用于早期神經(jīng)修復(fù)的納米藥物的制作方法
【專利摘要】本
【發(fā)明內(nèi)容】
描述了可以用于治療受影響的患者的神經(jīng)元損傷或神經(jīng)元疾病的、疏水地修飾的納米粒和聚合納米結(jié)構(gòu)，以及形成和使用所述納米粒和納米結(jié)構(gòu)的方法。此外，所述納米粒和納米結(jié)構(gòu)被設(shè)計為“雙重作用”組合物，其用于通過修復(fù)受損傷的膜和抑制細胞內(nèi)炎癥來治療神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元疾病。
【專利說明】用于早期神經(jīng)修復(fù)的納米藥物
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
本申請在35 USC § 119(e)下要求2011年2月24日提交的美國臨時申請序列號61/446，252的權(quán)益，其整個公開內(nèi)容通過引用并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明一般地涉及納米藥物領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及疏水地修飾的納米粒和聚合納米結(jié)構(gòu)以及形成和使用它們的方法。
[0003]背景和
【發(fā)明內(nèi)容】

神經(jīng)損傷和神經(jīng)疾病是身體的虛弱的且復(fù)雜的表現(xiàn)。例如，脊髓損傷(SCI)會導(dǎo)致受影響的神經(jīng)和內(nèi)皮組織中的細胞膜的立即最初破裂，繼之以廣泛的繼發(fā)性神經(jīng)變性過程。大多數(shù)SCI病例涉及原發(fā)性損傷和隨后的繼發(fā)性損傷。在原發(fā)性損傷過程中，對脊髓的急性機械應(yīng)激會破壞神經(jīng)膜和造成向細胞中的Ca2+流入。后一種過程會觸發(fā)一系列繼發(fā)性的生物學(xué)事件(包括炎癥、自由基釋放和細胞凋亡)，這會進一步加重損傷。
[0004]在處于研究下的多種治療中，一種關(guān)鍵方案是，在SCI的早期封閉受損傷的膜。迄今為止，已經(jīng)將聚(乙二醇)(PEG)和普郎尼克P188用于膜修復(fù)。但是，這些試劑的有效性非常有限，部分地歸因于它們在全身性施用以后的快速清除。例如，沒有經(jīng)過疏水修飾的PEG可以在神經(jīng)損傷的治療中產(chǎn)生可忽略的效力。
[0005] 申請人:已經(jīng)證實了嵌段共聚物膠束作為納米級膜修復(fù)劑在外傷性地損傷的脊髓中的功能(Shi等人(2010) Nature Nano technology 5:80-87，通過引用并入本文)。自組裝的單甲氧基聚(乙二醇)-聚(D，L-乳酸)(mPEG-PDLLA) 二嵌段共聚物膠束(直徑為60 nm)可以有效地修復(fù)由擠壓損傷的軸突膜。靜脈內(nèi)地注射的mPEG-PDLLA膠束會恢復(fù)運動功能和減小SCI大鼠中的病灶的體積和炎癥應(yīng)答。在機理上，據(jù)信，具有受控的兩親性能的共聚物能夠?qū)⑹杷湶迦胧艿綑C械破壞的、具有較低脂質(zhì)堆積密度的膜中，但是在所述膜被封閉后會受到排斥。但是，自組裝的膠束在體循環(huán)過程中的在體內(nèi)的分解會允許兩親的單聚體(unimer)向損傷部位的有效遞送。
[0006]設(shè)計出聚合物膠束來包封疏水抗炎藥，這可有效地抑制由Ca2+流入誘導(dǎo)的細胞內(nèi)損傷。如 申請人:的FRET研究所證實的，在全身性施用以后，膠束在血液循環(huán)過程中會降低它們的穩(wěn)定性，特別當(dāng)加載的藥物被釋放時(Chen等人(2008) Langmuir 24:5213-5217;Chen 等人(2008) Proc Natl AcacI Sci USA 105:6596-6601，二者通過引用并入本文)。單聚體和抗炎藥都穿過受損的血液-脊髓屏障被遞送至損傷部位。
[0007]此外，基于聚合物膠束的膜修復(fù)方法在臨床應(yīng)用中受到狹窄的治療時間窗的挑戰(zhàn)。例如，必須在繼發(fā)性神經(jīng)元損傷變得明顯之前施用膠束。因而，非常期望用于治療神經(jīng)損傷和疾病的一種替代性治療選擇。
[0008]本公開內(nèi)容證實，使用具有下述雙重作用的治療組合物，可以克服治療神經(jīng)損傷和疾病的問題:1)修復(fù)受損傷的膜，和2)抑制細胞內(nèi)的炎癥作用。與僅具有單一作用的治療相比，所述的組合物可以協(xié)同地起作用以挽救更多的神經(jīng)細胞免于損傷誘導(dǎo)的細胞死亡，并進一步延長干預(yù)的治療窗。
[0009]本公開內(nèi)容描述了可以用于治療受影響的患者的神經(jīng)損傷或神經(jīng)疾病的、疏水地修飾的納米粒和聚合納米結(jié)構(gòu)，以及形成和使用所述納米粒和納米結(jié)構(gòu)的方法。
[0010]與本領(lǐng)域中已知的替代物相比，根據(jù)本公開內(nèi)容的疏水地修飾的納米粒和聚合納米結(jié)構(gòu)會提供幾個優(yōu)點。首先，本公開內(nèi)容的納米粒和納米結(jié)構(gòu)被設(shè)計為“雙重作用”組合物，其通過修復(fù)受損傷的膜和抑制細胞內(nèi)的炎癥來治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)疾病。
[0011]其次，與本領(lǐng)域中已知的替代物相比，本公開內(nèi)容的納米粒和納米結(jié)構(gòu)具有改善的藥代動力學(xué)參數(shù)。例如，所述納米粒和納米結(jié)構(gòu)可以與向需要修復(fù)或治療的部位的更靶向的遞送相關(guān)聯(lián)，且可以與在其它身體部位處的潛在有害的副作用和/或毒性的減少相關(guān)聯(lián)。
[0012]第三，與在本領(lǐng)域中使用的其它PEG實施方案相比，本公開內(nèi)容的納米粒和納米結(jié)構(gòu)分別經(jīng)過疏水修飾或包括疏水結(jié)構(gòu)域。由于在全身性施用以后更慢的從身體的清除速率，疏水部分的包括會增強所述組合物的有效性。
[0013]第四，在本公開內(nèi)容的納米粒和納米結(jié)構(gòu)包括抗炎劑的實施方案中，可以將得到的組合物作為單一藥劑施用給患者，無需分開施用納米粒/納米結(jié)構(gòu)和抗炎劑。
[0014]最后，本公開內(nèi)容的納米粒和納米結(jié)構(gòu)可以具有提高的抗炎劑的加載效率，從而促進抗炎劑向需要修復(fù)或治療的部位的更有效的且靶向的遞送。
[0015]涵蓋了下述編號的實施方案，且它們是非限制性的:
1.一種包含疏水地修飾的納米粒的組合物，所述納米粒包含多糖和藥效團，其中所述多糖與所述藥效團共價地結(jié)合。
[0016]2.條款I(lǐng)或條款2的組合物，其中所述多糖經(jīng)由酰胺鍵與所述藥效團共價地結(jié)
口 ο
[0017]3.條款I(lǐng)或條款2的組合物，其中所述多糖是殼聚糖。
[0018]4.條款I(lǐng)或條款2的組合物，其中所述多糖是殼聚糖衍生物。
[0019]5.條款I(lǐng)或條款2的組合物，其中所述多糖是乙二醇殼聚糖。
[0020]6.條款1-5中的任一項的組合物，其中所述藥效團是脂肪酸。
[0021]7.條款1-5中的任一項的組合物，其中所述藥效團是膽烷酸。
[0022]8.條款1-5中的任一項的組合物，其中所述藥效團是阿魏酸。
[0023]9.條款1-5中的任一項的組合物，其中所述藥效團是阿魏酸衍生物。
[0024]10.條款I(lǐng)的組合物，其中所述多糖是乙二醇殼聚糖，且所述藥效團是阿魏酸。
[0025]11.條款10的組合物，其中所述納米粒具有選自5: 1、11:1和21:1的每個乙二醇殼聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇殼聚糖鏈)。
[0026]12.條款10的組合物，其中所述納米粒具有11:1的每個乙二醇殼聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇殼聚糖鏈)。
[0027]13.條款1-12中的任一項的組合物，所述組合物另外包含治療有效量的抗炎劑。
[0028]14.條款13的組合物，其中所述抗炎劑是皮質(zhì)類固醇。
[0029]15.條款14的組合物，其中所述皮質(zhì)類固醇選自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍、氫化可的松和可的松。
[0030]16.條款14的組合物，其中所述皮質(zhì)類固醇是甲潑尼龍。[0031]17.條款13的組合物，其中所述抗炎劑是姜黃素。
[0032]18.條款13的組合物，其中所述藥效團是膽烷酸，且所述抗炎劑是甲潑尼龍。
[0033]19.條款13的組合物，其中所述藥效團是阿魏酸，且所述抗炎劑是姜黃素。
[0034]20.條款1-19中的任一項的組合物，其中所述納米粒的平均直徑是約100至約500 納米(nm)。
