本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種激活素受體樣激酶4(ActivinReceptor-likeKinase4，ALK4)在治療心肌肥厚中的功能和應(yīng)用，具體是在制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：心肌肥厚是心肌細胞應(yīng)對神經(jīng)體液因子刺激及機械應(yīng)力負荷改變所做出的適應(yīng)性代償反應(yīng)，是一個復(fù)雜的而且合并眾多因素參與調(diào)節(jié)的動態(tài)過程，同時也是高血壓病、瓣膜病、心肌梗死、心肌病等大多數(shù)心血管疾病發(fā)生發(fā)展中所需要共同經(jīng)歷的病理過程[1]。心肌肥厚是心臟對血流動力學(xué)負荷、血管緊張素、生長因子以及激素等多種心血管刺激因素所做出的適應(yīng)性代償反應(yīng)，能夠使心室壁壓力降低，維持甚至能夠提高心臟排血量；然而長期的應(yīng)激將會導(dǎo)致持續(xù)性病理性心肌肥大，并伴隨有心臟形態(tài)和功能上的惡化，表現(xiàn)出炎癥、纖維化及異?；虮磉_等變化。持續(xù)的心肌肥厚能導(dǎo)致擴張型心肌病、心力衰竭甚至猝死，因此心肌肥厚明顯增加了心力衰竭的發(fā)病率和病死率，已經(jīng)成為了心力衰竭等心血管疾病的獨立危險因素及不良預(yù)后的信號[2]。近幾十年來，隨著我國人民生活水平的提高，飲食習(xí)慣隨之改變，高血壓、冠心病等常見心血管疾病的發(fā)病率不斷提高，心肌肥厚繼而導(dǎo)致的室性心律失常、心源性猝死、心肌缺血及心力衰竭等心血管事件的發(fā)生率正在逐年上升，較之前提高了6-10倍[3-5]。近年來，全世界眾多學(xué)者對心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)了一些參與心肌肥厚病理生理過程的關(guān)鍵基因及重要信號傳導(dǎo)通路，并且對其中的可干預(yù)因素進行了深入研究[6-8]。然而，心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機制至今仍未完全明確，現(xiàn)有的研究及發(fā)現(xiàn)在臨床實踐中仍具有一定的局限性，尚不能形成真正有效的針對心肌肥厚的防治措施。因此，發(fā)現(xiàn)參與心肌肥厚的特異性分子及信號傳導(dǎo)通路，對進一步系統(tǒng)闡明心肌肥厚發(fā)生發(fā)展機制，從細胞分子水平對心肌肥厚進行調(diào)控，探索新的防止心肌肥厚的治療靶點，具有非常重要的理論和實踐意義。激活素受體樣激酶4(ActivinReceptor-likeKinase4，ALK4)是TGFβ超家族七個Ⅰ型受體成員之一。1993年，ALK4受體被克隆，并且發(fā)現(xiàn)ALK4在身體各組織器官廣泛表達，主要功能是作為activin的I型受體[9]。Gu等[10]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠ALK4基因后由于不能形成原腸，將導(dǎo)致胚胎致死，這一結(jié)果表明ALK4在胚胎發(fā)育中有重要作用。ActivinA通過與ALK4相互作用并使SMAD2發(fā)生磷酸化直接調(diào)節(jié)NKX2-1基因的啟動子并激活其表達，顯示ALK4在呼吸系統(tǒng)內(nèi)胚層分化中有重要作用[11]。另有研究表明，ALK4與腫瘤的關(guān)系十分密切。在小鼠B細胞雜交瘤細胞和HepG2細胞中過表達的ALK4有助于activinA的抑制細胞增殖和促進細胞凋亡[12,13]，而SiragamV.等研究發(fā)現(xiàn)miR-98可通過靶向作用于ALK4和MMP-11抑制腫瘤血管生成和侵襲[14]。但目前為止，尚未見ALK4在心血管疾病，尤其是心肌肥厚中作用的相關(guān)報道。參考文獻1.HeinekeJ,MolkentinJD.Regulationofcardiachypertrophybyintracellularsignallingpathways.NatRevMolCellBiol.2006；7(8):589-600.2.HillJA,OlsonEN.Cardiacplasticity.NEnglJMed.2008；358(13):1370-1380.3.ZileMR,GottdienerJS,HetzelSJ,McMurrayJJ,KomajdaM,McKelvieR,BaicuCF,MassieBM,CarsonPE.Prevalenceandsignificanceofalterationsincardiacstructureandfunctioninpatientswithheartfailureandapreservedejectionfraction.Circulation.2011；124(23):2491-2501.4.MuddJO,KassDA.Tacklingheartfailureinthetwenty-firstcentury.Nature.2008；451(7181):919-928.5.vanBerloJH,MailletM,MolkentinJD.Signalingeffectorsunderlyingpathologicgrowthandremodelingoftheheart.JClinInvest.2013；123(1):37-45.6.MailletM,vanBerloJH,MolkentinJD.Molecularbasisofphysiologicalheartgrowth:fundamentalconceptsandnewplayers.NatRevMolCellBiol.2013；14(1):38-48.7.ShahAM,MannDL.Insearchofnewtherapeutictargetsandstrategiesforheartfailure:recentadvancesinbasicscience