Pivka-ii測定方法、測定試劑和測定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了與以往的方法相比,血清/血漿相關性良好的PIVKA-II的測定方法、以及用于該測定的試劑和試劑盒。本發(fā)明的PIVKA-II的測定方法包括:通過使用與凝血酶原片段F1特異性結合的抗F1抗體或其抗原結合性片段、和與凝血酶原片段F2特異性結合的抗F2抗體或其抗原結合性片段的混合物,以及與PIVKA-II特異性結合的抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段的免疫測定,來測定樣品中的PIVKA-II。
【專利說明】PIVKA-I I測定方法、測定試劑和測定試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及與血清/血漿相關性良好的PIVKA-II測定方法、以及PIVKA-II免疫 測定試劑和試劑盒。
【背景技術】
[0002] PIVKA-II (維生素 K 缺乏誘導的蛋白-II (Protein induced by vitamin K absence-II))是與血液凝固相關的、具有與凝血酶原類似結構的糖蛋白。凝血酶原是622 個殘基的蛋白質,位于N末端附近的10個谷氨酸(Glu)殘基受到γ-羧基化,形成γ-羧 基谷氨酸(Gla)殘基。已知該凝血酶原在生物體內產生時,由于維生素 K的缺乏,肝功能衰 竭、維生素 K拮抗劑的給予、肝細胞損傷等,γ -羧基化不完全,10個殘基中的全部或一部分 形成Glu殘基的糖蛋白出現在血液中。該蛋白質是被稱作異常凝血酶原的PIVKA-II。近年 來,有報道稱在肝細胞癌患者血漿中高濃度檢出PIVKA-II,作為肝細胞癌的標志被用于診 斷的監(jiān)測物。
[0003] 作為特異性檢出樣品中PIVKA-II的方法,有人報道了使用特異性識別PIVKA-II 的單克隆抗體和抗凝血酶原的多克隆抗體兩者,以其中一方作為固定抗體,以另一方作為 標記抗體進行測定的免疫測定法(專利文獻1)。
[0004] 在測定來自血液的樣品中的被檢物質時,主要使用血清或血漿。根據被檢物質的 性質或測定系統(tǒng)等,在由同一受試者得到的血清/血漿樣品對中,血清樣品和血漿樣品中 的被檢物質的測定值不同,即血清/血漿相關性低,只能測定血清和血漿樣品中的一方。這 在同時測定兩種被檢物質時特別成為問題。例如,在同時測定兩種被檢物質時,一種被檢物 質只能用血清測定時,如果另一種被檢物質也可以用血清測定,則由患者采集的樣品可以 只是血清樣品。但是,如果另一方的被檢物質只能用血漿樣品測定時,則必須由患者采集血 清和血漿兩種樣品,樣品的取得或處理麻煩,并且也增加了患者的負擔。因此,人們希望可 以建立血清/血漿相關性高的測定系統(tǒng)。
[0005] 在采用ELISA法的PIVKA-II測定中,在以特異性識別PIVKA-II的單克隆抗體作 為固相抗體、以抗凝血酶原的多克隆抗體作為二次抗體使用時,已知,與凝血酶顯示反應性 的抗體包含在二次抗體中,因此,血清樣品對測定系統(tǒng)產生不良影響,無法獲得穩(wěn)定的測定 值(專利文獻2)。專利文獻2中報道,為了解決該問題,是使用不與人凝血酶反應、而與人凝 血酶原特異性反應的抗體作為二次抗體,由此,即使是血清樣品也可以穩(wěn)定測定PIVKA-II。 但是,專利文獻2所述的方法中,為了從抗人凝血酶原的多克隆抗體中除去抗凝血酶的抗 體,必須使用人凝血酶原親和柱,在取得與凝血酶原反應的抗體后進行透析,再進一步使用 人凝血酶親和柱,取得不與凝血酶反應的抗體,進行透析,抗體的純化工序非常麻煩。另外, 專利文獻2的方法中,雖然血清/血漿相關性得到改善,但人們希望進一步的改善。并且, 多克隆抗體因批次不同而出現偏差,因此為了嚴格確保特異性,與多克隆抗體相比,人們通 常希望采用單克隆抗體。專利文獻2中雖然記載,在采用ELISA法的PIVKA-II測定法中, 使用不與人凝血酶反應、而與人凝血酶原特異性反應的單克隆抗體,但是,對于使用這樣的 單克隆抗體時它們對血清/血漿相關性的影響或問題則未有任何記載。
