高效篩選dna斷鏈損傷保護(hù)性藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥學(xué)方法領(lǐng)域，特別涉及藥物篩選，具體是指一種高效篩選DNA斷鏈 損傷保護(hù)性藥物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，人們不僅關(guān)注一些常見(jiàn)疾病的治療，更開(kāi)始挖掘遺傳 疾病和衰老的秘密，期待從根本上排除隱患，抵抗衰老。DNA作為攜帶及傳遞遺傳信息的重 要生物分子，其完整性的保持成為生物科學(xué)的重點(diǎn)研宄領(lǐng)域，各種評(píng)價(jià)DNA損傷的技術(shù)不 斷進(jìn)化，尋找高效安全的DNA保護(hù)性藥物的報(bào)道也日益增多。
[0003] 傳統(tǒng)的DNA評(píng)價(jià)技術(shù)如放射元素標(biāo)記法，高效液相色譜-電化學(xué)測(cè)量法，氣質(zhì)聯(lián) 用法或高效毛細(xì)管電泳法等雖然靈敏度高，但是都存在儀器大型貴重，且需要專(zhuān)業(yè)人員護(hù) 理以及操作過(guò)程繁瑣的特點(diǎn)；早期被用來(lái)定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA單鏈斷裂的快速沉降技術(shù)、 堿性解旋和洗脫技術(shù)也因?yàn)闄z測(cè)靈敏度低、安全性差和實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等原因難用于高效篩選 DNA保護(hù)性藥物；傳統(tǒng)的DNA保護(hù)藥物的研宄往往是在活體或細(xì)胞水平上，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)、 對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有較高要求，體外的研宄排除雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾并不簡(jiǎn)便，因此每項(xiàng)研宄一般 只能考察少數(shù)幾種藥物的效果。
[0004] 現(xiàn)有專(zhuān)利中存在一種評(píng)價(jià)中草藥對(duì)DNA氧化損傷保護(hù)作用的方法，該方法如圖1、 2所示以鳥(niǎo)嗓呤被氧化后產(chǎn)生的8-輕基脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxy-deoxyguanosine, 8-OH-dG) 為DNA氧化損傷標(biāo)志物評(píng)價(jià)藥物保護(hù)作用，主要包括以下的步驟：1.共價(jià)鍵固定DNA在磁 性微球表面；2.加入中草藥溶液；體外染毒固定化的DNA;3.磁性分離氧化組分，保留氧化 損傷的DNA;4.加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產(chǎn)生的8-OH-dG發(fā)生免疫反應(yīng)；5.加入酶標(biāo) 第二抗體，與上述得到的產(chǎn)物反應(yīng)；6.加入發(fā)光底物，高靈敏度化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)DNA損傷產(chǎn) 生的8-OH-dG;7.檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，若信號(hào)較對(duì)照組低則認(rèn)為中草 藥具有抑制8-OH-dG產(chǎn)生的功能。其工作原理如圖1所示：
[0005] 由于此技術(shù)是以DNA的一種堿基損傷作為檢測(cè)指標(biāo)的，故存在以下不足：第一點(diǎn)， 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道DNA受到氧自由基攻擊不僅產(chǎn)生包括8-OH-dG在內(nèi)的堿基損傷，其鏈狀結(jié)構(gòu)也 會(huì)發(fā)生斷裂，即斷鏈損傷。