.Lancet.2011；378(9792):704-712.8.SongK,NamYJ,LuoX,QiX,TanW,HuangGN,AcharyaA,SmithCL,TallquistMD,NeilsonEG,HillJA,Bassel-DubyR,OlsonEN.Heartrepairbyreprogrammingnon-myocyteswithcardiactranscriptionfactors.Nature.2012；485(7400):599-604.9.P.tenDijke,H.Ichijo,P.Franzen,etal.Activinreceptor-likekinases:anovelsubclassofcell-surfacereceptorswithpredictedserine/threoninekinaseactivity.Oncogene,1993,8(10):2879-2887.10.Z.Gu,M.Nomura,B.B.Simpson,etal.ThetypeIactivinreceptorActRIBisrequiredforeggcylinderorganizationandgastrulationinthemouse.GenesDev,1998,12(6):844-857.11.Y.Li,K.Eggermont,V.Vanslembrouck,etal.NKX2-1activationbySMAD2signalingafterdefinitiveendodermdifferentiationinhumanembryonicstemcell.StemCellsDev,2013,22(9):1433-1442.12.O.Hashimoto,K.Yamato,T.Koseki,etal.TheroleofactivintypeIreceptorsinactivinA-inducedgrowtharrestandapoptosisinmouseB-cellhybridomacells.CellSignal,1998,10(10):743-749.13.W.Chen,T.K.Woodruff,K.E.Mayo.ActivinA-inducedHepG2livercellapoptosis:involvementofactivinreceptorsandsmadproteins.Endocrinology,2000,141(3):1263-1272.14.V.Siragam,Z.J.Rutnam,W.Yang,etal.MicroRNAmiR-98inhibitstumorangiogenesisandinvasionbytargetingactivinreceptor-likekinase-4andmatrixmetalloproteinase-11.Oncotarget,2012,3(11):1370-1385.技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決臨床防治心肌肥厚疾病現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是確定ALK4基因的表達與心肌肥厚疾病之間的相互關(guān)系。提供一個用于治療心肌肥厚疾病的靶基因ALK4的新用途，進而把ALK4基因應(yīng)用于心肌肥厚疾病的治療。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：1、ALK4干擾(AdshALK4)及過表達(AdALK4)腺病毒對經(jīng)AngII誘導(dǎo)的心肌細胞肥大模型的影響本發(fā)明通過重組腺病毒構(gòu)建AdshALK4及AdALK4感染SD乳鼠原代心肌細胞，予以AngII刺激構(gòu)建心肌細胞肥大模型，對照組則予以PBS，經(jīng)免疫熒光監(jiān)測及心肌細胞表明面積統(tǒng)計表明，在AngII刺激下ALK4干擾病毒明顯促進心肌細胞肥大，心肌細胞表面積增大；ALK4過表達病毒顯著抑制心肌細胞肥大，心肌細胞表面積減小。2、ALK4基因敲除顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能本發(fā)明選用心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(命名WT)、心臟特異性ALK4基因敲除小鼠進行試驗，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主動脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠進行心心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究ALK4基因敲除對主動脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明敲除ALK4基因所致的ALK4缺陷顯著惡化心肌肥厚、纖維化及心功能。3、ALK4基因過表達顯著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能本發(fā)明選用心臟特異性ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠進行試驗，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主動脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠進行心心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究ALK4基因過表達對主動脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明過表達ALK4基因顯著抑制心肌肥厚及纖維化，保護心功能。本發(fā)明人的研究證明了：在主動脈縮窄術(shù)造成心肌肥厚模型中，ALK4具有抑制心肌肥厚及其纖維化，改善心功能的作用。