[0006] 專利文獻3中記載了,使用特異性識別PIVKA-II的單克隆抗體和抗凝血酶原的單 克隆抗體兩者,以其中一方作為固定抗體、另一方作為標記抗體進行測定的免疫測定法。還 記載了,將PIVKA-II特異性單克隆抗體混合使用。但是專利文獻3中仍然完全未記載免疫 測定系統(tǒng)中血清/血漿相關性的問題,專利文獻3所述的方法對于血清/血漿相關性有何 影響是不清楚的。
[0007] 現有技術文獻 專利文獻 專利文獻1 :日本特開昭60-60557號公報 專利文獻2 :日本特開平5-249108號公報 專利文獻3 :日本特開平9-43237號公報。
【發(fā)明內容】
[0008] 發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明的目的在于提供:與以往的方法相比,血清/血漿相關性良好的PIVKA-II的測 定方案。
[0009] 解決問題的方案 本發(fā)明人對于PIVKA-II的測定進行了深入的研宄,結果發(fā)現:通過使用將與人凝血酶 原片段1特異性結合的抗體、和與人凝血酶原片段2特異性結合的抗體的混合而成的混合 抗體作為免疫測定中的抗體,與以往的方法相比,血清/血漿相關性大幅改善,從而完成了 本發(fā)明。
[0010] S卩,本發(fā)明提供PIVKA-II的測定方法,該測定方法包括:通過使用與凝血酶原片 段Fl特異性結合的抗Fl抗體或其抗原結合性片段、和與凝血酶原片段F2特異性結合的 抗F2抗體或其抗原結合性片段的混合物,以及與PIVKA-II特異性結合的抗PIVKA-II抗 體或其抗原結合性片段的免疫測定,來測定樣品中的PIVKA-II。本發(fā)明還提供樣品中的 PIVKA-II的免疫測定試劑,該免疫測定試劑包含:與PIVKA-II特異性結合的抗PIVKA-II 抗體或其抗原結合性片段、與凝血酶原片段Fl特異性結合的抗Fl抗體或其抗原結合性片 段、和與凝血酶原片段F2特異性結合的抗F2抗體或其抗原結合性片段。本發(fā)明進一步提 供樣品中的PIVKA-II的免疫測定試劑盒,該試劑盒包括所述本發(fā)明的免疫測定試劑。
[0011] 發(fā)明效果 根據本發(fā)明,可提供血清/血漿相關性良好的PIVKA-II的測定方法、以及用于該測定 的試劑和試劑盒。本發(fā)明的方法與以往的方法相比,血清/血漿相關性進一步得到大幅改 善,作為PIVKA-II測定方法,其實用性更高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1是表示實施例1中制備的單克隆抗體與全長人凝血酶原(I)、F1區(qū)⑵和F2 區(qū)(3)的反應性的圖表。
【具體實施方式】
[0013] 凝血酶原含有凝血酶原片段I(Fl)區(qū)和凝血酶原片段2(F2)區(qū)和凝血酶區(qū)。 PIVKA-II是因為N末端附近的10個Glu殘基中的γ-羧基化不完全而10個殘基的全部或 一部分未形成Gla、仍為Glu的糖蛋白,PIVKA-II也含有凝血因酶原片段I(Fl)區(qū)和凝血酶 原片段2 (F2)區(qū)和凝血酶區(qū)。
[0014] SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列是PIVKA-II的氨基酸序列,第44號-第198號 氨基酸區(qū)是凝血酶原Fl區(qū),第199號-第314號氨基酸區(qū)是凝血酶原F2區(qū)。含有Fl區(qū) 的一部分的第25號-第88號氨基酸區(qū)被稱作Gla區(qū)。凝血酶原中,SEQ ID NO: 1中的 10個"Xaa"全部形成γ-羧基谷氨酸(Gla)殘基。該凝血酶原序列在GenBank中以登錄 號ΝΡ_000497登記。SEQ ID NO: 2所示的堿基序列是編碼SEQ ID NO: 1的PIVKA-II和 NP_000497的凝血酶原的序列,在GenBank中以登錄號NM_000506登記。SEQ ID NO: 2中 的第44號-第1912號的堿基區(qū)域是編碼區(qū)。