[0035]21.條款1-19中的任一項的組合物，其中所述納米粒的平均直徑是約200至約400 納米(nm)。
[0036]22.條款1-19中的任一項的組合物，其中所述納米粒的平均直徑是約300納米(nm) ο
[0037]23.條款1-19中的任一項的組合物，其中所述納米粒的平均直徑是約320納米(nm) ο
[0038]24.條款1-19中的任一項的組合物，其中所述納米粒的平均直徑是約350納米(nm) ο
[0039]25.條款1-24中的任一項的組合物，所述組合物用于治療神經(jīng)元損傷。
[0040]26.條款1-24中的任一項的組合物，所述組合物用于治療脊髓損傷。
[0041]27.條款1-24中的任一項的組合物，所述組合物用于治療外傷性腦損傷。
[0042]28.條款1-24中的`任一項的組合物，所述組合物用于接觸受損傷的神經(jīng)。
[0043]29.條款1-24中的任一項的組合物，所述組合物用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)。
[0044]30.條款1-24中的任一項的組合物，所述組合物用作神經(jīng)保護劑。
[0045]31.條款1-30中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。
[0046]32.條款1-30中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的器官毒性減少相關(guān)聯(lián)。
[0047]33.條款1-30中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的腎損傷減少相關(guān)聯(lián)。
[0048]34.一種包含聚合納米結(jié)構(gòu)的組合物,所述聚合納米結(jié)構(gòu)包含疏水芯、親水殼和治療有效量的抗炎劑。
[0049]35.條款34的組合物，其中所述納米結(jié)構(gòu)是膠束。
[0050]36.條款34或條款35的組合物，其中所述疏水芯承載抗炎劑。
[0051]37.條款34-36中的任一項的組合物，其中所述親水殼包含單甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。
[0052]38.條款34-37中的任一項的組合物，其中所述疏水芯包含聚酯。
[0053]39.條款38的組合物，其中所述聚酯選自:聚ε -己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸-乙醇酸(poly lactic-glycolytic acid, PLGA)、聚乳酸(PLA)和聚(D, L-乳酸)(PDLLA)。
[0054]40.條款38的組合物，其中所述聚酯是PLGA。
[0055]41.條款34-40中的任一項的組合物，其中所述抗炎劑是皮質(zhì)類固醇。
[0056]42.條款41的組合物，其中所述皮質(zhì)類固醇選自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍、氫化可的松和可的松。
[0057]43.條款41的組合物，其中所述皮質(zhì)類固醇是甲潑尼龍。[0058]44.條款34-40中的任一項的組合物，其中所述抗炎劑是姜黃素。
[0059]45.條款34-44中的任一項的組合物，其中所述納米結(jié)構(gòu)的平均直徑是約10至約200 納米(nm)。
[0060]46.條款34-44中的任一項的組合物，其中所述納米結(jié)構(gòu)的平均直徑是約50至約150 納米(nm)。
[0061]47.條款34-44中的任一項的組合物，其中所述納米結(jié)構(gòu)的平均直徑是約60納米(nm) ο
[0062]48.條款34-44中的任一項的組合物，其中所述納米結(jié)構(gòu)的平均直徑是約120納米(nm)。
[0063]49.條款34-48中的任一項的組合物，所述組合物用于治療神經(jīng)元損傷。
[0064]50.條款34-48中的任一項的組合物，所述組合物用于治療脊髓損傷。
[0065]51.條款34-48中的任一項的組合物，所述組合物用于治療外傷性腦損傷。
[0066]52.條款34-48中的任一項的組合物，所述組合物用于接觸受損傷的神經(jīng)。
[0067]53.條款34-48中的任一項的組合物，所述組合物用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)。
[0068]54.條款34-48中的任一項的組合物，所述組合物用作神經(jīng)保護劑。
[0069]55.條款34-54中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。
[0070]56.條款34-54中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的器官毒性減少相關(guān)聯(lián)。
[0071]57.條款34-54中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的腎損傷減少相關(guān)聯(lián)。
[0072]58.一種組合物，其包含含有多糖的多糖納米粒，其中所述多糖具有高分子量。
[0073]59.條款58的組合物，其中所述多糖是殼聚糖。
[0074]60.條款58的組合物，其中所述多糖是殼聚糖衍生物。
[0075]61.條款58的組合物，其中所述多糖是乙二醇殼聚糖。
[0076]62.條款58-61中的任一項的組合物，其中所述多糖的分子量是在約50 kDa至約250 kDa 之間。
[0077]63.條款58-61中的任一項的組合物，其中所述多糖的分子量是約100 kDa。
[0078]64.條款58-61中的任一項的組合物，其中所述多糖的分子量是約200 kDa。
[0079]65.條款58-64中的任一項的組合物，所述組合物另外包含治療有效量的抗炎劑。
[0080]66.條款65的組合物 ，其中所述抗炎劑是皮質(zhì)類固醇。
[0081]67.條款66的組合物，其中所述皮質(zhì)類固醇選自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍、氫化可的松和可的松。
[0082]68.條款66的組合物，其中所述皮質(zhì)類固醇是甲潑尼龍。
[0083]69.條款65的組合物，其中所述抗炎劑是姜黃素。
[0084]70.條款58-69中的任一項的組合物，其中所述納米粒的平均直徑是約100至約500 納米(nm)。
[0085]71.條款58-70中的任一項的組合物，所述組合物用于治療神經(jīng)元損傷。[0086]72.條款58-70中的任一項的組合物，所述組合物用于治療脊髓損傷。
[0087]73.條款58-70中的任一項的組合物，所述組合物用于治療外傷性腦損傷。
[0088]74.條款58-70中的任一項的組合物，所述組合物用于接觸受損傷的神經(jīng)。
[0089]75.條款58-70中的任一項的組合物，所述組合物用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)。
[0090]76.條款58-70中的任一項的組合物，所述組合物用作神經(jīng)保護劑。
[0091]77.條款58-76中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。
[0092]78.條款58-76中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的器官毒性減少相關(guān)聯(lián)。
[0093]79.條款58-76中的任一項的組合物，其中所述組合物與患者中的腎損傷減少相關(guān)聯(lián)。
[0094]80.一種治療患有神經(jīng)元損傷的患者的方法，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的條款1-33中的任一項的疏水地修飾的納米粒。
[0095]81.一種治療患有神經(jīng)元損傷的患者的方法，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的條款34-57中的任一項的聚合納米結(jié)構(gòu)。
[0096]82.一種治療患有神經(jīng)元損傷的患者的方法，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的條款58-79中的任一項的多糖納米粒。
[0097]83.條款80-82中的任一項的方`法，其中所述神經(jīng)元損傷是脊髓損傷。
[0098]84.條款80-82中的任一項的方法，其中所述神經(jīng)元損傷是外傷性腦損傷。
[0099]85.條款80-82中的任一項的方法，其中所述方法用于接觸受損傷的神經(jīng)。
[0100]86.條款80-82中的任一項的方法，其中所述方法用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)。