一種ALK4基因在心肌肥厚疾病中的功能，主要體現(xiàn)在ALK4抑制心肌肥厚及其纖維化，改善心功能。針對ALK4的上述功能，提供一種ALK4的應(yīng)用，主要體現(xiàn)為ALK4在保護心臟、抗心臟纖維化和治療心肌肥厚中的應(yīng)用，特別是ALK4在篩選或制備保護心臟功能、抗心臟纖維化和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中應(yīng)用。所述的應(yīng)用包括：(1)ALK4直接作為保護心臟功能、抗心臟纖維化和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物的有效成分。(2)利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建能表達ALK4基因的病毒載體。(3)ALK4基因作為藥物靶標篩選能夠促進其表達的化學(xué)物質(zhì)，間接發(fā)揮保護心臟功能、抗心臟纖維化和/或預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚作用。一種保護心臟功能的藥物，包含ALK4。一種抗心臟纖維化的藥物，包含ALK4。一種預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物，包含ALK4。一種基因藥物，包含能表達ALK4基因的病毒載體，優(yōu)選為腺病毒載體。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ALK4基因的新功能，即ALK4基因具有抑制心肌肥厚及其纖維化，改善心功能的作用。(2)基于ALK4抑制心肌肥厚疾病發(fā)生的作用，其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物。附圖說明圖1是SD乳鼠原代心肌細胞用腺病毒AdshRNA、AdshALK4、AdGFP和AdALK4感染，經(jīng)AngⅡ刺激后的免疫熒光圖，結(jié)果表明ALK4的干擾腺病毒促進心肌細胞肥大，ALK4的過表達腺病毒抑制心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFP組，#：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFPAngⅡ組)。圖2是心臟特異性ALK4基因敲除小鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建策略圖，其中A為ALK4基因敲除小鼠策略圖，B為ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠策略圖。圖3是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計柱狀圖，結(jié)果顯示ALK4敲除升高HW/BW、LW/BW及HW/TL(*：p＜0.05vsWTSham組，#：p＜0.05vsWTAB組)。圖4是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后心臟組織HE染色、WGA染色及心肌細胞橫截面積統(tǒng)計柱狀圖，結(jié)果顯示ALK4敲除促進心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsWTSham組，#：p＜0.05vsWTAB組)。圖5是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結(jié)果顯示ALK4敲除促進心臟的纖維化(*：p＜0.05vsWTSham組，#：p＜0.05vsWTAB組)。圖6是NTG和TG小鼠AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計柱狀圖，結(jié)果顯示ALK4過表達HW/BW、LW/BW及HW/TL降低(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖7是NTG和TG小鼠AB模型4周后心臟組織HE染色、WGA染色及心肌細胞橫截面積統(tǒng)計柱狀圖，結(jié)果顯示ALK4過表達會抑制心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖8是NTG和TG小鼠AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結(jié)果顯示ALK4過表達會抑制心臟的纖維化(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖9是WT和ALK4-KO小鼠AB模型4周后超聲檢測心功能結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖，結(jié)果顯示ALK4敲除顯著惡化心功能；其中，LVEDd為左室舒張末期內(nèi)徑、LVESd為左室收縮末期內(nèi)徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsWTSham組，#：p＜0.05vsWTAB組)。圖10是NTG和TG小鼠AB模型4周后超聲檢測心功能結(jié)果統(tǒng)計柱狀圖，結(jié)果顯示ALK4過表達顯著保護心功能；其中，LVEDd為左室舒張末期內(nèi)徑、LVESd為左室收縮末期內(nèi)徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsNTGSham組，#：p＜0.05vsNTGAB組)。