[0015] 本發(fā)明的測定方法中,使用抗Fl抗體和抗F2抗體的混合物、以及與PIVKA-II特 異性結合的抗PIVKA-II抗體進行夾心免疫測定。通過使用抗Fl抗體和抗F2抗體的混合物 作為夾心法中抗體的一方,可以合乎需要地改善PIVKA-II測定值中的血清/血漿相關性。
[0016] 抗Fl抗體是與凝血酶原Fl特異性結合的抗體。即,在PIVKA-II的凝血酶原Fl區(qū) 內具有表位,是識別該表位而與PIVKA-II結合的抗體。例如,只與凝血酶原或PIVKA-II的 Fl區(qū)片段結合、實質上不與F2區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的任意一方結合的抗體就是"與在 Fl區(qū)內具有表位的凝血酶原Fl特異性結合的抗體"。這里所述的"實質上不結合"是指:不 與F2區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的任意一方以可檢測的水平結合(S卩,與F2區(qū)片段以及凝 血酶區(qū)片段的結合為背景噪聲以下),或者即使是以可檢測的水平結合,也僅以本領域技術 人員清楚的程度結合,即與它們結合的程度明顯少于與Fl區(qū)片段的結合,并非與F2區(qū)片段 或凝血酶區(qū)片段結合??笷l抗體可以是可與PIVKA-II的Fl區(qū)、也與凝血酶原的Fl區(qū)結 合的抗體,可以不具有PIVKA-II分子特異性(S卩,不與凝血酶原結合而只與PIVKA-II結合 的結合性)。
[0017] 抗F2抗體是與凝血酶原F2特異性結合的抗體。即,在PIVKA-II的凝血酶原F2 區(qū)內具有表位,是識別該表位而與PIVKA-II結合的抗體。例如,只與凝血酶原或PIVKA-II 的F2區(qū)片段結合、實質上不與Fl區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的任意一方結合的抗體是"與 凝血酶原F2特異性結合的抗體"。這里所述的"實質上不結合"是指:不與Fl區(qū)片段以及 凝血酶區(qū)片段的任意一方以可檢測的水平結合(即,與Fl區(qū)片段以及凝血酶區(qū)片段的結合 為背景噪聲以下),或者即使是以可檢測的水平結合,也僅以本領域技術人員清楚的程度結 合,即與它們結合的程度明顯少于與F2區(qū)片段的結合,并非與Fl區(qū)片段或凝血酶區(qū)片段 結合。F2區(qū)的氨基酸序列在PIVKA-II和凝血酶原中均相同,因此抗F2抗體通常是可以與 PIVKA-II的F2區(qū)、也可以與凝血酶原的F2區(qū)結合的抗體。
[0018] 抗PIVKA-II抗體是只與PIVKA-II結合、實質上不與凝血酶原結合的抗體。
[0019] 抗Fl抗體、抗F2抗體和抗PIVKA-II抗體各自可以是單克隆抗體,也可以是多克 隆抗體。從免疫測定的再現性等角度考慮,可優(yōu)選使用單克隆抗體。另外,這些抗體也可以 以保持與對應抗原的結合性的抗體片段(抗原結合性片段)的形式使用。
[0020] 多克隆抗體、單克隆抗體和抗原結合性片段的制備方法本身是周知的常規(guī)方法, 抗Fl抗體、抗F2抗體、抗PIVKA-II抗體以及它們的抗原結合性片段可按照常規(guī)方法制備。 另外,這些抗體也存在市售商品,因此也可以使用市售的抗體。
[0021] 抗Fl多克隆抗體例如可如下獲得:將Fl多肽或其部分片段與適當的佐劑一起免 疫動物(人除外),由從該動物采集的血液獲得抗血清,純化該抗血清中的多克隆抗體。為 了使被免疫動物中抗體效價升高,免疫通常需要花費數周進行多次??寡逯械目贵w的純 化例如可通過用硫酸銨沉淀或采用陰離子色譜的分離、親和柱純化等進行??笷2多克隆抗 體也可以以F2多肽或其部分片段作為免疫原類似地制備。
[0022] 抗Fl單克隆抗體例如可通過周知的雜交瘤法制備。具體來說,可將Fl多肽(Fl 區(qū)片段)、凝血酶原、PIVKA-II或它們的部分片段與適當的佐劑一起免疫動物(人除外), 從該動物采集脾細胞或淋巴細胞等的抗體生成細胞,將其與骨髓瘤細胞融合,制備雜交瘤, 選擇生產與Fl多肽結合的抗體的雜交瘤,使其增殖,從培養(yǎng)上清中獲得抗Fl單克隆抗體。 抗F2單克隆抗體也同樣,以F2多肽、凝血酶原、PIVKA-II或其部分片段作為免疫原,通過 選擇生產與F2多肽結合的抗體的雜交瘤來制備。
