本發(fā)明屬于動(dòng)物模型的建立方法，具體涉及到肝纖維化模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

肝纖維化指各種病因作用下肝內(nèi)纖維增生，可伴有纖維隔形成。肝纖維化主要是一種病理概念，系指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分過度增生與異常沉積，所導(dǎo)致的肝臟結(jié)構(gòu)和/或功能異常改變的病理變化。其病理機(jī)制也多是由于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死、導(dǎo)致肝臟網(wǎng)狀支架塌陷而形成，是一種被動(dòng)與不可逆的病理過程。構(gòu)建與人類肝纖維化病因、病程和病理相似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，是篩選和預(yù)測防治肝纖維化甚至肝癌的有效藥物的基礎(chǔ)，于此基礎(chǔ)，通過實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)包括動(dòng)物試驗(yàn)的定性或者定量數(shù)據(jù)，證明藥物在防治肝纖維化上的醫(yī)藥用途、藥理作用。目前肝纖維化動(dòng)物模型的制作主要有四氯化碳和二甲基亞硝胺兩種化學(xué)性肝纖維化動(dòng)物模型的建立，主要應(yīng)用在大小鼠和兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上；其次是采用異種動(dòng)物血清，蛋白作為抗原反復(fù)注射動(dòng)物制作免疫性肝纖維化模型的建立；另外還利用酒精、膽汁淤積、病毒和寄生蟲等誘導(dǎo)肝纖維化動(dòng)物模型。但是，四氯化碳、二甲基亞硝胺等化學(xué)藥物誘導(dǎo)的動(dòng)物模型與人類肝纖維化自然發(fā)病的病因、病程和病理存在很大差異；免疫性肝纖維化模型需反復(fù)注射動(dòng)物，缺乏對(duì)獼猴必要的人道關(guān)懷；雖然酒精誘導(dǎo)的靈長類動(dòng)物的肝纖維化和人類酒精性肝病十分接近，但造模周期需要3～5年，時(shí)間很長。

黃曲毒素是一種有強(qiáng)烈生物毒性的化學(xué)物質(zhì)，常由黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的食物中產(chǎn)生，如大米、豆類、花生等，有很強(qiáng)的致癌作用。但黃曲毒素致癌作用與肝纖維化形成的病因、病程和病理尚無直接證據(jù)及認(rèn)識(shí)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種造模時(shí)間短、造模成功率及造模效率高的肝纖維化動(dòng)物模型的建立方法，即以黃曲霉素誘導(dǎo)獼猴肝纖維化模型的方法。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的的技術(shù)方案：

隨機(jī)選取健康獼猴作為模型動(dòng)物，在造模期間以0.5mg/kg的黃曲霉素加入獼猴各自的飲用水中供獼猴吮吸，每月2次，每次間隔2周，連續(xù)8個(gè)月，經(jīng)病理學(xué)檢測，獼猴表現(xiàn)明顯的肝纖維化癥狀。

進(jìn)一步地，所述的飲用水配制是稱取10mg黃曲霉素，反復(fù)吹打使其充分溶解在1mL的DMSO中，提前預(yù)熱生理鹽水50℃～60℃，用生理鹽水稀釋含有黃曲霉素的DMSO至100mL，按0.5mg/kg動(dòng)物體重分裝到獼猴各自的專用的飲水瓶中供獼猴吮吸。

進(jìn)一步地，所述的恒河猴為10～14歲、體重5～8公斤的雄性或雌性，并飼喂獼猴商業(yè)維持期飼料。

進(jìn)一步地，所述的商業(yè)維持期飼料的營養(yǎng)成分為：粗蛋白質(zhì)：19.5%、粗灰分6.88%、粗脂肪4.28%、粗纖維3.1%、水分8.2%。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

1、本發(fā)明在造模期間定期將試劑加入動(dòng)物飲用水中或用各自的專用的飲水瓶中供其吮吸建立動(dòng)物模型的方法安全可靠，8個(gè)月即可造模，減少了動(dòng)物的模型造模時(shí)間，提高了造模成功率和造模效率，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2、通過肝纖維化動(dòng)物模型，構(gòu)建與人類肝纖維化病因、病程和病理相似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，于此基礎(chǔ)，通過實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)包括動(dòng)物試驗(yàn)的定性或者定量數(shù)據(jù)，研究肝纖維化及肝癌的發(fā)生機(jī)制，篩選和預(yù)測防治肝纖維化的有效藥物，證明藥物在防治肝纖維化上的醫(yī)藥用途、藥理作用，評(píng)價(jià)相關(guān)藥物對(duì)疾病的藥效。

附圖說明

圖1為血清生化標(biāo)志物透明質(zhì)酸（HA）血清學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果。

圖2為血清生化標(biāo)志物層粘連蛋白（LN）血清學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果。

圖3為血清生化標(biāo)志物III型前膠原V端肽（PIIINP)血清學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果。

圖4為血清生化標(biāo)志物谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)血清學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果。

圖5為血清生化標(biāo)志物谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)血清學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果。

圖6為血清生化標(biāo)志物總蛋白（TP）血清學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果。

圖7為正常肝組織超聲圖。

圖8為肝纖維化組織超聲圖。

圖9為光鏡（200×）下觀察masson染色正常肝切片，肝細(xì)胞正常，明顯可見細(xì)胞核、胞質(zhì)和膜。

圖10為光鏡（200×）下觀察HE染色正常肝切片的肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀。