這即意味著在上述技術(shù)體系中實(shí)際是存在如下圖所示的反應(yīng)情 況的，圖中所示的兩種情況實(shí)際產(chǎn)生的8-OH-dG是同樣多的，但由于同時(shí)發(fā)生了DNA斷鏈， 而照上述技術(shù)第3步，洗滌磁性微球?qū)⒈Ａ舻拇龣z測(cè)8-OH-dG與中草藥等雜質(zhì)分離，同時(shí)也 與已斷下來(lái)的部分DNA鏈分離，產(chǎn)生的8-OH-dG不確定是集中在斷掉部分還是保留部分，于 是即使是DNA上產(chǎn)生同樣多的8-OHdG，檢測(cè)到的信號(hào)卻可能相差很大，圖1中添加的中草藥 實(shí)際沒(méi)有抑制8-OH-dG的作用，信號(hào)卻顯示比對(duì)照組低很多，于是容易產(chǎn)生"假陽(yáng)性"的結(jié) 果。第二點(diǎn)，此技術(shù)對(duì)DNA損傷的檢測(cè)需要兩步免疫反應(yīng)，不夠簡(jiǎn)便。
[0006] 所以一種降低假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生率的，簡(jiǎn)便靈敏高效的篩選DNA斷鏈損傷保護(hù)性 藥物的方法是十分具有實(shí)用價(jià)值的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種可以降低假陽(yáng)性結(jié) 果的發(fā)生率的，簡(jiǎn)便靈敏高效的篩選DNA斷鏈損傷保護(hù)性藥物的方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種高效篩選DNA斷鏈損傷保護(hù)性藥物的方 法，其特征在于，包括以下步驟：
[0009] 步驟（1):將一端用熒光素FAM修飾另一端用氨基修飾的DNA通過(guò)共價(jià)鍵與磁性 微球表面固定，得到固定化DNA;
[0010] 步驟（2):向所述的固定化DNA中加入藥物的溶液，得到具有藥物的DNA;
[0011] 步驟⑶：將所述的具有藥物的DNA進(jìn)行體外染毒，得到染毒DNA;
[0012] 步驟（4):將所述的染毒DNA進(jìn)行磁性分離，分離掉染毒成分和反應(yīng)雜質(zhì)，保留未 斷鏈DNA;
[0013] 步驟（5):向所述的未斷鏈DNA中加入酶標(biāo)FAM抗體，所述的酶標(biāo)FAM抗體與未斷 鏈DNA自由端的FAM發(fā)生免疫反應(yīng)，得到免疫反應(yīng)后的DNA;
[0014] 步驟（6):向所述的免疫反應(yīng)后的DNA中加入發(fā)光底物后，采用高靈敏度化學(xué)發(fā)光 法檢測(cè)所述的免疫反應(yīng)后的DNA，得到檢測(cè)信號(hào)；
[0015] 步驟（7):將所述的檢測(cè)信號(hào)與對(duì)照組信號(hào)進(jìn)行對(duì)比，判斷所述的藥物是否保護(hù) DNA〇
[0016] 較佳地，所述的步驟（1)具體包括以下步驟：
[0017] 步驟（1. 1):將磁性微球采用羧基修飾，取羧基修飾后的磁性微球用咪唑緩沖液 磁性分離法洗滌3次后，分散在溶有EDC的咪唑緩沖液中，37 °C恒溫振蕩20min，得到帶有磁 性微球的溶液；
[0018] 步驟（1. 2):向所述的帶有磁性微球的溶液中加入一端用熒光素FAM修飾另一 端用氨基修飾的DNA，繼續(xù)37°C恒溫振蕩60min后得到固定化DNA，用洗滌液洗滌三次后 使所述的固定化DNA分散在洗滌液中。每個(gè)篩選樣品占用羧基磁性微球的用量為lOOug， FAM-DNA的投料量為 1. 25-20pmol。
[0019] 較佳地，所述的藥物溶液通過(guò)濃度為lmg/ml的藥物儲(chǔ)備液采用含有0. 1 %吐溫的 PBS反應(yīng)液溶液稀釋20倍后得到。
[0020] 較佳地，所述的體外染毒通過(guò)采用Fenton型產(chǎn)輕自由基體系、黃嗓呤/黃嗓呤酶 產(chǎn)超氧陰離子體系、次氯酸鈉/過(guò)氧化氫產(chǎn)單線態(tài)氧體系、體外模擬吸煙、石棉、氧化不飽 和脂肪酸、PM2. 5、化學(xué)致癌物或N-亞硝基-乙胺進(jìn)行。
[0021] 更佳地，當(dāng)體外染毒通過(guò)采用所述的Fenton型產(chǎn)羥自由基體系時(shí)，F(xiàn)e2+的濃度為 0.225 ?L8mM，F(xiàn)e2+/EDTA/H202的摩爾比為 1:3:60。
[0022] 更佳地，當(dāng)體外染毒通過(guò)采用體外模擬吸煙時(shí)，為將含有所述的具有藥物的DNA 的氣體捕集器與自動(dòng)吸煙機(jī)的煙道串聯(lián)，所述的自動(dòng)吸煙機(jī)按聯(lián)邦貿(mào)易委員會(huì)協(xié)議標(biāo)準(zhǔn)吸 煙。吸煙主流煙霧即通過(guò)氣體捕集器擴(kuò)散入捕集液（即固定化DNA分散液，含有0. 5%吐溫 的PBS)中，使得壽命更短的R0S也被捕獲。