[0023] 關于抗PIVKA-II抗體,多克隆抗體可使用羧基化不完全的Gla區(qū)部分片段作為免 疫原來制備,但本發(fā)明中,必須對PIVKA-II具有足夠的特異性,因此通常使用單克隆抗體。 對于PIVKA-II單克隆抗體,可使用PIVKA-II或其部分片段(含有受到羧基化的Gla區(qū)的 10個殘基中的至少一部分的部分片段)作為免疫原制備雜交瘤,然后選擇生產與PIVKA-II 結合而不與凝血酶原結合的抗體的雜交瘤,回收抗體??筆IVKA-II抗體的制備方法的具體 例子可舉出日本特開昭60-60557號公報、日本特開平9-249699號公報所述的方法。
[0024] "抗原性結合性片段"只要可保持原本抗體與對應抗原的結合性(抗原抗體反應 性)即可,可以是任何抗體片段。具體例子可舉出:? &13、?(&13')2、8(^ ¥等,但并不限于此。 眾所周知,Fab或F(ab')2可通過將單克隆抗體用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等的蛋白質分解 酶處理來獲得。scFv(單鏈可變區(qū)片段,單鏈抗體)的制備方法也是周知的,例如可提取如 上所述制備的雜交瘤的mRNA,制備單鏈cDNA,使用對免疫球蛋白H鏈和L鏈為特異性的引 物進行PCR,使免疫球蛋白H鏈基因和L鏈基因擴增,將它們用接頭連接,使其具有適當的限 制酶切位點,導入質粒載體中,用該載體轉化大腸桿菌,使scFv表達,將其從大腸桿菌中回 收,由此獲得scFv。
[0025] 作為免疫原使用的多肽或其部分片段可通過化學合成、遺傳工程學方法等常規(guī)方 法制備。或者可從新鮮人血漿等中提取凝血酶原或PIVKA-II并純化獲得(參照Thromb. Diath. Haemorph. I%6; I6:469_9〇 等)〇
[0026] 化學合成法的具體例子例如可舉出:Fmoc法(荷甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧 基羰基法)等。還可以利用各種市售的肽合成儀,通過常規(guī)方法合成?;瘜W合成時,可以只 根據氨基酸序列合成所需的多肽。
[0027] 通過遺傳工程學方法制備多肽的方法也是周知的。具體來說,例如可通過以下 所述的方法制備。首先,由來自人的培養(yǎng)細胞等中提取RNA,通過反轉錄反應由mRNA合成 cDNA。以該cDNA為模板,使用根據人凝血酶原的mRNA序列信息設計的引物進行PCR,制備 編碼凝血酶原全長或所需一部分(Fl區(qū)或F2區(qū)等)的多核苷酸。PCR中使用的引物可以根 據SEQ ID NO: 2所示的堿基序列或登記于GenBank等數據庫中的人凝血酶原序列信息等 適當設計?;蛘撸幋a所需多肽的多核苷酸可通過使用市售的核酸合成儀的常規(guī)方法制備。 編碼各氨基酸的密碼子是公知的,因此只要特定氨基酸序列,編碼該氨基酸序列的多核苷 酸的堿基序列也可確定。接著,將制備的多核苷酸摻入適當的載體,通過適當的表達系統(tǒng)使 多肽表達,回收該多肽,由此可獲得所需的多肽。所使用的載體或各種表達系統(tǒng)(細菌表達 系統(tǒng)、酵母細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、無細胞表達系統(tǒng)等) 也是周知的,各種載體或宿主細胞、試劑類、試劑盒均有市售,因此,本領域技術人員可適當 選擇使用。來自人的培養(yǎng)細胞也有市售/分開出售,容易獲得。
[0028] 抗Fl抗體與抗F2抗體的混合比例只要是在PIVKA-II測定值中可得到良好的 血清/血漿相關性的范圍即可,沒有特別限定,以抗Fl抗體:抗F2抗體=1:0. 2-2、優(yōu)選 1:0. 3-1. 5、更優(yōu)選1:0. 5-1. 0的混合比例,尤其可獲得良好的血清/血漿相關性。如后述 實施例所示,在只使用抗F2抗體時,血漿樣品的PIVKA-II測定值比血清樣品的測定值高, 未能得到良好的血清/血漿相關性。只使用抗Fl抗體時,血清樣品的PIVKA-II測定值比 血漿樣品的測定值高,未能得到良好的血清/血漿相關性。而通過將抗Fl抗體和抗F2抗 體混合使用,可以改善血清/血漿相關性。