具體實施方式通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實驗用動物及飼養(yǎng)實驗動物：選用8-10周齡、體重在23.5-27.5g，雄性，心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(命名WT)，背景為C57BL/6，購自JacksonLaboratory，貨號005650)、心臟特異性ALK4基因敲除小鼠(ALK4-KO)、心臟特異性ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)及非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG，同齡同窩對照非轉(zhuǎn)基因小鼠)為實驗對象。飼養(yǎng)環(huán)境：所有實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級實驗動物中心。SRF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。【實施例1】ALK4干擾(AdshALK4)及過表達(AdALK4)腺病毒對AngII刺激的原代心肌細胞肥大的影響1.原代新生SD大鼠心肌細胞培養(yǎng)(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，頸部以下75％酒精消毒，用眼科剪和顯微鑷取下心臟，放入盛有10mLDMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重復(fù)以上過程。(2)用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗心臟，并將心臟剪成1-2mm3的碎片。轉(zhuǎn)入到放有轉(zhuǎn)子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。轉(zhuǎn)速為120r/min，消化15min，靜止數(shù)秒鐘，棄去上清液。(3)加入胰酶消化液，轉(zhuǎn)速為120r/min，消化15min。靜止數(shù)秒鐘，吸取上清液，用20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并置于4℃冰箱保存。重復(fù)該步驟，循環(huán)若干次。取上清時應(yīng)盡量取盡，當組織塊變白并明顯變小時，終止消化。(4)將收集好的心肌細胞懸液，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心8min，棄去上清液。在離心管中加入適量培養(yǎng)基，輕柔吹打重懸細胞，集中至1個50mL離心管中，細胞懸液用細胞40μm過濾網(wǎng)過濾。(5)將細胞接種在100mm的培養(yǎng)皿中，差時貼壁90min，吸取未貼壁的細胞懸液過濾。根據(jù)細胞懸液的總量加入Brdu(終濃度0.1mM)，混勻之后，加入到用0.1％明膠包被的器皿中。(6)輕搖分散細胞，勿漩渦搖晃。37℃、5％CO2孵育48小時用PBS清洗1次，更換培養(yǎng)基。2.ALK4干擾(AdshALK4)及過表達(AdALK4)腺病毒對經(jīng)AngII誘導(dǎo)的心肌細胞肥大模型的影響AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作對照)、AdshALK4(含shRNA-ALK4(沉默RNA-ALK4融合蛋白)的腺病毒)、AdGFP(含GFP(綠色熒光蛋白)的腺病毒，用作對照)及AdALK4(含GFP-ALK4(綠色熒光蛋白-ALK4融合蛋白)的腺病毒)2.1重組腺病毒構(gòu)建從美國InvivoGen公司購得ALK4的表達載體，應(yīng)用腺病毒表達系統(tǒng)AdenoVec構(gòu)建重組AdGFP、AdALK4；從美國SuperArray公司購得shRNA，shALK4載體，然后應(yīng)用腺病毒表達系統(tǒng)AdenoVec構(gòu)建重組AdshRNA、AdshALK4。2.2重組腺病毒的鑒定取病毒粗提液加入裂解液，經(jīng)混勻、離心后取上清液作為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物通過凝膠電泳鑒定。2.3.重組腺病毒的擴增：轉(zhuǎn)染前接種HEK293細胞，待細胞達到50-70％匯合時換液，加入含有重組腺病毒載體的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)90分鐘后再填加新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至大約有50％的細胞從培養(yǎng)板上脫落時，收集細胞懸液。反復(fù)凍融以制備病毒粗提液，通過CsCl密度梯度超速離心法純化病毒液。2.4.重組腺病毒滴度測定：在96孔板中接種HEK293細胞，24小時后加入倍比稀釋的病毒液，1-10列加入稀釋的病毒液，每個濃度8個重復(fù)孔，11-12列加入無病毒完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)10天后在顯微鏡下觀察細胞病變效應(yīng)(CPE)，計算每個濃度的陽性率。病毒滴度采用Spearman-KarberMethod計算：滴度(pfu/ml)＝10(x+0.8)，x＝各濃度陽性率總和。前提條件：陰性對照無CPE和生長抑制現(xiàn)象；最小稀釋濃度組均有CPE；最大稀釋濃度組均無CPE。2.5.重組腺病毒作用的鑒定：用2×108pfu/virus濃度的AdALK4和AdGFP及AdshALK4和AdshRNA感染6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)心肌細胞(約80％匯合度)，24小時后收集細胞，加入蛋白裂解液裂解50分鐘后收集上清，取50μg樣品經(jīng)10％SDS-PAGE電泳分離后，用ALK4特異性抗體做WesternBlot分析。根據(jù)ALK4蛋白的表達，確定腺病毒AdALK4和AdGFP及AdshALK4和AdshRNA是否能發(fā)揮預(yù)期作用。