的術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱(chēng)為“結(jié)合部位”)指抗體中保留特異性結(jié)合抗原的能力的一個(gè)或多個(gè)片段。已經(jīng)表明，抗體的抗原結(jié)合功能可通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)現(xiàn)。屬于抗體的“抗原結(jié)合部分”所涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH結(jié)構(gòu)域組成的一價(jià)片段；(ii)F(ab' ) 2片段，包含通過(guò)鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CH結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546) ； (vi)獨(dú)立的互補(bǔ)性決定區(qū)(O)R),和(vii)可任選地通過(guò)合成接頭連接的兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立的CDR的組合。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但它們可使用重組方法通過(guò)合成接頭連接在一起，所述接頭使它們成為單個(gè)蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成一價(jià)分子(稱(chēng)為單鏈Fv(SCFv)，參閱如Bird等(1988)Science242:423-426 和 Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體還旨在包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”中。另一實(shí)例為包含以下部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白:(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，(ii)與該鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽可以是重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白在US2003 / 0118592和US2003 / 0133939中有進(jìn)一步描述。這些抗體片段使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并以與完整抗體相同的方式篩選所述片段。
[0246]術(shù)語(yǔ)“表位”指能夠與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇，其中術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”在本文中優(yōu)選指特異性結(jié)合。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)(如氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，并通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。構(gòu)象表位與非構(gòu)象表位的區(qū)別在于在變性劑存在下前者喪失結(jié)合，而后者則不然。
[0247]本文使用的術(shù)語(yǔ)“不連續(xù)表位”指蛋白質(zhì)抗原上由蛋白質(zhì)一級(jí)序列中至少兩個(gè)分開(kāi)區(qū)域組成的構(gòu)象表位。 [0248]術(shù)語(yǔ)“雙特異性分子”旨在包括具有兩種不同結(jié)合特異性的任何試劑，如蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物。例如，該分子可與(a)細(xì)胞表面抗原，和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fe受體結(jié)合或相互作用。術(shù)語(yǔ)“多特異性分子”或“異種特異性分子”旨在包括具有多于兩種不同結(jié)合特異性的任何試劑，如蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物。例如，例如，該分子可與(a)細(xì)胞表面抗原，(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fe受體，和(C)至少一種其他組分結(jié)合或相互作用。因此，本發(fā)明包括但不僅限于針對(duì)CLD18并針對(duì)其他靶標(biāo)(如效應(yīng)細(xì)胞上的Fe受體)的雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子。術(shù)語(yǔ)“雙特異性抗體”還包括雙抗體。雙抗體是二價(jià)雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單個(gè)多肽鏈上表達(dá)，但使用的接頭太短，以至于不允許同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參閱如Holliger, P.,等(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ；Poljak, R.J.，等(1994)Structure〗:1121-1123)。
[0249]本發(fā)明還包括本文所述抗體的衍生物。術(shù)語(yǔ)“抗體衍生物”指抗體的任何修飾形式，例如抗體與另一試劑或抗體的綴合物。在如下情況下本文中使用抗體“來(lái)自”特定生殖系序列:即如果抗體通過(guò)免疫動(dòng)物或通過(guò)篩選免疫球蛋白基因文庫(kù)而得自一系統(tǒng)，并且其中所選抗體的氨基酸序列與該生殖系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列具有至少90%、更優(yōu)選至少95 %、甚至更優(yōu)選至少96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。通常，來(lái)自特定生殖系序列的抗體將與該生殖系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列顯示不多于10個(gè)氨基酸差異，更優(yōu)選不多于5個(gè)氨基酸差異，或者甚至更優(yōu)選不多于4、3、2或I個(gè)氨基酸差異。