[0029] 夾心免疫測定本身是周知的常規(guī)方法。作為具體例子,可舉出化學發(fā)光酶免疫測 定法(CLEIA)、酶聯免疫吸附法(ELISA)、放射免疫測定、電化學發(fā)光免疫測定法等各種方 法,本發(fā)明中可以采用任意方法。
[0030] 夾心測定系統(tǒng)中,通常使用2種抗體中的一方作為固定于固相上的固相抗體,使 用另一方作為標記抗體。本發(fā)明中,使用抗Fl抗體/抗F2抗體混合物作為1種抗體,使用 抗PIVKA-II抗體作為另1種抗體,但是,可以使用任意一種作為固相抗體。下述實施例中, 使用抗PIVKA-II抗體作為固相抗體,使用抗體混合物作為標記抗體,但并不限于此。
[0031] 以使用抗Fl抗體/抗F2抗體混合物作為標記抗體的情形為例,具體說明本發(fā)明 的PIVKA-II測定方法。首先,將PIVKA-II抗體(固相抗體)固定于載體上。使固定的 PIVKA-II抗體與樣品中所含的PIVKA-II接觸,由此使固相抗體與PIVKA-II特異性結合。 接著,用適當的緩沖液洗滌除去未結合的樣品中成分,例如載體,然后使用標記物標記的抗 Fl抗體/抗F2抗體混合物(S卩,標記抗Fl抗體和標記抗F2抗體的混合物)與結合于固相 抗體上的PIVKA-II結合。反應結束后,為了除去未反應的成分,例如用適當的緩沖液洗滌 載體后,用適當的方法檢測來自標記物的信號,由此可測定樣品中所含的PIVKA-II。
[0032] 固相沒有特別限定,可以與在公知的夾心免疫測定系統(tǒng)中使用的固相相同。固相 的材質的具體例子可舉出:聚苯乙烯、聚乙烯、瓊脂糖等,但并不限于這些。固相的物理形狀 本質上并不重要。所使用的固相優(yōu)選為抗體與其表面的固定容易且可容易地將測定中形成 的免疫復合物與未反應的成分分離的材料。特別優(yōu)選在常規(guī)免疫測定法中使用的塑料板或 磁性粒子。從操作、保存和分離的容易性等考慮,最優(yōu)選使用如上所述材質的磁性粒子???體與這些固相的結合可通過本領域周知的常規(guī)方法進行。
[0033] 標記物也沒有特別限定,可以使用與在公知的免疫測定系統(tǒng)中使用的標記物同樣 的物質。具體例子可舉出:酶、熒光物質、化學發(fā)光物質、染色物質、放射性物質等。酶可以 使用堿性磷酸酶(ALP)、過氧化物酶、β半乳糖苷酶等公知的酶,但并不限于這些。為了提 供高檢測靈敏度的測定系統(tǒng),優(yōu)選使用ALP。
[0034] 使用酶作為標記物時,通過使與該酶對應的顯色底物、熒光底物或發(fā)光底物等底 物與該酶反應并測定由此產生的信號,可求出酶活性對測定對象物進行測定。例如,使用 ALP作為標記物時,可以使用3-(4-甲氧基螺(1,2-二氧環(huán)乙烷-3, 2'-三環(huán)[3. 3. 1. 13, 7] 癸烷)-4-基)苯基磷酸二鈉(例如商品名AMPPD)等的發(fā)光底物。
[0035] 使用生物素或半抗原作為標記物時,可以使用結合了酶、熒光物質、化學發(fā)光物 質、染色物質或放射性物質等的鏈霉抗生物素或半抗原抗體等測定。
[0036] 信號的檢測可根據標記物的種類適當選擇。例如信號如果是顯色,則可以使用 比色計或吸光光度計,如果是熒光則可以使用熒光光度計,如果是發(fā)光則可以使用光子計 數儀,如果是放射線則可以使用放射線測定裝置。對于以各種濃度含有PIVKA-II的濃度 已知的標準樣品,按照本發(fā)明的方法測定PIVKA-II,由來自標記的信號量和標準樣品中 PIVKA-II的濃度的相關關系制圖,制成校正曲線,對PIVKA-II濃度未知的樣品同樣進行測 定操作,測定來自標記的信號量,將測定值代入該校正曲線,由此可對樣品中PIVKA-II進 行定量。
[0037] 本發(fā)明的方法所適用的樣品是從受試者分離的樣品,優(yōu)選血液樣品,特別優(yōu)選 血漿或血清。根據本發(fā)明的測定方法,不管是血漿樣品還是血清樣品,均可穩(wěn)定地測定 PIVKA-II。樣品可根據需要適當稀釋后使用。