腺病毒10MOIs分別感染培養(yǎng)3天的原代心肌細胞，12小時后用1μM血管緊張素II(AngII)(購自Sigma公司，A9525)或?qū)φ誔BS刺激48小時，然后進行免疫熒光試驗。結(jié)果表明，AdshALK4腺病毒感染后的心肌細胞表面面積較AdshRNA對照組增加，而經(jīng)AdALK4腺病毒感染的心肌細胞表面面積則比對照組AdGFP明顯降低(圖1)。即ALK4的干擾腺病毒促進心肌細胞肥大，ALK4的過表達腺病毒抑制心肌細胞肥大。【實施例2】心臟特異性ALK4基因敲除小鼠以及ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建：(1)心臟特異性ALK4基因敲除小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖2A)：根據(jù)基因信息，利用CRISPRDesign(網(wǎng)址：http://crispr.mit.edu/)分別在內(nèi)含子1和2中各設(shè)計一個CRISPR的打靶位點。靶序列分別為：ALK4-sgRNA1：ggTCCATCCAAATGGGTCCTGCTGGALK4-sgRNA2：ggCTCAGGGCATGAAGCGTTTTTGG此外還設(shè)計了一個用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒(DonorVector)，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子2和3以及兩個同向的loxp序列。①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實驗。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。③供體載體的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到供體載體。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對應(yīng)酶切位點引物名稱引物序列酶切位點ALK4LA-FCCGCTCGAGCTACCTGCCTGCCTCACAGTXhoIALK4LA-RATGGACGTCTGCTGGGTGGACGGAGTCTAatIIALK4M-FTCTACCGGTGGACCCATTTGGATGGAGTAGAgeIALK4M-RCCGGAATTCTTTTGGTGAGGCCATCATCGTEcoRIALK4RA-FCGACGCGTACGCTTCATGCCCTGAGATMluIALK4RA-RATAAGAATGCGGCCGCCGGGGAAACAAAGTCACACNotI④打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個部分(負責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉(zhuǎn)錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體(pST1374-Cas9)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進行純化。⑤ALK4-floxed條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續(xù)的繁殖，最終獲得ALK4-floxed純合小鼠。⑥心臟特異性ALK4基因敲除小鼠的制作將上述ALK4-floxed小鼠與心臟特異性α-MHC-Cre(購自JacksonLaboratory，貨號005650)轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到ALK4floxed/floxed/α-MHC-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到心臟細胞特異性ALK4基因敲除小鼠。(2)心臟特異性ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖2B)：轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建信息：用上游引物，即5’-AGCTTTGTTTAAACGCCACCATGGCGGAGTCGGCCGGAGCCTCCTCCTTCTTC-3’；下游引物，5’-CTAGCTAGCTTAAATCTTCACATCTTCCTGCACGC-3’，擴增小鼠ALK4全長基因(NCBI，GeneID：11479，CCDS27846.1)，把cDNA插入pCAG-CAT-LacZ載體，這個載體包含一個CMV增強子和一個雞的β-actin基因(CAG，chickenβ-actingene)的啟動子，并且連接到氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT，chloramphenicolacetyltransferase)，loxP位點位于CAT兩側(cè)。ALK4的表達由CAG啟動子驅(qū)動得到。將構(gòu)建的pCAG-CAT-ALK4-polyA載體通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到ALK4-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠。心臟特異性ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠由ALK4-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠和α-MHC-Cre(購自JacksonLaboratory，貨號005650)小鼠雜交繁殖得到?！緦嵤├?】心肌肥厚模型獲得1.