圖11為光鏡（200×）下觀察masson染色肝細(xì)胞出現(xiàn)肝纖維化病理病變。

圖12為光鏡（400×）下觀察masson染色肝細(xì)胞出現(xiàn)肝纖維化病理病變。

以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，以下所描述的具體實(shí)施例包括但不限制本發(fā)明保護(hù)范圍。

具體實(shí)施方式

（一）模型的建立

實(shí)施例1：

從健康獼猴中隨機(jī)選取2只雄性和1只雌性，年齡12歲，雄性體重8.1Kg、7.9Kg各1只，1只雌性體重5.3Kg作為模型動(dòng)物。在造模期間以0.5mg/kg的黃曲霉素（黃曲霉素Aflatoxin B1生產(chǎn)商：sigma貨號(hào)：A6636規(guī)格：50mg 粉末狀）直接加入獼猴各自的飲用水中供獼猴吮吸，，每月2次，每次間隔2周，連續(xù)8個(gè)月，連續(xù)8個(gè)月，并按每月2次，每次間隔2周，每月底進(jìn)行血清學(xué)指標(biāo)檢測，造模后第1個(gè)月，3個(gè)月，6個(gè)月，8個(gè)月的血清結(jié)果如圖1。經(jīng)病理學(xué)檢測，獼猴表現(xiàn)明顯的肝纖維化癥狀。同時(shí)，從健康恒河猴中隨機(jī)選取2只雄性和1只雌性作為對(duì)照，年齡在12歲，體重為5～8 Kg，根據(jù)體重灌服DMSO。造模期間，恒河猴維持期飼料的營養(yǎng)成分為：粗蛋白質(zhì)：19.5%、粗灰分6.88%、粗脂肪4.28%、粗纖維3.1%、水分8.2%。

實(shí)施例2：

實(shí)施例1的飲用水制備方式是：稱取10mg黃曲霉素，反復(fù)吹打使其充分溶解在1mL的DMSO中，提前預(yù)熱生理鹽水50℃～60℃，用生理鹽水稀釋含有黃曲霉素的DMSO至100mL，按0.5mg/kg動(dòng)物體重分裝到獼猴各自的專用的無菌飲水瓶中供獼猴吮吸。其余與實(shí)施例1一致。

（二）模型建立的評(píng)價(jià)方法與結(jié)果

評(píng)價(jià)方法：肝纖維化診斷模式主要包括血清生化標(biāo)志物、影像學(xué)、病理組織學(xué)等綜合診斷。

1、血清生化標(biāo)志物包括透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、III型前膠原V端肽（PIIINP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白（TP）等。血清學(xué)指標(biāo)測試結(jié)果。

造模期間，分別于第1、3、6和8個(gè)月對(duì)造模動(dòng)物進(jìn)行血清分離檢測，收集血樣前對(duì)實(shí)驗(yàn)獼猴禁食12小時(shí)，然后在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉?xiàng)l件下，后肢靜脈采血5毫升，3000rpm離心15分鐘，分離血清，測試血清HA、LN、PIIINP 、AST 、ALT、TP濃度。造模1、3和6個(gè)月后，透明質(zhì)酸（HA）指標(biāo)測試結(jié)果顯示，肝纖維化病變模型猴與正常對(duì)照組差異顯著（P<0.05），而第8個(gè)月后恢復(fù)至和對(duì)照沒有差異。其他指標(biāo)如層粘連蛋白（LN）、III型前膠原V端肽（PIIINP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和總蛋白（TP）的測試值在各階段模型猴與正常對(duì)照動(dòng)物之間差異不顯著(P＞0.05)。（見圖1）

2、B超檢查。

在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉?xiàng)l件下，利用GE便攜式B超，采用3.5MHz電子凸陣探頭對(duì)肝臟病變部位掃描，保存圖片進(jìn)行分析。超聲檢測結(jié)果：

正常肝組織超聲圖（見圖2）。肝臟被膜整齊光滑，呈線狀纖細(xì)的強(qiáng)回聲，與腹膜線狀回聲之間有微小的間隙。肝實(shí)質(zhì)光點(diǎn)微細(xì)、分布均勻；肝內(nèi)管道系統(tǒng)走行正常，紋理清楚、透聲良好。

肝纖維化組織超聲圖（見圖3）。肝臟表面不規(guī)則，崎嶇不平，肝臟實(shí)質(zhì)回聲不均勻，有壞死灶。

3、病理組織學(xué)分析。在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉?xiàng)l件下，B超誘導(dǎo)行活檢肝組織，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、4um切片，制備肝臟組織學(xué)切片，用于HE和Masson染色，采用Leica顯微鏡觀察肝臟組織膠原纖維增生情況。分析結(jié)果：

正常肝切片，肝細(xì)胞正常，明顯可見細(xì)胞核、胞質(zhì)和膜【見圖4（200×）（masson染色）】，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀【見圖5（200×）（HE染色）。

肝纖維化病理病變：光鏡下觀察，肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的壞死變性，大量肝細(xì)胞壞死后，肝小葉內(nèi)原有網(wǎng)狀支架膠原化，而產(chǎn)生膠原纖維，纖維增生導(dǎo)致肝纖維化，形成門靜脈區(qū)與門靜脈區(qū)之間的纖維間隔?！緢D6（200×），masson染色】；光鏡下觀察，肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的壞死變性，并向肝小葉內(nèi)伸展，纖維增生

成肝纖維化?！緢D7（400×），masson染色】。