[0250]本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源抗體”指連接在一起的兩個(gè)或更多個(gè)抗體、其衍生物或抗原結(jié)合區(qū)，其中至少兩個(gè)具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對(duì)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fe受體的結(jié)合特異性以及對(duì)靶細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)上的抗原或表位的結(jié)合特異性。
[0251]本文所述的抗體可以是人抗體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”旨在包括具有來(lái)自人生殖系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包含不是由人生殖系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)體外隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變或通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。
[0252]本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指單分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體顯示對(duì)特定表位的單結(jié)合特異性和親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體通過(guò)雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包括與永生化細(xì)胞融合的得自非人動(dòng)物(例如小鼠)的B細(xì)胞。
[0253]本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組抗體”包括通過(guò)重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有抗體，例如(a)從免疫球蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(如小鼠)或由其制備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞(如轉(zhuǎn)染瘤)中分離的抗體，(C)從重組的組合抗體文庫(kù)中分離的抗體，和(d)通過(guò)涉及將免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。
[0254]本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染瘤”包括表達(dá)抗體的重組真核宿主細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、NS / O細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌(包括酵母細(xì)胞)。
[0255]本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源抗體”就產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行定義。該術(shù)語(yǔ)指這樣的抗體，其氨基酸序列或編碼核酸序列對(duì)應(yīng)于不包括該轉(zhuǎn)基因生物的生物，并且通常來(lái)自與該轉(zhuǎn)基因生物不同的物種。
[0256]本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源雜合抗體(heterohybrid antibody) ”指具有生物來(lái)源不同的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與小鼠輕鏈連接的人重鏈的抗體是異源雜合抗體。
[0257]本文所述抗體優(yōu)選是分離的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的抗體”旨在指基本不含抗原特異性不同之其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合CLD18的分離抗體基本不含特異性結(jié)合除CLD18以外抗原的抗體)。然而，與人CLD18的表位、同工型或變體特異性結(jié)合的分離的抗體可與其他相關(guān)抗原(如來(lái)自其他物種的抗原，如CLD18種間同源物)具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，“分離的”單克隆抗體的組合指具有不同特異性并組合在明確定義的組合物中的抗體。
[0258]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”優(yōu)選指“特異性結(jié)合”。本文使用的術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指與預(yù)定抗原結(jié)合的抗體。通常，抗體結(jié)合的親和力對(duì)應(yīng)于約IX 10_7M或更小的KD，并且與預(yù)定抗原結(jié)合的親和力所對(duì)應(yīng)的Kd比其結(jié)合除該預(yù)定抗原以外的非特異性抗原(如BSA、酪蛋白)或密切相關(guān)抗原的親和力 低至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0259]本文使用的術(shù)語(yǔ)“KD” (M)旨在指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。
[0260]本文使用的術(shù)語(yǔ)“同種型”(isotype)指重鏈恒定區(qū)基因所編碼的抗體類(lèi)別(如IgM 或 IgGl)。
[0261]本文使用的術(shù)語(yǔ)“同種型轉(zhuǎn)換”(isotype switching)指抗體的類(lèi)別或同種型由一個(gè)Ig類(lèi)別變成另一 Ig類(lèi)別的現(xiàn)象。
[0262]應(yīng)用于某對(duì)象時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“天然存在的”指該對(duì)象可見(jiàn)于自然界這一事實(shí)。例如，存在于可從自然界來(lái)源分離的生物(包括病毒)中，并且在實(shí)驗(yàn)室中未有意進(jìn)行人工修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0263]本文使用的術(shù)語(yǔ)“重排”指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中V區(qū)段在編碼基本完整VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中分別位于緊鄰D-J或J區(qū)段的位置。重排的免疫球蛋白(抗體)基因座可通過(guò)與生殖系DNA的比較來(lái)鑒定，重排的基因座將具有至少一個(gè)重組的七聚體/九聚體同源性元件。