實驗動物分組：雄性背景C57BL/6心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(WT)、心臟特異性ALK4基因敲除小鼠(ALK4-KO)及心臟特異性ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)和非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG)，通過主動脈縮窄術(shù)(AB)建立心肌肥厚模型。隨機分為8組，分組如下：C57BL/6背景野生型小鼠假手術(shù)組(WTSham)及AB術(shù)組(WTAB)、ALK4基因敲除小鼠假手術(shù)組(ALK4-KOSham)及AB術(shù)組(ALK4-KOAB)、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(NTGSham)及AB術(shù)組(NTGAB)、心臟特異性ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(TGSham)及AB術(shù)組(TGAB)。2.心肌肥厚模型采用主動脈弓縮窄(AB)手術(shù)，模型操作流程：2.1術(shù)前準備(1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計算所需麻藥(3％戊巴比妥鈉)量，通過腹腔注射，并記錄注射時間點。夾尾、夾趾無明顯反應(yīng)且小鼠狀態(tài)良好為麻醉成功標準(一般注射后約10min無明顯反應(yīng)，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應(yīng)，麻醉后30min左右為最佳手術(shù)時間)。(2)術(shù)區(qū)準備：將小鼠左胸部、左側(cè)胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗布擦拭術(shù)區(qū)去除鼠毛，以不影響手術(shù)視野為宜。(3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經(jīng)聲門準確插入氣管內(nèi)，隨后右側(cè)臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預(yù)熱)，然后將氣管插管與呼吸機連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機頻率一致，說明氣管插管成功。2.2主動脈弓降支結(jié)扎術(shù)取右側(cè)臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫(yī)用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分數(shù)為75％酒精對手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。左手持眼科鑷將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約1cm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動脈弓降支，將7-0手術(shù)縫線穿過血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器針頭，將血管及針頭一起結(jié)扎好，再抽出針頭即可達到相應(yīng)程度的血管縮窄。結(jié)扎完畢后依次縫合，關(guān)閉胸腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出1cc氣體以恢復(fù)胸腔內(nèi)負壓，拔出注射器后迅速縫合皮膚切口。假手術(shù)組(Sham)在游離出主動脈降支后只穿線不結(jié)扎，其余步驟同心肌肥厚模型組。2.3術(shù)后護理主動脈弓降支結(jié)扎術(shù)后，待小鼠出現(xiàn)自主呼吸、夾趾出現(xiàn)強烈反應(yīng)，拔出氣管插管，并將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠內(nèi)，于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。ALK4基因敲除小鼠及野生型小鼠術(shù)后4周、非轉(zhuǎn)基因小鼠及心臟特異性ALK4轉(zhuǎn)基因小鼠術(shù)后4周分別進行各項指標的檢測。【實施例4】小鼠心肌肥厚模型心肌肥厚及纖維化檢測1.取材(1)前期工作：預(yù)先準備裝有20mL的體積分數(shù)10％甲醛的尿杯，并貼好標簽(小鼠編號、組別、手術(shù)類型及取材日期)。將倒?jié)M質(zhì)量分數(shù)10％KCl溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開分析天平，調(diào)零備用。再稱重處死小鼠。(2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質(zhì)量分數(shù)10％KCl溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內(nèi)液體，蘸干表面液體后，稱重并記錄，將心臟放入相應(yīng)的尿杯中，固定48h后用于病理學(xué)檢測。(3)相關(guān)測量及計算：取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后肢脛骨處皮膚，測量并記錄脛骨長度。計算心重與體重的比值(HW/BW)，肺重與體重的比值(LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值(HW/TL)。2.病理學(xué)檢測2.1制備石蠟標本切片主要操作程序包括修剪心臟→包埋框處理→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→晾干或烘烤后備用。