[0023] 較佳地，所述的步驟（4)中，磁性分離掉染毒成分和反應(yīng)雜質(zhì)后，在未斷鏈DNA中 加入0. 02%BSA封閉液封閉，所述的封閉液用PBS配置。
[0024] 較佳地，所述的酶標(biāo)FAM抗體為HRP標(biāo)記的兔抗體。
[0025] 更佳地，所述的HRP標(biāo)記的兔抗體的稀釋倍數(shù)為10000倍。
[0026] 較佳地，所述的步驟5具體包括以下步驟：
[0027] 步驟（5. 1):向所述的未斷鏈DNA中加入酶標(biāo)FAM抗體后在37°C時(shí)置于恒溫振蕩 器中反應(yīng)，反應(yīng)后使用洗滌液洗滌。恒溫振蕩器中反應(yīng)與FAM-DNA特異性結(jié)合，通過(guò)HRR 催化的魯米諾與過(guò)氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度表征結(jié)合在磁性微球表面未斷鏈的 FAM-DNA的量，間接檢測(cè)DNA斷鏈的量。
[0028] 采用了本發(fā)明的高效篩選DNA斷鏈損傷保護(hù)性藥物的方法，將DNA保護(hù)性藥物的 篩選過(guò)程大大簡(jiǎn)化，并可應(yīng)用于復(fù)雜化合物的篩選，意味著可以從我國(guó)豐富的藥物來(lái)源如 中草藥、植物提取物等資源中篩選高效安全的藥物制劑。技術(shù)的實(shí)施對(duì)環(huán)境污染物的遺傳 毒性評(píng)價(jià)、新藥研發(fā)以及遺傳疾病的早期診治提供有力支撐。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是現(xiàn)有發(fā)明的檢測(cè)流程圖。
[0030] 圖2是現(xiàn)有發(fā)明的檢測(cè)原理圖。
[0031] 圖3是本發(fā)明的實(shí)施例的檢測(cè)原理圖。
[0032] 圖4是本發(fā)明的實(shí)施例的DNA投料量對(duì)表征未斷鏈DNA的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響圖 表。
[0033] 圖5為本發(fā)明的實(shí)施例的Fenton試劑的濃度對(duì)表征未斷鏈DNA的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度 的影響圖表。
[0034] 圖6為本發(fā)明的實(shí)施例的10種藥物篩選例圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方 法作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0036] 實(shí)施例1Fenton試劑致DNA斷鏈損傷的檢測(cè)
[0037]1. 1試劑與儀器
[0038] 所有試劑均為分析純。N-(3_二甲基氨丙基）_N'_乙基-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)購(gòu) 于Sigma公司；HRP標(biāo)記的兔抗FAM來(lái)自Invitrogen.Molecularprobe;HRPCL試劑盒購(gòu)自 Milipore公司；BioMag?Plus羧基化磁性微球（MB，1. 5ym，20mg/mL)購(gòu)于Polyscience 公司；BSA購(gòu)自華美生物技術(shù)公司；DNA(5' -FAM-AAAGGGGAAA-NH2-3')購(gòu)自上海生工生 物技術(shù)有限公司；Fenton試劑：(NH4)2Fe(S04) 2與EDTA每日按1:3摩爾比配成新鮮水溶液 原液，用前稀釋?zhuān)?0%的H202溶液儲(chǔ)存于冰箱冷藏層避光，用前稀釋。
[0039] 試驗(yàn)用超純水由Milli-XQ儀器制備，所有溶液由超純水配制。0. 1M的咪唑緩沖 液，pH 6.0 ;0. 1M的PBS溶液，pH7.4;洗滌液的為含有0. 1 %吐溫20的PBS，也用于DNA染 毒及藥物篩選步驟；封閉液為含0. 02%BSA的PBS。
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