[0038] 本發(fā)明還提供樣品中的PIVKA-II的免疫測定試劑,該試劑含有:抗PIVKA-II抗體 或其抗原結合性片段(抗PIVKA-II抗體等)、抗Fl抗體或其抗原結合性片段(抗Fl抗體 等)、和抗F2抗體或其抗原結合性片段(抗F2抗體等)。該免疫測定試劑中,抗Fl抗體等 和抗F2抗體等可分別封裝入容器,或者預先混合后封裝入容器。還可以進一步含有對這些 抗體或其抗原結合性片段的穩(wěn)定等有用的其它成分。這些抗體或其抗原結合性片段可以是 用標記物標記的形態(tài),或固定在板、粒子等固相上的形態(tài)。
[0039] 上述免疫測定試劑可以與其它試劑類等適當組合,作為樣品中的PIVKA-II的免 疫測定試劑盒提供。免疫測定所必需的其它試劑類是周知的。例如,除上述免疫測定試劑 之外,本發(fā)明的試劑盒中還可以進一步含有樣品稀釋液、洗滌液、以及標記抗體中使用的標 記物為酶時的該酶的底物液等。 實施例
[0040] 以下通過實施例具體說明本發(fā)明。當然本發(fā)明并不受這些實施例等的限定。
[0041] 實施例1.標記抗體的制備 (A)雜交瘤的制備 將純化凝血酶原(按照 Shapiro S.等人·,The purification of human prothrombin. Thromb. Diath. Haemorph. 1966; 16:469-90 所述的方法從新鮮人血衆(zhòng)中純 化而得)在含有〇· 15M NaCl的IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7· 3)中稀釋,終濃度為0· 2-1. 0mg/mL, 與等量的弗氏完全佐劑混合,制成油包水型乳液。將該乳液腹腔內給予7周齡的BALB/c系 小鼠,之后將氟完全佐劑變更為弗氏不完全佐劑,每2周進行同樣的免疫,進行2到3次。進 而在約2周后腹腔內給予100 μ L溶解于生理鹽水的0. 2-1. 0mg/mL純化凝血酶原(最終追 加免疫)。
[0042] 最終追加免疫后第3天,由該免疫動物無菌摘除脾臟,用剪刀剪成碎片,進一步使 用篩網將脾臟拆解成單個細胞,用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次,計測細胞數。與上述同樣地 洗滌對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8-Ul,然后調節(jié)為所計測的脾細胞數的1至 1/10的細胞數,加入到50ml容量的離心管中混合。以200X g、5分鐘進行離心,除去上清, 加入ImL聚乙二醇(PEG) 1500 ( y少夕制造)進行細胞融合。然后加入15mL RPMI-1640培 養(yǎng)基,進行聚乙二醇的稀釋。
[0043] 對于融合細胞,通過離心(200 X g,5分鐘)除去PEG,然后使用96孔板在含有10% 胎牛血清、次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)約10天,只使雜交 瘤增殖。然后取部分培養(yǎng)上清,通過將純化凝血酶原用作固相抗原的ELISA法,篩選各個生 產凝血酶原抗體的孔,得到多個生產對凝血酶原具有反應性的單克隆抗體的雜交瘤。對于 所得雜交瘤,按照常規(guī)的極限稀釋法進行單克隆。
[0044] (B)單克隆抗體的制備 將按照(A)所述的方法得到的雜交瘤移植到預先腹腔內給予了 0.5mL降植烷的小鼠腹 腔內,每只移植約IXlO7個,取得在腹水中產生的單克隆抗體。該單克隆抗體的純化是通 過利用結合了 A蛋白的瓊脂糖柱(才7 7卜''制造)分離IgG流分來進行。