[0101]87.條款80-86中的任一項的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的48小時內(nèi)進行。
[0102]88.條款80-86中的任一項的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的24小時內(nèi)進行。
[0103]89.條款80-86中的任一項的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的約I小時至約12小時之間進行。
[0104]90.條款80-86中的任一項的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的12小時內(nèi)進行。
[0105]91.條款80-86中的任一項的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的8小時內(nèi)進行。
[0106]92.條款80-86中的任一項的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的4小時內(nèi)進行。
[0107]93.條款80-86中的任一項的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的2小時內(nèi)進行。
[0108]94.條款80-93中的任一項的方法，其中所述方法與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)改
善相關(guān)聯(lián)。
[0109]95.條款80-93中的任一項的方法，其中所述方法與患者中的器官毒性減小相關(guān)聯(lián)。[0110]96.條款80-93中的任一項的方法，其中所述方法與患者中的腎損傷減小相關(guān)聯(lián)。
[0111]97. 條款80-93中的任一項的方法，其中所述方法會減輕與腎損傷有關(guān)的癥狀。
[0112]98.條款80-93中的任一項的方法，其中所述施用是注射。
[0113]99.條款98的方法，其中所述注射選自:關(guān)節(jié)內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射和皮下注射。
[0114]100.條款99的方法，其中所述注射是靜脈內(nèi)注射。
[0115]101.條款80-100中的任一項的方法，其中所述施用作為單次劑量施用來執(zhí)行。
[0116]102.條款80-100中的任一項的方法，其中所述施用作為多次劑量施用來執(zhí)行。
[0117]103.一種治療患有神經(jīng)元疾病的患者的方法，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的條款1-33中的任一項的疏水地修飾的納米粒。
[0118]104.一種治療患有神經(jīng)元疾病的患者的方法，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的條款34-57中的任一項的聚合納米結(jié)構(gòu)。
[0119]105.一種治療患有神經(jīng)元疾病的患者的方法，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的條款58-79中的任一項的多糖納米粒。
[0120]106.條款103-105中的任一項的方法，其中所述神經(jīng)元疾病是急性神經(jīng)元疾病。
[0121]107.條款103-105中的任一項的方法，其中所述神經(jīng)元疾病是慢性神經(jīng)元疾病。
[0122]108.條款103-107中的任一項的方法，其中所述施用是注射。
[0123]109.條款108的方法，其中所述注射選自:關(guān)節(jié)內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射和皮下注射。
[0124]110.條款109的方法，其中所述注射是靜脈內(nèi)注射。
[0125]111.條款103-109中的任一項的方法，其中所述施用作為單次劑量施用來執(zhí)行。
[0126]112.條款103-109中的任一項的方法，其中所述施用作為多次劑量施用來執(zhí)行。
[0127]113.一種藥物制劑，其包含條款1-33中的任一項的疏水地修飾的納米粒。
[0128]114.一種藥物制劑，其包含條款34-57中的任一項的聚合納米結(jié)構(gòu)。
[0129]115.一種藥物制劑，其包含條款58-79中的任一項的多糖納米粒。
[0130]116.條款113-115中的任一項的藥物制劑，所述藥物制劑另外包含藥學(xué)上可接受的載體。
[0131]117.條款113-116中的任一項的藥物制劑，所述藥物制劑任選地包括一種或多種其它治療成分。
[0132]118.條款113-117中的任一項的藥物制劑，其中所述制劑是單一單位劑量。
[0133]119.條款113-118中的任一項的藥物制劑的凍干粉劑或粉末。
[0134]120.通過將條款119的凍干粉劑或粉末溶解于水中所生成的水溶液。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0135]圖1顯示了在靜脈內(nèi)注射I ml加載了 5 mg/ml姜黃素的、疏水地修飾的乙二醇殼聚糖(HGC)納米粒以后,通過Basso Beattie Bresnahan (BBB)評分測得的SCI大鼠的運動功能的恢復(fù)。加載效率是10%，這對應(yīng)于納米粒溶液中的500 yg/ml姜黃素。在脊髓挫傷損傷后2小時，進行通過頸靜脈的注射。[0136]圖2顯示了表明HGC納米粒在血液中的半衰期的藥代動力學(xué)。
[0137]圖3顯示了加載姜黃素的HGC納米粒的示例性合成。(a)阿魏酸是姜黃素水解的一種產(chǎn)物。(b) GC和FA之間的綴合的合成路線圖。(c)加載姜黃素的HGC納米粒的示意圖。(d)在沒有(左)或有HGC(右)存在下姜黃素在PBS中的溶解度試驗。
[0138]圖4顯示了光聲膜穿孔(poration)模型。(a)裝備。(b)用鈣黃綠素AM (綠色)和碘化丙啶(紅色)進行的膜完整性試驗。輻照后，在激光斑點內(nèi)的區(qū)域中的細胞受到損傷，被碘化丙啶標(biāo)記，而在輻照區(qū)域之外的細胞仍然是健康的，被鈣黃綠素標(biāo)記。(C)顯示了輻照之后細胞的膜起泡的局部放大圖像。細胞核被碘化丙啶標(biāo)記。條=10 Um0
[0139]圖5顯示了用于記錄CAP的雙鹿糖間隙記錄室。
[0140]圖6顯示了脊髓損傷和修復(fù)的體內(nèi)研究的流程圖。
[0141]圖7顯示了具有取代度(DS) = 21的FA-GC納米粒中的加載的姜黃素的沉淀(參見右圖)。相比而言，具有DS = 11的FA-GC能夠穩(wěn)定地包封姜黃素(參見左圖)。
[0142]圖8顯示了(a)用阿魏酸(FA)化學(xué)綴合的乙二醇殼聚糖，所述阿魏酸是姜黃素水解的一種產(chǎn)物；(b)通過透射電子顯微術(shù)(TEM)測得的加載姜黃素的GC-FA納米粒的平均直徑；(c)通過動態(tài)光散射(DLS)測得的加載姜黃素的GC-FA納米粒的平均直徑；(d)得自姜黃素(左，綠色)和Cy5.5-標(biāo)記的FA-GC (右，紅色)的熒光信號的共同局部化；(e)存在于FA-GC中的姜黃素在I個月內(nèi)的沉淀。
[0143]圖9顯示了在質(zhì)譜圖中通過它 們的離子化片段(對于姜黃素，m/z=149 ;對于華法林，m/z=161)對姜黃素和華法林的檢測。
[0144]圖10顯示了(a)使用源自姜黃素和華法林的質(zhì)量強度之間的比例的校正曲線測得的姜黃素的濃度；(b)受損傷的脊髓相對于正常脊髓的姜黃素濃度；(c)通過一室模型測得的血液保留時間；(d)在脊髓的損傷部位處觀察到的信號。
[0145]圖11表明，F(xiàn)A-GC納米粒中的姜黃素大部分通過腎消除。
[0146]圖12顯示了未修飾的GC的半衰期。
[0147]圖13顯示了受損傷的脊髓相對于其它器官的熒光強度。
[0148]圖14顯示了(a)灰質(zhì)內(nèi)部的熒光信號，其非常易受挫傷損傷的影響(參見腔的形成)；(b)在后白質(zhì)中的髓鞘表現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)學(xué)；(c)中央管附近的髓鞘表現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)學(xué)；(d)灰質(zhì)的高放大率SRS圖像表現(xiàn)出紅細胞凝塊；(e)在前白質(zhì)中的髓鞘表現(xiàn)為高度卷曲。
[0149]圖15顯示了在與GC-FA納米粒一起溫育4小時以后，姜黃素進入細胞和GC-FA靶向細胞膜。
[0150]圖16顯示了(a) GC-FA的細胞膜附著和姜黃素的細胞內(nèi)化的共焦成像；(b) 0.2mg/ml GC-FA/姜黃素處理會顯著減少PI染色的細胞的數(shù)目；(c) GC-FA/姜黃素處理會使存活率從20%增加至95%，單獨的GC-FA幫助挽救了 55%的細胞；(d)所有3種處理顯著保護了谷氨酸損傷模型中的PC12細胞。
