本發(fā)明屬于天然植物提取物的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及EGCG在制備防治藥物性肝損傷藥物及保健品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

綠茶具有很好的保健功能，決定其保健價值的核心元素是從茶多酚中提取的兒茶素單體的最主要成分——表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）。EGCG具有非常強的生物功能活性，尤其是它的抗氧化活性是維生素C的100多倍，是維生素E的25倍。因此，這也吸引了大量的科學家研究EGCG在保健、美容、藥品等方面的應(yīng)用。

肝臟是人體最大的代謝器官。外源性的有害物質(zhì)，包括藥物主要在肝臟中代謝，因此，肝臟也成為這些有害物質(zhì)最主要的毒性靶目標。目前在市場上流通的藥品中，大約有1000個品種的藥具有肝毒副作用；我們最新的研究數(shù)據(jù)表明大約有一半的常用口服藥能致肝損傷（Weng et al., A comprehensive study of the association between drug hepatotoxicity and daily dose, liver metabolism, and lipophilicity using 975 oral medications. Oncotarget. 2015， 6(19):17031-8)。例如，目前市場上最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥對乙酰氨基酚，尤其過劑量使用，會引起急性肝衰竭，最終造成死亡的嚴重后果。因此，藥物使用已經(jīng)成為導致肝損傷最主要的原因之一。然而，迄今為止，對藥物導致的肝損傷尚缺乏有效或者理想的治療方案，尤其在國內(nèi)，關(guān)于藥物性肝損傷的研究還處于起步階段。

雖然，目前有研究報道依據(jù)兒茶素具有強大的抗氧化能力，可將復(fù)方兒茶素或者茶葉提取物用于治療酒精性肝損傷或非酒精性脂肪肝，但沒有任何有關(guān)兒茶素單體EGCG用于治療藥物性肝損傷治療或預(yù)防的報道或資料。相對于比較明了的酒精性肝損傷或者非酒精性脂肪肝的病因機理，藥物引起的藥物性肝損傷的機制要復(fù)雜的多，而且引起的后果更加嚴重。另一方面，已知很多天然植物本身或其提取物都具有抗氧化活性，但在實際中的治療效果并不理想，可見，采用EGCG治療肝損傷的理由并不僅僅局限于它的抗氧化性。這也側(cè)面說明了EGCG治療肝損傷的理論基礎(chǔ)應(yīng)當不是單純依靠它的抗氧化能力，可能有更多與EGCG相關(guān)的調(diào)節(jié)機制或者激活信號參與其保護藥物性肝損傷的作用。

本發(fā)明通過大量的應(yīng)用基礎(chǔ)性實驗證明EGCG不僅有強大的抗氧化能力，也可能通過改善線粒體功能以及調(diào)節(jié)細胞自噬能力來代償對乙酰氨基酚誘導的肝臟損傷，因此，可將EGCG用于藥物性肝損傷的治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

藥物性肝損傷是不明原因肝損傷的常見原因，目前在預(yù)防和治療技術(shù)上尚有很大的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供EGCG在制備防治藥物性肝損傷藥物及保健品中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明第一個要保護的內(nèi)容是EGCG在制備防治藥物性肝損傷藥品中的應(yīng)用。

本發(fā)明第二個要保護的內(nèi)容是EGCG在制備防治藥物性肝損傷保健品中的應(yīng)用。

對乙酰氨基酚在肝臟代謝過程中會產(chǎn)生大量的ROS，ROS攻擊細胞生物膜，導致肝組織的丙二醛（MDA）提升。我們經(jīng)研究表明：EGCG處理能夠顯著降低由對乙酰氨基酚誘導的代表肝臟功能指標——谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）血清濃度的升高，有效降低對乙酰氨基酚引起的肝組織MDA的升高，這充分說明EGCG對對乙酰氨基酚的藥物性肝損傷有保護作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)EGCG這種肝臟保護作用和線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性有關(guān)，對乙酰氨基酚會明顯損害肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶I和III的活性，而EGCG則能通過與線粒體呼吸鏈蛋白的結(jié)合，顯著拮抗對乙酰氨基酚造成的這種抑制效果。此外，EGCG能夠明顯增強肝細胞自噬能力，從而減少對乙酰氨基酚引起的炎癥、過氧化毒性、甚至細胞死亡等。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：本發(fā)明相關(guān)研究首次發(fā)現(xiàn)了EGCG能夠通過對線粒體功能的保護作用，以及增強肝細胞的自噬機能，達到緩解對乙酰氨基酚引起的肝臟毒性，這對今后開發(fā)、制備預(yù)防和治療對乙酰氨基酚等誘發(fā)的肝損傷的保護藥物及保健品提供了重要的實驗基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