[0045] 接著,分別將凝血酶原多肽、Fl多肽和F2多肽分別固定在微量滴定板上,分別 對于得到的單克隆抗體研宄其對各多肽的反應性。即,將全長凝血酶原(Termo)、凝血 酶原-片段 I (Haematologic Technologies Inc.)、凝血酶原-片段 2 (Haematologic Technologies Inc.)分別用0. IM磷酸緩沖液(pH7. 0)制備成5 μ g/mL的溶液。將100 μ L 這些抗原溶液添加到微量板(Nunc,Maxisorp)的各孔中,在4°C下反應12-18小時,然后除 去抗原溶液,將300 μ L含有1%BSA、0. 1%疊氮化鈉的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 2)添加到 各孔中。在室溫下靜置2小時,然后封閉微量板的未反應部位,用含有0. 01%TritonX-100、 0· 03M NaCl的IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 2)(以下記為洗滌液)洗滌3次,由此得到各種多肽 固相板。制備單克隆抗體hPTN7-2、PT5-23和20Β8的5 μ g/mL抗體溶液,將100 μ L該溶液 添加到固定有上述3種多肽(全長凝血酶原、凝血酶原-片段1、凝血酶原-片段2)的微量 板的各孔中,在室溫下反應1小時,然后除去抗體溶液,用洗滌液洗滌3次。將100 μ L稀釋 為一定濃度的堿性磷酸酶標記抗小鼠 igG( 0々夕y X A y y寸一于制造)添加到各孔 中,在室溫下反應1小時,然后除去標記抗體溶液,用洗滌液洗滌3次,添加100 μ L含有作 為顯色底物的IOmM 4-硝基苯基磷酸、ImM氯化鎂的IM二乙醇胺-鹽酸緩沖液(ρΗΙΟ. 5), 進行顯色反應。在遮光下室溫靜置15分鐘,然后添加100 yL含有50mM EDTA的0. IM磷酸 緩沖液(ρΗ7· 0),終止反應,然后用微量板讀數儀(才7 7卜'、)測定450nm/630nm的吸 光度。
[0046] 測定結果如圖1所示。單克隆抗體hPTN7-2和PT5-23與凝血酶原多肽和Fl多肽 反應,不與F2多肽反應,因此,可確認是特異性識別Fl的抗Fl單克隆抗體。而單克隆抗體 20B8與凝血酶原多肽和F2多肽反應,不與Fl多肽反應,因此,可確認是特異性識別F2的抗 F2單克隆抗體。
[0047] (C)標記抗體的制備 接著,取6mL 3mg/mL的hPTN7-2抗體溶液,添加到用0. IM檸檬酸緩沖液(pH3. 5)平衡 的G-25柱(7 7 Yシ7制造)中,進行抗體溶液的緩沖液置換。向其中加入約100 μ L lmg/mL胃蛋白酶溶液,37°C放置1小時,用Tris緩沖液將pH調至中性附近,然后添加到只 - A-r 7夕只200柱(7 7 Yシ7制造)中,進行抗體的凝膠過濾純化。合并所得流 分在吸光度280nm下的單峰,作為hPTN7-2抗體F(ab') 2片段。在4mL該F(ab')2片段溶 液中添加200 μ L 0. 2M 2-巰基乙胺(以下記為2-MEA)溶液,37°C放置2小時,進行還原處 理。將其添加到G-25柱中,除去2-MEA,作為hPTN7-2抗體Fab'片段。
[0048] 將I. 5mL 10mg/mL的高比活性ALP溶液添加到用0· IM磷酸緩沖液(ρΗ7· 0)平衡 的G-25中,進行ALP溶液的緩沖液置換。向其中添加70 μ L 10mg/mL N-(4-馬來酰亞胺基 丁基氧基)_琥珀酰亞胺(以下記為GMBS)的二甲基甲酰胺溶液,30°C放置1小時以進行反 應。將該溶液添加到用0. IM磷酸緩沖液(pH6. 3)平衡的G-25柱中,除去過量的GMBS,制 備馬來酰亞胺化ALP。將4mL之前制備的hPTN7-2抗體Fab'片段溶液、3mL馬來酰亞胺化 ALP溶液和13mL 0. IM磷酸緩沖液(pH6. 3)混合,在室溫下放置1小時,由此制備ALP標記 抗體。向其中加入ImL 2M 2-MEA溶液,在室溫下放置30分鐘,將多余的馬來酰亞胺基封 閉,然后添加到只一,一r 7夕只200柱中,進行純化。合并吸光度280nm的幾個峰中Fab' 和ALP為1:1的分子量的峰,作為純化ALP標記hPTN7-2抗體(ALP標記抗Fl抗體)。對于 PT5-23抗體和20B8抗體,也同樣地制備純化ALP標記PT5-23抗體(ALP標記Fl抗體)和 純化ALP20B8抗體(ALP標記抗F2抗體)。
[0049] 實施例2.測定數據 (D)PIVKA-II 的測定 樣品是由同一健康受試者得到的人血清/血漿(肝素鈉和EDTA-2鈉)樣品對。除了 使用酶標抗體之外,測定中還使用少S スフ°レ只卜PIVKA-II工一寸、<(富士 U匕、才制 造)所附的試劑(抗體結合粒子、洗滌液)。