[0151]圖17顯示了治療的大鼠的運動功能的恢復(fù)。
[0152]圖18顯示了 FA-GC治療以后鎂和BUN的水平的下降。
[0153]圖19顯示了通過GFAP和ED-1對星形膠質(zhì)細胞和巨噬細胞/活化的小膠質(zhì)細胞的鑒別。[0154]圖20顯示了(a)在鹽水治療的動物中由星形膠質(zhì)細胞邊界指示的腔面積；(b)活化的星形膠質(zhì)細胞和活化的小膠質(zhì)細胞:鹽水治療的動物的損傷的中心(epicenter)的GFAP熒光；(c)活化的星形膠質(zhì)細胞和活化的小膠質(zhì)細胞:鹽水治療的動物的損傷的中心的ED-1突光；(d)在納米粒治療的動物中由星形膠質(zhì)細胞邊界指示的腔面積；(e)活化的星形膠質(zhì)細胞和活化的小膠質(zhì)細胞:納米粒治療的動物的損傷的中心的GFAP熒光；(f)活化的星形膠質(zhì)細胞和活化的小膠質(zhì)細胞:納米粒治療的動物的損傷的中心的ED-1熒光；(m) FA-GC/姜黃素治療的組的GFAP熒光相對于鹽水治療的組顯著減小(187.38±46.37相對于339.37 土 49.47) ； (n) FA-GC/姜黃素治療的組的ED-1熒光相對于鹽水治療的組顯著減小(103.20 土 39.67相對于242.35 土 55.38) ； (ο)納米粒治療的組的腔面積(1.67±0.5 mm2)相對于鹽水治療的組(5.19±0.92 mm2)顯著減小。
[0155] 圖21顯示了加載姜黃素的FA-GC納米粒相對于鹽水治療的安全性分析。
【具體實施方式】
[0156]本文中使用的“疏水地修飾的納米?！笔侵敢呀?jīng)用疏水部分修飾的納米粒。本文中使用的“聚合納米結(jié)構(gòu)”是指包含一種或多種聚合物的納米結(jié)構(gòu)。納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為表示，具有至少一種亞微米大小的尺寸的顆粒。
[0157]在下文中描述了本發(fā)明的不同實施方案。在本文描述的一個實施方案中，提供了一種疏水地修飾的納米粒。所述疏水地修飾的納米粒包含多糖和藥效團，其中所述多糖與所述藥效團共價地結(jié)合。
[0158]在另一個實施方案中，提供了一種聚合納米結(jié)構(gòu)。所述聚合納米結(jié)構(gòu)包含疏水芯、親水殼和治療有效量的抗炎劑。
[0159]在另一個實施方案中,提供了一種多糖納米粒。所述多糖納米粒包含多糖，其中所述多糖具有高分子量。
[0160]在其它實施方案中，提供了治療患者的神經(jīng)損傷的方法。在一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述疏水地修飾的納米粒。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述聚合納米結(jié)構(gòu)。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述多糖納米粒。
[0161]在其它實施方案中，提供了治療患者的神經(jīng)疾病的方法。在一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述疏水地修飾的納米粒。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述聚合納米結(jié)構(gòu)。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述多糖納米粒。
[0162]在其它實施方案中，提供了藥物制劑。在一個示例性的實施方案中，所述藥物制劑包含所述疏水地修飾的納米粒。在另一個示例性的實施方案中，所述藥物制劑包含所述聚合納米結(jié)構(gòu)。在另一個示例性的實施方案中，所述藥物制劑包含所述多糖納米粒。
[0163]在本文描述的不同的實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的多糖組分可以與藥效團共價地結(jié)合。在一個實施方案中，所述多糖經(jīng)由酰胺鍵與藥效團結(jié)合。
[0164]在本文描述的某些實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的多糖組分是殼聚糖。在本文描述的其它實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的多糖組分是殼聚糖衍生物。本文中使用的術(shù)語“殼聚糖衍生物”表示天然多糖殼聚糖的修飾形式。在本文描述的一個實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的多糖組分是乙二醇殼聚糖。
[0165]在本文描述的其它實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的多糖組分是脂肪酸。本文中使用的術(shù)語“脂肪酸”是指具有長脂族尾巴的羧酸，且可以是飽和的或不飽和的。脂肪酸的例子是本領(lǐng)域眾所周知的，例如從甘油三酯或磷脂衍生出的那些。
[0166]在本文描述的不同的實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的藥效團組分是膽烷酸。在本文描述的某些實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的藥效團組分是膽烷酸衍生物。在本文描述的其它實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的藥效團組分是阿魏酸。在本文描述的某些實施方案中，本文描述的疏水地修飾的納米粒的藥效團組分是阿魏酸衍生物。
[0167]在本文描述的某些實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒的多糖組分是乙二醇殼聚糖，且所述疏水地修飾的納米粒的藥效團組分是阿魏酸。在其它實施方案中，所述納米粒具有測得的取代度，本領(lǐng)域技術(shù)人員將取代度理解為表示每個殼聚糖鏈的阿魏酸的數(shù)目。在某些實施方案中，所述納米粒具有選自5: 1、11:1和21:1的每個乙二醇殼聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇殼聚糖鏈)。在一個實施方案中，所述納米粒具有11:1的每個乙二醇殼聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇殼聚糖鏈)。
[0168]在本文描述的其它示例性的實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒進一步包含治療有效量的抗炎劑。本文中使用的術(shù)語“治療有效量”表示給動物提供期望的益處的量，且包括治療性和預(yù)防性施用。該量將隨動物不同而變化，且取決于許多因素，包括動物的總體身體狀況和要治療的病癥的根本原因。本文中使用的術(shù)語“抗炎劑”表示減輕患者的炎癥和/或減輕與炎癥有關(guān)的疼痛或腫脹的任意化合物。
[0169]在某些實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒的抗炎劑組分是皮質(zhì)類固醇。在其它實施方案中，所述皮質(zhì)類固 醇選自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍、氫化可的松和可的松。在一個實施方案中，所述皮質(zhì)類固醇是甲潑尼龍。在某些實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒的抗炎劑組分是姜黃素。
[0170]可以特異性地修飾所述疏水地修飾的納米粒的多糖組分的疏水性，以優(yōu)化抗炎劑的加載效率和細胞內(nèi)遞送以及疏水單聚體向受損傷的膜的插入。加載效率的優(yōu)化可以導(dǎo)致抗炎劑向體內(nèi)的需要部位處的更有效遞送。此外，加載效率的優(yōu)化可以導(dǎo)致抗炎劑向體內(nèi)的需要部位處的靶向遞送，且可以避免對體內(nèi)的其它部位的有害的副作用或不希望的毒性。
[0171]在本文描述的不同的示例性的實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒的藥效團組分是膽烷酸，且所述疏水地修飾的納米粒的抗炎劑組分是甲潑尼龍。在本文描述的其它示例性的實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒的藥效團組分是阿魏酸，且所述疏水地修飾的納米粒的抗炎劑組分是姜黃素。