2.2蘇木精-伊紅(HE)染色主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→雙蒸水1min→蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL70％酒精充分混合均勻)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氫鈉0.35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸餾水)1min→水洗1min→伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)3-5min→蒸餾水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。HE染色圖片統(tǒng)計：每張圖片選擇3個以上邊界清楚，核大致位于中央的細胞，用Image-ProPlus6.0軟件圈細胞面積。2.3麥胚凝集素染色(WGA染色)主要步驟為：將石蠟切片置于烘箱烘烤60min→二甲苯脫蠟5min，3次→100％乙醇5min，2次→95％乙醇5min→70％乙醇5min→雙蒸水浸洗5min，2次→PBS洗5min，2次→甩盡玻片上水分，用免疫組化筆在組織周圍畫圈→50μg/mlWGA-FITC，濕盒內(nèi)孵育30min→PBS洗5min，3次→DAPI復(fù)染8min→使用水溶性封片劑封片，置于4℃冰箱內(nèi)避光保存。于熒光顯微鏡400倍下拍照，并使用ImageProPlus6.0軟件測算圓形或近似圓形的左室單個心肌細胞橫截面積。要求統(tǒng)計每組不少于5只小鼠，每只小鼠不少于100個細胞。2.4天狼星紅(PSR)染色主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水沖洗10min→雙蒸水1min→質(zhì)量分數(shù)0.2％磷鉬酸2min→0.1％天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min→去除殘液→0.01N鹽酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。心肌組織由心肌細胞和間質(zhì)組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細胞失去增殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細胞反應(yīng)，只能是單個細胞的體積增大而不能在數(shù)量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過程中，主要表現(xiàn)為心肌細胞體積增大，肌節(jié)數(shù)量增多，細胞排列紊亂，心臟間質(zhì)改變包括心肌成纖維細胞的增殖與轉(zhuǎn)化，膠原纖維密度增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調(diào)等。WT和ALK4-KO小鼠AB模型后的表型結(jié)果見圖3、圖4、圖5。Sham(假手術(shù))組中WT小鼠和ALK4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；WT小鼠AB術(shù)后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham組；AB術(shù)后4周，ALK4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較WT小鼠升高(圖3)。HE及WGA染色切片可觀察到：Sham組心臟無明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，ALK4-KO小鼠的心臟明顯大于WT組小鼠；Sham組心肌肌原纖維細胞排列整齊、致密，形態(tài)完整，胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰；AB組肌絲排列紊亂、松散，心肌細胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，ALK4-KO組則比WT組細胞肥大明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。PSR染色后，發(fā)現(xiàn)AB組心室心肌間質(zhì)膠原含量較Sham組增加，動脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排列紊亂成網(wǎng)絡(luò)狀；AB術(shù)后ALK4-KO小鼠心肌間質(zhì)膠原含量及血管周圍膠原含量大于WT組小鼠(圖5)。以上結(jié)果說明經(jīng)AB模型后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚及纖維化，ALK4-KO小鼠的心肌肥厚及纖維化程度明顯大于WT小鼠。圖6、圖7、圖8是NTG和ALK4-TG小鼠AB模型后的表型結(jié)果。同樣NTG小鼠AB術(shù)后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術(shù)后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明顯小于NTG小鼠(圖6)。AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術(shù)后TG小鼠心臟增大的程度遠小于NTG小鼠。HE及WGA染色切片可觀察到：TG小鼠AB術(shù)后心肌細胞橫截面積大于Sham組，顯著小于NTG小鼠AB組(圖7)。