[0264]涉及V區(qū)段時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“未重排的”或“生殖系構(gòu)型”指V區(qū)段未重組為與D或J區(qū)段緊鄰的構(gòu)象。
[0265]本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。
[0266]本發(fā)明所述的核酸優(yōu)選是分離的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“分離的核酸”指該核酸是(i)在體外擴(kuò)增的，例如通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，(ii)通過(guò)克隆重組產(chǎn)生的，(iii)純化的，例如通過(guò)酶切和凝膠電泳分級(jí)分離，或者(iv)合成的，例如通過(guò)化學(xué)合成。分離的核酸是可通過(guò)重組DNA技術(shù)操作的核酸。[0267]根據(jù)本發(fā)明，核酸單獨(dú)存在或與其他核酸組合存在，所述其他核酸可以是同源或異源的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸與表達(dá)控制序列功能性連接，所述表達(dá)控制序列對(duì)于所述核酸可以是同源或異源的。術(shù)語(yǔ)“同源”指還天然地與表達(dá)控制序列功能性連接的核酸，術(shù)語(yǔ)“異源”指核酸不是天然地與該表達(dá)控制序列功能性連接。
[0268]如果表達(dá)RNA和/或蛋白質(zhì)或肽的核酸與表達(dá)控制序列以所述核酸的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄處在所述表達(dá)控制序列的控制或影響之下的方式彼此共價(jià)連接，則它們彼此“功能性”連接。如果該核酸待翻譯成功能性蛋白質(zhì)，而其帶有與編碼序列功能性連接的表達(dá)控制序列，所述表達(dá)控制序列的誘導(dǎo)引起所述核酸的轉(zhuǎn)錄，而不導(dǎo)致編碼序列中的移碼或?qū)е滤鲂蛄胁荒芊g成所需蛋白質(zhì)或肽。
[0269]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制序列”包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子和調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯的其他控制元件。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)控制序列可受到調(diào)節(jié)。表達(dá)控制序列的確切結(jié)構(gòu)可根據(jù)物種或細(xì)胞類(lèi)型的功能而變化，但通常包含分別參與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5'非轉(zhuǎn)錄序列和5'及3'非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具體地，5'非轉(zhuǎn)錄表達(dá)控制序列包含啟動(dòng)子區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)包含用于轉(zhuǎn)錄控制功能性連接核酸的啟動(dòng)子序列。表達(dá)控制序列還可包括增強(qiáng)子序列或上游活化子序列。
[0270]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)”指這樣的核酸序列:其位于所表達(dá)核酸序列的上游(5')，并通過(guò)提供RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)來(lái)控制該序列的表達(dá)。“啟動(dòng)子區(qū)”可包括用于參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的其他因子的其他識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子可控制原核或真核基因的轉(zhuǎn)錄。此外，啟動(dòng)子可以為“誘導(dǎo)型”，可應(yīng)答于誘導(dǎo)物而起始轉(zhuǎn)錄，或者如果轉(zhuǎn)錄不受誘導(dǎo)物的控制則可以為“組成型”。如果誘導(dǎo)劑不存在，則誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的基因不表達(dá)，或表達(dá)程度很低。存在誘導(dǎo)物時(shí)，該基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，或者轉(zhuǎn)錄水平提高。一般而言，這通過(guò)特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)。
[0271]本發(fā)明優(yōu)選的啟動(dòng)子包括用于SP6、T3和T7聚合酶的啟動(dòng)子、人U6RNA啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子及其人工雜合啟動(dòng)子(如CMV)，其中啟動(dòng)子的某部分與其他細(xì)胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因啟動(dòng)子的某部分融合，并包含或不包含額外的內(nèi)含子。
[0272]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”以其最普遍的含義使用，包括產(chǎn)生RNA或者RNA和蛋白質(zhì)/肽。還包括核酸的部分表達(dá)。此外，表達(dá)可瞬時(shí)進(jìn)行或穩(wěn)定進(jìn)行。
[0273]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子存在于載體中，適當(dāng)時(shí)還帶有控制該核酸表達(dá)的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“載體”在本文中以其最普遍的意義使用，包括用于核酸的任何中間載體，所述載體使得所述核酸能夠例如引入原核和/或真核細(xì)胞中，并且適當(dāng)時(shí)整合進(jìn)基因組。這類(lèi)載體優(yōu)選在該細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體或病毒基因組。本文使用的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！?一般指能獨(dú)立于染色體DNA進(jìn)行復(fù)制的染色體外遺傳物質(zhì)的構(gòu)建體，通常為環(huán)狀DNA雙鏈體。 [0274]就用于表達(dá)抗體的載體而言，抗體重鏈及輕鏈存在于不同載體中的載體類(lèi)型和重鏈及輕鏈存在于同一載體中的載體類(lèi)型均可使用。