[0172]在一個示例性的方面，所述藥效團連接至一部分的所述多糖的胺基。在一個實施方案中，所述阿魏酸結(jié)合至一部分的乙二醇殼聚糖的胺基。在一個實施方案中，所述阿魏酸結(jié)合至約1%到約30%、約1%到約20%、約5%到約30%、約5%到約20%、約5%到約15%或約8%到約15%、約8%到約12%的乙二醇殼聚糖胺。[0173]在本文描述的不同的實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒在溶液中可以具有下述平均直徑:約10 nm至約950 nm、約10 nm至約700 nm、約100 nm至約950 nm、約100nm 至約 500 nm、約 100 nm 至約 400 nm、約 200 nm 至約 400 nm、約 250 nm 至約 350 nm、或約300 nm至約400 nm。也涵蓋其中沒有包括術(shù)語“約”的這些不同的納米粒尺寸范圍。在一個實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢跃哂屑s200納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢跃哂屑s250納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒可以具有約300納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢跃哂屑s320納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢跃哂屑s350納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢跃哂屑s400納米的平均直徑。
[0174]在本文描述的不同的實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢杂糜谥委熒窠?jīng)損傷。在本文描述的其它實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢杂糜谥委熂顾钃p傷。在本文描述的其它實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢杂糜谥委熗鈧阅X損傷。在本文描述的其它實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢杂糜诮佑|受損傷的神經(jīng)。在本文描述的其它實施方案中，所述疏水地修飾的納米粒可以用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)。在本文描述的其它實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢杂米魃窠?jīng)保護劑。
[0175] 在本文描述的某些實施方案中，所述疏水地修飾的納米?？梢耘c患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者對所述聚合納米結(jié)構(gòu)的吸收。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的分布。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的遞送。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的消除。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中器官毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎損傷的減小。
[0176]在另一個實施方案中，提供了一種聚合納米結(jié)構(gòu)。所述聚合納米結(jié)構(gòu)包含疏水芯、親水殼和治療有效量的抗炎劑。
[0177]在本文描述的不同的實施方案中，本文描述的聚合納米結(jié)構(gòu)是膠束。本文中使用的術(shù)語“膠束”是指兩親分子在水中的聚集體，其中非極性部分是在內(nèi)部，且極性部分是在外表面處。
[0178]在本文描述的某些示例性的實施方案中，本文描述的聚合納米結(jié)構(gòu)承載抗炎劑。本文中使用的術(shù)語“承載”包括連接、附著、結(jié)合、綴合等，包括部分地至完全地包封。在一個實施方案中，所述抗炎劑被承載在所述聚合納米結(jié)構(gòu)的疏水結(jié)構(gòu)域中。
[0179]在某些實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)的親水殼組分包含單甲氧基聚(乙二醇)(mPEG) ο在一個示例性的方面，所述mPEG的分子量是約1000 Da至5000 Da、約1500 Da至約 4000 Da、約 2000 Da 至約 5000 Da、約 2000 Da 至約 3000 Da、或約 1500 Da 至約 2500Da。也涵蓋其中沒有包括術(shù)語“約”的這些mPEG尺寸范圍。
[0180]在某些實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)的疏水芯組分包含聚酯。在其它實施方案中，所述聚酯選自--聚ε-己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)和聚(D，L-乳酸)(PDLLA)。在一個實施方案中，所述聚酯是PLGA。在一個示例性的方面，所述PCL、PLGA、PLA 或 PDLLA 具有約 2000 Da 至約 20，000 Da、約 4000 Da 至約 20，000 Da、約2000 Da 至約 16，000 Da、約 4000 Da 至約 16，000 Da、約 8000 Da 至約 16，000 Da、或約 4000Da至約8000 Da的分子量。也涵蓋其中沒有包括術(shù)語“約”的這些尺寸范圍。涵蓋了上述的mPEG的分子量和PCL、PLGA, PLA或TOLLA的分子量的任意組合。
[0181]在某些實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)的抗炎劑組分是皮質(zhì)類固醇。在其它實施方案中，所述皮質(zhì)類固醇選自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍、氫化可的松和可的松。在一個實施方案中，所述皮質(zhì)類固醇是甲潑尼龍。在某些實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)的抗炎劑組分是姜黃素。
[0182]在本文描述的不同的實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)在溶液中可以具有下述平均直徑:約10 nm至約950 nm、約10 nm至約700 nm、約10 nm至約200 nm、約50 nm至約150nm、約 100 nm 至約 950 nm、約 100 nm 至約 500 nm、約 100 nm 至約 400 nm、約 200 nm 至約400 nm、約250 nm至約350 nm、或約300 nm至約400 nm。也涵蓋其中沒有包括術(shù)語“約”的這些不同的納米結(jié)構(gòu)尺寸范圍。在一個實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以具有約200納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以具有約150納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以具有約120納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以具有約100納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以具有約60納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以具有約50納米的平均直徑。
[0183]在本文描述的不同的實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以用于治療神經(jīng)損傷。在本文描述的其它實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以用于治療脊髓損傷。在本文描述的其它實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以用于治療外傷性腦損傷。在本文描述的其它實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以用于接觸受損傷的神經(jīng)。在本文描述的其它實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)。在本文描述的其它實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以用作神經(jīng)保護劑。