附圖說明

圖1是有或無EGCG預(yù)處理后的SD大鼠暴露于不同濃度的對乙酰氨基酚后，血液中ALT的濃度。從圖中可以看出，在大鼠暴露于對乙酰氨基酚250、500和1000mg/kg（體重）前，經(jīng)EGCG預(yù)處理后的三個組的血液ALT濃度顯著低于相應(yīng)未經(jīng)EGCG預(yù)處理的組。*，p<0.05，基于student’s t-test。

圖2是有或無EGCG預(yù)處理后的SD大鼠暴露于不同濃度的對乙酰氨基酚后，血液中LDH的濃度。如圖所示，在大鼠暴露于對乙酰氨基酚250、500和1000mg/kg（體重）前，經(jīng)EGCG預(yù)處理后的三個組的血液LHD濃度顯著低于相應(yīng)未經(jīng)EGCG預(yù)處理的組。*，p<0.05，基于student’s t-test。

圖3是有或無EGCG預(yù)處理后的SD大鼠暴露于不同濃度的對乙酰氨基酚后，肝臟組織中MDA的濃度。如圖所示，在大鼠暴露于對乙酰氨基酚250、500和1000mg/kg（體重）前，經(jīng)EGCG預(yù)處理后的三個組的肝臟組織MDA濃度顯著低于相應(yīng)未經(jīng)EGCG處理的組。*，p<0.05，基于student’s t-test。

圖4是有或無EGCG預(yù)處理后的SD大鼠暴露于不同濃度的對乙酰氨基酚后，肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合體I的活性。如圖所示，在大鼠暴露于對乙酰氨基酚250、500和1000mg/kg（體重）前，未經(jīng)EGCG預(yù)處理后的三個組的肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性顯著低于相應(yīng)經(jīng)EGCG預(yù)處理的組。*，p<0.05，基于student’s t-test。

圖5是有或無EGCG預(yù)處理后的SD大鼠暴露于不同濃度的對乙酰氨基酚后，肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合體III的活性。如圖所示，在大鼠暴露于對乙酰氨基酚250、500和1000mg/kg（體重）前，未經(jīng)EGCG預(yù)處理后的三個組的肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合體III活性顯著低于相應(yīng)經(jīng)EGCG預(yù)處理的組。*，p<0.05，基于student’s t-test。

圖6是有或無EGCG預(yù)處理后的SD大鼠暴露于不同濃度的對乙酰氨基酚后，大鼠肝臟LC3-II（代表自噬指標）的聚集情況。

圖7是對圖6的片段強度進行定量和統(tǒng)計學分析。如圖7所示，在大鼠暴露于對乙酰氨基酚250、500和1000mg/kg（體重）前，經(jīng)EGCG預(yù)處理后的三個組的肝臟組織LC3-II的強度明顯高于相應(yīng)未經(jīng)EGCG預(yù)處理的組。*，p<0.05，基于student’s t-test。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

動物實驗：

實驗對象為雄性的SD大鼠，8周齡，體重在220-250g之間。

將SD大鼠按照6只/組進行劃分，分為8個組，第1組為對照組，常規(guī)喂養(yǎng)；第2組為EGCG單獨喂養(yǎng)；第3~5組用梯度劑量的對乙酰氨基酚喂養(yǎng)，以建立藥物性肝損傷模型；第6~8組用EGCG結(jié)合對乙酰氨基酚喂養(yǎng)。具體喂養(yǎng)過程如下：

將第2、6、7、8組大鼠，按100mg/kg(體重)/day的量灌胃給予EGCG 5天。5天后，將第6~8組大鼠經(jīng)腹腔分別注射劑量為250、500和1000mg/kg的對乙酰氨基酚；同時對另外4個組進行常規(guī)喂養(yǎng)5天后，對第3~5組大鼠分別注射相同劑量的對乙酰氨基酚。注射后8個小時，大鼠在麻醉的狀態(tài)下被解剖，肝臟和血樣被收集用于后續(xù)的分析。

ALT和LDH的檢測

收集到的血樣在3000r/min下離心10分鐘，吸取上層的血清用于分析ALT和LDH。ALT和LDH這兩個指標的血清濃度采用日立生化分析儀（東京，日本）進行檢測。