[0275]本文就特定核酸和氨基酸序列(如序列表中所示)而言提供的教導(dǎo)應(yīng)理解為還涉及對(duì)所述特定序列的修飾，所述修飾產(chǎn)生與所述特定序列功能等價(jià)的序列，例如顯示與該特定氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列，以及編碼顯示與該特定核酸序列所編碼氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列的核酸序列。一個(gè)重要的特性是保留抗體與其靶標(biāo)的結(jié)合，或者維持抗體的效應(yīng)子功能。優(yōu)選地，就特定序列而言進(jìn)行了修飾的序列在替換抗體中的該特定序列時(shí)保留所述抗體與CLD18的結(jié)合，并優(yōu)選保留所述抗體如本文所述的功能，例如CDC介導(dǎo)的裂解作用或ADCC介導(dǎo)的裂解作用。
[0276]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，特別是可以修飾CDR、高變區(qū)和可變區(qū)的序列而不喪失結(jié)合CLD18的能力。例如，CDR區(qū)可以與本文所述的抗體區(qū)域相同或高度同源。“高度同源”認(rèn)為是可以在⑶R中產(chǎn)生I至5、優(yōu)選I至4例如I至3或I或2個(gè)替換。此外，高變區(qū)和可變區(qū)可被修飾，從而與本文具體公開(kāi)的抗體區(qū)域顯示顯著的同源性。
[0277]應(yīng)該理解，本文所述的特定核酸還包括為了優(yōu)化特定宿主細(xì)胞或生物中的密碼子使用而進(jìn)行了修飾的核酸。生物之間密碼子使用的差異可引起多種關(guān)于異源基因表達(dá)的問(wèn)題。通過(guò)改變?cè)夹蛄兄械囊粋€(gè)或多個(gè)核苷酸而進(jìn)行密碼子優(yōu)化可在待表達(dá)所述核酸的同源或異源宿主中引起核酸表達(dá)的優(yōu)化，特別是翻譯效率的優(yōu)化。例如，如果根據(jù)本發(fā)明需使用來(lái)自人并編碼抗體恒定區(qū)和/或構(gòu)架區(qū)的核酸，例如用于制備嵌合或人源化抗體，則為了優(yōu)化密碼子使用而修飾所述核酸可能是優(yōu)選的，特別是在如果所述核酸(任選地與異源核酸如來(lái)自本文所述其他生物的核酸融合)需在不同于人的生物(如小鼠或倉(cāng)鼠)細(xì)胞中表達(dá)的情況下。例如，分別編碼人輕鏈和重鏈恒定區(qū)的核酸序列(如SEQ ID N0:40和45的序列)可經(jīng)修飾，以包含一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選至少1、2、3、4、5、10、15、20個(gè)并優(yōu)選多達(dá)10、
15、20、25、30、50、70或100個(gè)或更多核苷酸替換，所述替換引起密碼子使用的優(yōu)化，但不引起氨基酸序列的改變。這樣的核苷酸替換優(yōu)選指分別將SEQ ID NO:40和45中的核苷酸替換為不引起所編碼氨基酸序列改變的經(jīng)修飾的對(duì)應(yīng)物，所述核苷酸替換分別選自下文SEQID NO:40和45之比對(duì)中所示的替換；或者指分別編碼人輕鏈和重鏈恒定區(qū)的其他核酸序列中相應(yīng)位置的相應(yīng)替換。優(yōu)選地，在編碼人輕鏈和重鏈恒定區(qū)的核酸序列中分別實(shí)現(xiàn)下文SEQ ID NO:40和45的比對(duì)中所示的全部替換，所述替換使用不引起所編碼氨基酸序列改變的經(jīng)修飾對(duì)應(yīng)物。
[0278]SEQ ID NO:40 與 SEQ ID NO:147 的比對(duì):`[0279]
【權(quán)利要求】
1.能夠結(jié)合CLD18并介導(dǎo)殺傷表達(dá)CLD18的細(xì)胞和/或抑制其增殖的抗體。
2.權(quán)利要求1的抗體，其結(jié)合CLD18A1和CLD18A2。
3.權(quán)利要求1的抗體，其結(jié)合CLD18A2但不結(jié)合CLD18A1。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體，其中所述對(duì)細(xì)胞的殺傷和/或抑制其增殖是通過(guò)所述抗體與所述細(xì)胞表達(dá)之CLD18的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)的。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的抗體，其中所述對(duì)細(xì)胞的殺傷和/或抑制其增殖是通過(guò)所述抗體與所述細(xì)胞表達(dá)之CLD18A2的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)的。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的抗體，其中所述對(duì)細(xì)胞的殺傷和/或抑制其增殖不是通過(guò)所述抗體與所述細(xì)胞表達(dá)之CLD18A1的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)的。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體，其中所述表達(dá)CLD18的細(xì)胞為癌細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述癌細(xì)胞選自致瘤性的胃癌、食管癌、胰腺癌和肺癌細(xì)胞。
9.權(quán)利要 求1-8中任一項(xiàng)的抗體，其通過(guò)誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)介導(dǎo)的裂解、抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)介導(dǎo)的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用來(lái)介導(dǎo)所述對(duì)細(xì)胞的殺傷。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體，其通過(guò)誘導(dǎo)⑶C介導(dǎo)的裂解和/或ADCC介導(dǎo)的裂解來(lái)介導(dǎo)所述對(duì)細(xì)胞的殺傷。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的抗體，其不誘導(dǎo)所述細(xì)胞的CDC介導(dǎo)的裂解。