[0184]在本文描述的某些實施方案中，所述聚合納米結(jié)構(gòu)可以與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者對所述聚合納米結(jié)構(gòu)的吸收。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的分布。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的遞送。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的消除。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中器官毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎損傷的減小。
[0185]在另一個實施方案中，提供了一種多糖納米粒。所述多糖納米粒包含多糖，其中所述多糖具有高分子量。
[0186]在本文描述的不同的實施方案中，所述多糖具有高分子量。例如，所述多糖的分子量可以是在約50 kDa至約250 kDa之間。在某些實施方案中，所述多糖的分子量是約50kDa。在其它實施方案中，所述多糖的分子量是約75 kDa。在其它實施方案中，所述多糖的分子量是約100 kDa。在某些實施方案中，所述多糖的分子量是約125 kDa。在其它實施方案中，所述多糖的分子量是約150 kDa。在其它實施方案中，所述多糖的分子量是約200kDa。在某些實施方案中，所述多糖的分子量是約250 kDa。
[0187]在本文描述的某些實施方案中，本文描述的多糖納米粒的多糖組分是殼聚糖。在本文描述的其它實施方案中，本文描述的多糖納米粒的多糖組分是殼聚糖衍生物。在本文描述的一個實施方案中，本文描述的多糖納米粒的多糖組分是乙二醇殼聚糖。在本文描述的其它實施方案中，本文描述的多糖納米粒的多糖組分是脂肪酸。
[0188]在本文描述的其它示例性的實施方案中,所述多糖納米粒進一步包含治療有效量的抗炎劑。在某些實施方案中，所述多糖納米粒的抗炎劑組分是皮質(zhì)類固醇。在其它實施方案中，所述皮質(zhì)類固醇選自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲潑尼龍、帕拉米松、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍、氫化可的松和可的松。在一個實施方案中，所述皮質(zhì)類固醇是甲潑尼龍。在某些實施方案中，所述多糖納米粒的抗炎劑組分是姜黃素。
[0189]在本文描述的不同的實施方案中，所述多糖納米粒在溶液中可以具有下述平均直徑:約 10 nm 至約 950 nm、約 10 nm 至約 700 nm、約 100 nm 至約 950 nm、約 100 nm 至約 500nm、約 100 nm 至約 400 nm、約 200 nm 至約 400 nm、約 250 nm 至約 350 nm、或約 300 nm 至
約400 nm。也涵蓋其中沒有包括術(shù)語“約”的這些不同的納米粒尺寸范圍。在一個實施方案中，所述多糖納米?？梢跃哂屑s200納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述多糖納米?？梢跃哂屑s250納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述多糖納米?？梢跃哂屑s300納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述多糖納米?？梢跃哂屑s320納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述多糖納米?？梢跃哂屑s350納米的平均直徑。在一個實施方案中，所述多糖納米?？梢跃哂屑s400納米的平均直徑。
[0190]在本文描述的 不同的實施方案中，所述多糖納米?？梢杂糜谥委熒窠?jīng)損傷。在本文描述的其它實施方案中，所述多糖納米?？梢杂糜谥委熂顾钃p傷。在本文描述的其它實施方案中，所述多糖納米粒可以用于治療外傷性腦損傷。在本文描述的其它實施方案中，所述多糖納米?？梢杂糜诮佑|受損傷的神經(jīng)。在本文描述的其它實施方案中，所述多糖納米粒可以用于修復(fù)受損傷的神經(jīng)。在本文描述的其它實施方案中，所述多糖納米粒可以用作神經(jīng)保護劑。
[0191]在本文描述的某些實施方案中，所述多糖納米粒可以與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者對所述聚合納米結(jié)構(gòu)的吸收。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的分布。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的遞送。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的消除。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中器官毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎損傷的減小。
[0192]在不同的實施方案中，提供了治療患者的神經(jīng)損傷的方法。在一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述疏水地修飾的納米粒。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述聚合納米結(jié)構(gòu)。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述多糖納米粒。前面描述的疏水地修飾的納米粒、聚合納米結(jié)構(gòu)和多糖納米粒的實施方案可適用于本文中描述的方法。[0193]在某些實施方案中，要通過所述方法治療的神經(jīng)損傷是脊髓損傷。在其它實施方案中，要通過所述方法治療的神經(jīng)損傷是外傷性腦損傷。在其它實施方案中，要通過所述方法治療的神經(jīng)損傷是受損傷的神經(jīng)的修復(fù)。
[0194]在某些實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的48小時內(nèi)執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的24小時內(nèi)執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的約I小時至約12小時之間執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的12小時內(nèi)執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的8小時內(nèi)執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的6小時內(nèi)執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的4小時內(nèi)執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的2小時內(nèi)執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用在發(fā)生神經(jīng)損傷的1小時內(nèi)執(zhí)行。
[0195]在本文描述的某些實施方案中，所述方法可以與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者對所述聚合納米結(jié)構(gòu)的吸收。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的分布。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的遞送。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的消除。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中器官毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎損傷的減小。
[0196]在不同的實施方案中，根據(jù)所述方法的施用是注射。在某些實施方案中，所述注射選自:關(guān)節(jié)內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射和皮下注射。在一個實施方案中，所述注射是靜脈內(nèi)注射。
[0197]在其它不同的實施方案中，根據(jù)所述方法的施用作為單次劑量施用來執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用作為多次劑量施用來執(zhí)行。