肝臟線粒體的提取

部分肝臟樣本用于線粒體的提取。肝組織用預(yù)冷的分離緩沖液（20 mM HEPES，70 mM 蔗糖，190 mM 甘露醇，0.2 mM EDTA，pH 7.5）清洗，用剪刀將肝組織剪成碎塊，然后用100 ml Dounce型勻漿器進行勻漿；勻漿液在650g下離心10min后，將上清液移到新的離心管，在7700g下再次離心10min，去掉上清液，用上述的緩沖液（不含EDTA）再清洗2次。得到的線粒體沉淀重新混懸后進行蛋白定量，蛋白質(zhì)濃度用Bradford法進行測量。全部過程都是4℃下進行，分離到的線粒體保存在-80℃的冰箱里，用于后續(xù)線粒體功能的測定。

肝臟線粒體呼吸鏈復(fù)合體I和III活性的測定

復(fù)合體I活性：10 μl線粒體加入0.2 ml反應(yīng)液（25 mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)，5 mM MgCl₂，2 mM KCN，2.5 mg/ml BSA，0.13 mM NADH，2 μg/ml抗霉素A和65 μM癸基泛醌）。2個平行的反應(yīng)系統(tǒng)，一個添加2 μg/ml魚藤酮抑制復(fù)合體I活性，一個則不添加。分別在波長340 nm和425 nm（參照）讀取吸光度。

復(fù)合體III活性：2 μl線粒體加入0.2 ml反應(yīng)液（25 mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.2)，1 mg/ml BSA，0.99 mM n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷，1 mM KCN，1 μg/ml魚藤酮，0.1 mM reduced- decylubiquionone，and 15 μM氧化型細胞色素C），反應(yīng)系統(tǒng)在波長550 nm下測量吸光度。

肝組織丙二醛（MDA）濃度檢測

部分肝組織放在預(yù)冷的PBS溶液里，經(jīng)研磨后倒入離心管，在3000g下離心10min，吸取上清液用于測量MDA。MDA的濃度測量參考Buege and Aust (1978)文章描述的硫代巴比土酸（thiobarbituric acid）比色法。

LC3-II的western blot分析。

LC3-II抗體購買自美國cell signaling公司。肝臟組織經(jīng)過勻漿后用于蛋白質(zhì)提取，提取方法及隨后的western blot實驗方法參考文章（Weng et., al, 2015; Toxicology）。

統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件包17.0版本(SPSS, Chicago, USA)進行統(tǒng)計分析。Student's t-test用于對照組和處理組之間的各項指標比較，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果如圖1-7所示。

上述結(jié)果表明，經(jīng)EGCG預(yù)處理后的SD大鼠，暴露于250、500和1000mg/kg（體重）三個劑量對乙酰氨基酚的任意一組，EGCG都能顯示肝臟保護作用。本實驗證明，對乙酰氨基酚產(chǎn)生的ROS能與肝細胞生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈經(jīng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成過量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA；更為重要的是，對乙酰氨基酚的親電子活性代謝產(chǎn)物——乙酰苯醌亞胺，可消耗肝內(nèi)谷胱甘肽，進一步與細胞內(nèi)的電子基團，如含有巰基的線粒體蛋白質(zhì)共價結(jié)合，這或許是降低線粒體呼吸鏈復(fù)合體I和III活性的主要原因。而生物膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，呼吸鏈復(fù)合體酶活性的下降，可以引起線粒體功能的紊亂，導致線粒體合成ATP障礙，最終由于能量的缺乏，促使肝細胞凋亡甚至壞死，結(jié)局就是ALT和LDH的升高，肝臟功能受損，這是對乙酰氨基酚誘導肝損傷的主要理論基礎(chǔ)。經(jīng)上述實驗發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過以下三個途徑達到保護對乙酰氨基酚導致肝損傷的目的：一是利用EGCG的抗氧化能力以清除大量的自由基；二是EGCG通過與線粒體呼吸鏈復(fù)合體蛋白質(zhì)的結(jié)合，恢復(fù)或提高復(fù)合體I和III的活性；三是EGCG通過激活肝細胞的自噬傳導信號通路，使一些受損的生物膜或膜蛋白得到再利用，增大肝細胞自救的可能性。因此，EGCG除抗氧化能力外，還通過多個途徑對乙酰氨基酚誘導的肝損傷進行保護，可將其用于開發(fā)防治藥物性肝損傷的藥品及保健品。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。