12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的抗體，其中所述ADCC介導(dǎo)的裂解在效應(yīng)細(xì)胞存在下發(fā)生，所述效應(yīng)細(xì)胞選自單核細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、NK細(xì)胞和PMN。
13.權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)的抗體，其中所述吞噬作用通過(guò)巨噬細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的抗體，其為單克隆抗體、嵌合或人源化抗體或者抗體片段。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的抗體，其選自IgGl、IgG2優(yōu)選IgG2a和IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌性 IgA、IgD 和 IgE 抗體。
16.權(quán)利要求2-15中任一項(xiàng)的抗體，其中CLD18A2具有SEQID NO:2的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求2-16中任一項(xiàng)的抗體，其中CLD18A1具有SEQID NO:8的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗體，其與活細(xì)胞表面上存在的CLD18的天然表位結(jié)合。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的抗體，其對(duì)癌細(xì)胞優(yōu)選胃癌細(xì)胞具有特異性。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的抗體，其中所述CLD18在所述細(xì)胞的表面上表達(dá)。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的抗體，其可通過(guò)包括以下步驟的方法獲得:用包含選自SEQ ID NO:2、4、6、16、18、20-23、26-31、151、153和 155-157 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽或者其免疫原性片段或衍生物、或者表達(dá)所述蛋白質(zhì)或肽或者其免疫原性片段的核酸或宿主細(xì)胞來(lái)免疫動(dòng)物。
22.由以下列登記號(hào)保藏的克隆所產(chǎn)生的抗體:DSMACC2737，DSM ACC2738，DSMACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSMACC2743, DSM ACC2745, DSMACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSMACC2808, DSM ACC2809 或DSM ACC2810。
23.能產(chǎn)生權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的抗體的雜交瘤。
24.以下列登記號(hào)保藏的雜交瘤:DSMACC2737，DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSMACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSMACC2745, DSM ACC2746, DSMACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSMACC2809 或DSM ACC2810。
25.綴合物，其包含與治療劑偶聯(lián)的權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的抗體。
26.權(quán)利要求25的綴合物，其中所述治療劑為毒素、放射性同位素、藥物或細(xì)胞毒劑。
27.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求25或26的綴合物，以及可藥用載體。
28.抑制表達(dá)CLD18的細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括使所述細(xì)胞接觸有效量的權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求25或26的綴合物。
29.殺傷表達(dá)CLD18的細(xì)胞的方法，包括使所述細(xì)胞接觸有效量的權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求25或26的綴合物。
30.抑制表達(dá)CLD18的細(xì)胞轉(zhuǎn)移性散播的方法，包括使所述細(xì)胞接觸有效量的權(quán)利要求I至22中任一項(xiàng)的抗體和/或權(quán)利要求25或26的綴合物。
31.治療或預(yù)防與表達(dá)CLD18的細(xì)胞相關(guān)的疾病或病癥的方法， 包括給對(duì)象施用權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的抗體、權(quán)利要求25或26的綴合物或者權(quán)利要求27的藥物組合物 。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病或病癥為腫瘤相關(guān)疾病。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述腫瘤相關(guān)疾病選自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌及其轉(zhuǎn)移。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述腫瘤相關(guān)疾病是庫(kù)肯勃氏瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和/或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
35.權(quán)利要求28-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述CLD18是CLD18A2。
36.權(quán)利要求28-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述CLD18在所述細(xì)胞的表面表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N5/07GK103694353SQ201310574213
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2007年5月29日
【發(fā)明者】烏爾·沙欣, 厄茲萊姆·圖雷奇, 貢達(dá)·勃蘭登堡, 迪爾克·烏澤納 申請(qǐng)人:加尼梅德藥物公司, 約翰內(nèi)斯·古滕伯格美因茲大學(xué)