[0198]在不同的實施方案中，提供了治療患者的神經(jīng)疾病的方法。在一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述疏水地修飾的納米粒。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述聚合納米結(jié)構(gòu)。在另一個示例性的實施方案中，所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的所述多糖納米粒。前面描述的疏水地修飾的納米粒、聚合納米結(jié)構(gòu)和多糖納米粒的實施方案可適用于本文中描述的方法。
[0199]在某些實施方案中，要通過所述方法治療的神經(jīng)疾病是急性神經(jīng)疾病。在其它實施方案中，要通過所述方法治療的神經(jīng)損傷是慢性神經(jīng)疾病。
[0200]在本文描述的某些實施方案中，所述方法可以與患者中的藥代動力學(xué)參數(shù)的改善相關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者對所述聚合納米結(jié)構(gòu)的吸收。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的分布。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的遞送。在一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是所述聚合納米結(jié)構(gòu)在患者中的消除。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中器官毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎毒性的減小。在另一個實施方案中，所述改善的藥代動力學(xué)參數(shù)是患者中腎損傷的減小。
[0201]在不同的實施方案中，根據(jù)所述方法的施用是注射。在某些實施方案中，所述注射選自:關(guān)節(jié)內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射和皮下注射。在一個實施方案中，所述注射是靜脈內(nèi)注射。
[0202]在其它不同的實施方案中，根據(jù)所述方法的施用作為單次劑量施用來執(zhí)行。在其它實施方案中，根據(jù)所述方法的施用作為多次劑量施用來執(zhí)行。
[0203]在不同的實施方案中，提供了藥物制劑。在一個示例性的實施方案中，所述藥物制劑包含所述疏水地修飾的納米粒。在另一個示例性的實施方案中，所述藥物制劑包含所述聚合納米結(jié)構(gòu)。在另一個示例性的實施方案中，所述藥物制劑包含所述多糖納米粒。
[0204]在某些實施方案中，本文描述的藥物制劑進一步包含藥學(xué)上可接受的載體。在某些實施方案中，本文描述的藥物制劑進一步包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑?？梢赃x擇在含有納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的組合物中使用的稀釋劑或載體成分，使得它們不會減少所述納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的期望效果。合適劑型的例子包括納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的水溶液，例如，在等滲鹽水、5%葡萄糖或其它眾所周知的藥學(xué)上可接受的液體載體(諸如醇類、二醇類、酯類和酰胺類)中的溶液。
[0205]“載體”在本文中用于描述制劑中除了活性組分(一種或多種)以外的任何成分。藥學(xué)上可接受的載體部分地取決于要施用的特定組合物以及用于施用所述組合物的特定方法(參見，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1985 年第 17 版))。載體的選擇在較大程度上取決于諸如下述因素:特定給藥模式、載體對溶解度和穩(wěn)定性的影響和劑型的性質(zhì)。在一個示例性的方面，所述載體是液體載體。
[0206]本文中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”包括“獸醫(yī)學(xué)上可接受的”，且因而獨立地包括人和動物應(yīng)用。例如，在本文中提及的“患者”可以是人患者或獸醫(yī)學(xué)患者，諸如馴化的動物(例如，寵物)。
[0207]在某些實施方案中，本文描述的藥物制劑任選地包括一種或多種其它治療成分。本文中使用的術(shù)語“活性成分”或“治療成分”表示治療活性化合物、及其任何前藥、以及所述化合物和所述前藥的藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和溶劑合物?？梢詫⑵渌钚猿煞峙c所述的納米粒或納米結(jié)構(gòu)相組合，且可以單獨施用或在同一藥物制劑中施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于使用描述的納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的治療，可以容易地確定要施用的其它活性成分的量。
[0208]在某些實施方案中，本文描述的藥物制劑是單一單位劑量。本文中使用的術(shù)語“單位劑量”是包含預(yù)定量的所述的納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的組合物的個別量。所述的納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的量通常等于要施用給動物的所述納米粒或納米結(jié)構(gòu)的劑量或這樣的劑量的方便的分數(shù)(例如，這樣的劑量的1/2或1/3)。
[0209]藥學(xué)上可接受的鹽和用于制備藥學(xué)上可接受的鹽的普通方法是本領(lǐng)域已知的，且被包括在本文描述的組合物的定義內(nèi)。參見，例如，P.Stahl,等人，Handbook ofPharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/ffiley-VCH, 2002);S.M.Berge,等人,“Pharmaceutical Salts, ”Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷，第I期，1977年I月。
[0210]可以將本文描述的組合物和它們的鹽配制為用于全身性施用的藥物組合物。用于人類和非人哺乳動物的這樣的藥物組合物和制備它們的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，remington: The Science and practice of pharmacy, (1995) A.Gennaro,等人編，第19版，Mack Publishing C0.。在包含納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的藥物制劑中可以包括其它活性成分或其鹽。
[0211 ] 在一個示例性的實施方案中，與疏水地修飾的納米粒一起用于胃腸外施用的藥物制劑包含:a)疏水地修飾的納米粒；b)藥學(xué)上可接受的pH緩沖劑，以提供在約pH 4.5至約pH 9范圍內(nèi)的pH ；c)離子強度調(diào)節(jié)劑，其在約O至約300毫摩爾的濃度范圍內(nèi)；和d)水溶性的粘度調(diào)節(jié)劑，其在總制劑重量的約0.25%到約10%的濃度范圍內(nèi)，或者提供了 a)、b)、c)和d)的任意組合。
[0212]在一個示例性的實施方案中，與聚合納米結(jié)構(gòu)一起用于胃腸外施用的藥物制劑包含:a)聚合納米結(jié)構(gòu)；b)藥學(xué)上可接受的pH緩沖劑，以提供在約pH 4.5至約pH 9范圍內(nèi)的pH;c)離子強度調(diào)節(jié)劑，其在約O至約300毫摩爾的濃度范圍內(nèi)；和d)水溶性的粘度調(diào)節(jié)劑，其在總制劑重量的約0.25%到約10%的濃度范圍內(nèi)，或者提供了 a)、b)、c)和d)的任意組合。
[0213]在一個示例性的實施方案中，與多糖納米粒一起用于胃腸外施用的藥物制劑包含:a)多糖納米粒；b)藥學(xué)上可接受的pH緩沖劑，以提供在約pH 4.5至約pH 9范圍內(nèi)的pH ；c)離子強度調(diào)節(jié)劑，其在約O至約300毫摩爾的濃度范圍內(nèi)；和d)水溶性的粘度調(diào)節(jié)劑，其在總制劑重量的約0.25%到約10%的濃度范圍內(nèi)，或者提供了 a)、b)、c)和d)的任意組合。