PSR染色可見，TG小鼠AB術(shù)后心肌間質(zhì)膠原含量及血管周圍膠原含量均小于NTG小鼠AB組(圖8)。以上結(jié)果說明經(jīng)AB模型后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚及纖維化，ALK4-TG小鼠的心肌肥厚及纖維化程度小于NTG小鼠?！緦嵤├?】心肌肥厚模型小鼠超聲檢測心功能1前期準備(1)麻醉機準備：先連接氧氣瓶和麻醉機上的進氣接口，再擰開麻醉機上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調(diào)整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。(2)待測小鼠準備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區(qū)剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi)，以1.5-2.0％異氟烷維持小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。2心功能檢測小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位，并在剃毛區(qū)均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司)。采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、短軸縮短率(FS)。本實施例運用M型超聲心動圖檢測評價心肌肥厚和心功能。圖9是WT和ALK4-KO小鼠AB模型后心功能檢測結(jié)果圖。與WTSham組相比，WT小鼠AB術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標LVEDd、LVESd均不同程度的增加，而反映心功能的指標FS則下降。AB術(shù)后4周，ALK4-KO小鼠心肌肥厚的指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度比WT小鼠明顯。說明ALK4-KO小鼠的心功能更顯著惡化、心肌肥厚程度更嚴重，這些結(jié)果均與ALK4-KO小鼠心肌肥厚更為顯著的結(jié)果一致。圖10是NTG和ALK4-TG小鼠AB模型后的超聲檢測結(jié)果。與NTGSham組相比，NTG小鼠AB術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚。主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標LVEDd、LVESd增大，而反映心功能的指標FS則下降。AB術(shù)后4周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度則明顯小于NTG組。這些結(jié)果與TG小鼠心肌肥厚被抑制的結(jié)果一致。由以上結(jié)果可知，在主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，ALK4基因缺陷顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能，ALK4基因過表達顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護心功能。因此ALK4基因具有保護心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是ALK4基因能夠抑制主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關(guān)疾病發(fā)生的作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>激活素受體樣激酶4在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>ALK4-sgRNA1<400>1ggtccatccaaatgggtcctgctgg25<210>2<211>25<212>DNA<213>ALK4-sgRNA2<400>2ggctcagggcatgaagcgtttttgg25<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>loxp1-R<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>ALK4LA-F<400>7ccgctcgagctacctgcctgcctcacagt29<210>8<211>28<212>DNA<213>ALK4LA-R<400>8atggacgtctgctgggtggacggagtct28<210>9<211>30<212>DNA<213>ALK4M-F<400>9tctaccggtggacccatttggatggagtag30<210>10<211>30<212>DNA<213>ALK4M-R<400>10ccggaattcttttggtgaggccatcatcgt30<210>11<211>27<212>DNA<213>ALK4RA-F<400>11cgacgcgtacgcttcatgccctgagat27<210>12<211>35<212>DNA<213>ALK4RA-R<400>12ataagaatgcggccgccggggaaacaaagtcacac35<210>13<211>53<212>DNA<213>擴增小鼠ALK4全長基因上游引物<400>13agctttgtttaaacgccaccatggcggagtcggccggagcctcctccttcttc53<210>14<211>35<212>DNA<213>擴增小鼠ALK4全長基因下游基因引物<400>14ctagctagcttaaatcttcacatcttcctgcacgc35當前第1頁1 2 3