[0050] 首先,在50 μ L結合有與PIVKA-II特異性結合的抗PIVKA-II單克隆抗體(小鼠) 的抗體結合粒子(抗PIVKA-II單克隆抗體(小鼠)結合磁性粒子)中添加20 μ L樣品,攪 拌,然后在37°C下反應8分鐘。通過磁力從磁性粒子中分離除去反應殘余液,用洗滌液洗 滌。在洗滌后的粒子中添加在(C)中制備的ALP標記抗Fl抗體(hPTN7-2抗體或PT5-23 抗體)(終濃度〇· 4 μ g/mL)和ALP標記抗F2抗體(終濃度0· 2 μ g/mL),攪拌后在37°C下 反應8分鐘。比較例是使用ALP標記抗凝血酶原多克隆抗體作為酶標抗體。
[0051] 然后,再次通過磁力分離磁性粒子,除去反應殘余液,用洗滌液洗滌。向該粒子中 添加200 μ L含有堿性磷酸酶的化學發(fā)光底物3-(2' -螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3' ' -磷 酰氧基)苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷·2鈉鹽(AMPPD)的底物液,在37°C下進行4分鐘的酶促反 應。通過發(fā)光測定儀測定反應后的化學發(fā)光量。測定儀器使用全自動化學發(fā)光免疫測定裝 置;I/ Sパ;レスフ°レ只卜11(富士 U匕、才制造)。
[0052] 表1示出使用ALP標記抗凝血酶原多克隆抗體作為酶標抗體測定的9個血清/血 漿樣品對的結果。表2示出使用ALP標記抗Fl抗體(hPTN7-2抗體)和ALP標記抗F2抗 體(20B8抗體)的混合物作為酶標抗體測定的9個血清/血漿樣品對的結果。結果,如表 1所示,在使用ALP標記抗凝血酶原多克隆抗體時,肝素血漿中的血漿/血清比例平均約為 79%,可確認血清/血漿相關性低。而將抗Fl抗體和抗F2抗體按照重量比2:1混合作為 ALP標記抗體時,如表2所示,肝素血漿中的血漿/血清比例約為102%,EDTA血漿中的血漿 /血清比例約105%,每種情形的血清/血漿的相關性均得到改善。
[0053] [表 1]
[表2]
【權利要求】
1. PIVKA-II的測定方法,包括:通過使用與凝血酶原片段1特異性結合的抗Fl抗體 或其抗原結合性片段、和與凝血酶原片段2特異性結合的抗F2抗體或其抗原結合性片段的 混合物、以及與PIVKA-II特異性結合的抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段的免疫測定, 來測定樣品中的PIVKA-II。
2. 權利要求1所述的方法,其中,所述抗Fl抗體是識別Fl區(qū)內的表位而與PIVKA-II 結合的抗體,所述抗F2抗體是識別F2區(qū)內的表位而與PIVKA-II結合的抗體。
3. 權利要求1或2所述的方法,其中,所述抗Fl抗體、所述抗F2抗體和所述抗 PIVKA-II抗體均是單克隆抗體。
4. 權利要求1-3中任一項所述的方法,其中,所述免疫測定是通過使用所述混合物作 為標記抗體、使用所述抗PIVKA-II抗體或其抗原結合性片段作為固相抗體的夾心法進行。
5. 權利要求1-4中任一項所述的方法,其中,所述混合物是以1:0. 2-2的比例含有抗 Fl抗體和抗F2抗體的混合物。
6. 權利要求1-5中任一項所述的方法,其中,所述樣品是血清或血漿。
7. 樣品中的PIVKA-II的免疫測定試劑,包含:與PIVKA-II特異性結合的抗PIVKA-II 抗體或其抗原結合性片段、與凝血酶原片段Fl特異性結合的抗Fl抗體或其抗原結合性片 段、和與凝血酶原片段F2特異性結合的抗F2抗體或其抗原結合性片段。
8. 樣品中的PIVKA-II的免疫測定試劑盒,包括:權利要求7所述的免疫測定試劑。
【文檔編號】G01N33/53GK104520710SQ201380042250
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權日:2012年8月9日
【發(fā)明者】山口建太郎, 青柳克己, 寺尾梓 申請人:富士瑞必歐株式會社, 愛代爾株式會社