[0214]在不同的示例性的實施方案中，用于本文描述的組合物和方法中的pH緩沖劑是技術(shù)人員已知的那些試劑，且包括,例如，乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖齊?、以及鹽酸、氫氧化鈉、氧`化鎂、磷酸一鉀、碳酸氫鹽、氨、碳酸、鹽酸、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸、磷酸氫二鈉、硼砂、硼酸、氫氧化鈉、二乙基巴比妥酸和蛋白，以及各種生物學(xué)緩沖劑，例如，TAPS、N，N-二(羥乙基)甘氨酸、Tris、三(羥甲基)甲基甘氨酸、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸鹽或MES。
[0215]在另一個示例性的實施方案中，所述離子強度調(diào)節(jié)劑包括本領(lǐng)域中已知的那些試劑，例如，甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖、右旋糖、山梨醇、氯化鈉、氯化鉀和其它電解質(zhì)。
[0216]有用的粘度調(diào)節(jié)劑包括、但不限于:離子型和非離子型水溶性聚合物；交聯(lián)的丙烯酸聚合物諸如“卡波姆”家族的聚合物，例如，可在Carbopol?商標(biāo)下商業(yè)得到的羧基聚亞烷基(carboxypolyalkylenes);親水聚合物諸如聚氧化乙烯、聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纖維質(zhì)聚合物和纖維質(zhì)聚合物衍生物諸如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素、和醚化的纖維素；樹膠諸如黃蓍膠和黃原膠；海藻酸鈉；明膠、透明質(zhì)酸及其鹽、殼聚糖、膠凝糖或它們的任意組合。通常，使用非酸性的粘度增強劑，諸如中性或堿性試劑，以便促進實現(xiàn)所述制劑的期望的pH。
[0217]在一個示例性的方面，可以將胃腸外制劑適當(dāng)?shù)嘏渲茷闊o菌的非水性溶液或干燥形式，所述干燥形式將與合適的媒介物(諸如無菌的無熱原的水)結(jié)合使用。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準制藥技術(shù)，可以容易地在無菌條件下(例如，通過低壓凍干法)制備胃腸外制劑。[0218]通過常規(guī)低壓凍干法，根據(jù)本發(fā)明的水性制劑可以用于生產(chǎn)凍干粉劑或粉劑。通過將凍干粉劑溶解于水或其它水溶液中，再次獲得根據(jù)本發(fā)明的制劑。也被稱作冷凍干燥的術(shù)語“低壓凍干法”是用于呈遞蛋白質(zhì)的通常使用的技術(shù)，其用于從感興趣的蛋白質(zhì)制劑中除去水。低壓凍干法是這樣的方法:通過該方法，首先冷凍待干燥的物質(zhì)，然后通過在真空環(huán)境中升華除去冰或冷凍溶劑?？稍陬A(yù)低壓凍干的制劑中包含賦形劑，以增強在冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性和/或改善低壓凍干的產(chǎn)品在貯存后的穩(wěn)定性。例如，參見Pikal，Μ.Biopharm.3(9)26-30 (1990)和 Arakawa 等人.Pharm.Res.8(3):285-291 (1991)。
[0219]在一個實施方案中，通過使用適當(dāng)?shù)闹苿┘夹g(shù)，諸如摻入溶解度增強劑，可以增加在胃腸外制劑的制備中使用的納米粒或納米結(jié)構(gòu)的溶解度。
[0220]在不同的實施方案中，可以將用于胃腸外施用的制劑配制為立即釋放和/或改良釋放(modified release)。改良釋放制劑包括延遲的、持續(xù)的、脈沖的、受控的、祀向的和程序化的釋放制劑。因而，可以將納米粒或納米結(jié)構(gòu)配制為固體、半固體或觸變液體，用于作為植入貯庫來施用，從而提供活性化合物的改良釋放。
[0221]可以將所述制劑呈現(xiàn)在單位劑量或多次劑量密封容器(諸如安瓿和管形瓶)中。還可以將所述制劑呈現(xiàn)在注射器(諸如預(yù)裝注射器)中。
[0222]在不同的實施方案中，所述納米粒或納米結(jié)構(gòu)的劑量可以隨患者狀況和神經(jīng)損傷或神經(jīng)疾病的嚴重程度而顯著變化。要施用給患者的有效量是基于體表面積、患者重量或質(zhì)量、以及醫(yī)師對患者狀況的評估。
[0223]通過標(biāo)準方法，例如通過在實驗動物模型中或在臨床試驗中的人類中建立劑量-響應(yīng)曲線，可以確定納米?；蚣{米結(jié)構(gòu)的合適劑量。示例性地，納米粒或納米結(jié)構(gòu)的合適劑量(在單次快速推注中施用或隨時間施用)包括:約I pg/kg至約lOPg/kg、約I pg/kg 至約 lKg/kg、約 100 pg/kg 至約 500 ng/kg、約 I pg/kg 至約 I ng/kg、約 I pg/kg 至約500 pg/kg、約 100 pg/kg 至約 500 ng/kg、約 100 pg/kg 至約 100 ng/kg、約 I ng/kg 至約10 mg/kg、約 I ng/kg 至 I mg/kg、約 I ng/kg 至約 lKg/kg、約 I ng/kg 至約 500 ng/kg、約100 ng/kg 至約 500Pg/kg、約 100 ng/kg 至約 100Pg/kg、約 I μ g/kg 至約 500 μ g/kg、或約I μ g/kg至約100 μ g/kg。在這些實施方案中的每一個中,劑量/kg表示每千克患者或動物質(zhì)量或體重的劑量。
[0224]實施例1
姜黃素會減輕神經(jīng)元細胞損傷和有效地促進SCI大鼠的功能恢復(fù)體外研究表明，姜黃素可在H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型中有效地減輕細胞凋亡。在外傷性脊髓損傷(SCI)以后2小時，將加載姜黃素的、疏水地修飾的乙二醇殼聚糖(HGC)納米粒施用給一組5只Long Evans大鼠。如Basso Beattie Bresnahan (BBB)運動分級評分增加至第14天的13.8平均值所證實的，所有大鼠表現(xiàn)出顯著的功能恢復(fù)。在用鹽水治療的對照組中，在第14天的平均BBB評分為6.4 (參見圖1)。
[0225]在一個單獨實驗中，HGC納米粒具有12小時的血液半衰期時間(參見圖2)。HGC納米粒的增加的循環(huán)時間會確保載體和藥物向損傷部位的遞送。這些數(shù)據(jù)顯示了鼓舞人心的證據(jù):通過使用包封了姜黃素的兩親聚合物的自組裝納米結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了延長的治療時間窗。
[0226]實施例2聚合物納米結(jié)構(gòu)的制備和表征
延長膠束治療的治療時間窗的一種有效方式是，將抗炎劑包封進膠束的疏水芯中，從而將靶向原發(fā)性和繼發(fā)性損傷。平行地，一項單獨的研究證實，具有不同疏水鏈的mPEG-聚酯膠束會在復(fù)合動作電位的恢復(fù)中表現(xiàn)出不同的效率，這指示兩親性質(zhì)在膜修復(fù)中的關(guān)鍵作用。因而，基于兩種因素來設(shè)計膠束的疏水芯:抗炎劑的加載效率和膜修復(fù)效力。
[0227]大多數(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于SCI治療的抗炎藥是類固醇和衍生物諸如糖皮質(zhì)激素(glucocoticoid)、甲潑尼龍、琥拍酸鈉和納洛酮。但是，已經(jīng)證實高劑量類固醇會增加SCI患者的傷口感染、肺炎、膿毒癥和因呼吸系并發(fā)癥而死亡的風(fēng)險。非留體類抗炎藥通常是酶特異性的或免疫選擇性的，這需要選擇性的酶和免疫途徑的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)。
[0228]姜黃素(分離自作為傳統(tǒng)的食品成分的姜黃QCurcuina Awga)的姜黃根)具有獨特的性能。在藥理學(xué)研究中，姜黃根表現(xiàn)出抗腫瘤、抗炎和抗傳染活性，且具有低毒性。具體地，已經(jīng)證實，姜黃素會抑制腫瘤壞死因子(TNF)，減量調(diào)節(jié)白介素(IL)-l、IL-6、IL-8和趨化因子，增加細胞內(nèi)的谷胱甘肽的表達，抑制脂質(zhì)過氧化作用，和通過它的結(jié)合鐵的能力而起抗氧化劑作用。姜黃素已經(jīng)被應(yīng)用于疾病諸如阿爾茨海默氏病、帕金森病、癌癥和其它疾病。姜黃素的臨床應(yīng)用面臨的一個重大挑戰(zhàn)是它的快速的全身消除。因而，需要向靶組織遞送姜黃素的穩(wěn)定載體。
[0229]使用透析方法制備不同分子量的mPEG-聚酯，并將姜黃素裝載進膠束的疏水芯中。表征了姜黃素的加載效率和姜黃素-膠束復(fù)合物在血清中的穩(wěn)定性。與嵌段共聚物的應(yīng)用平行地，合成了具有被阿魏酸(FA)修飾的側(cè)鏈的乙二醇殼聚糖。由于延長的血液停留半衰期，乙二醇殼聚糖納米粒已經(jīng)被廣泛地用作抗癌藥物的載體。因為FA是姜黃素水解的一種產(chǎn)物，預(yù)期所述修飾不僅會引入兩親性，而且會根據(jù)相似相溶定律增強姜黃素的加載效率。與mPEG-PDLLA相比，殼聚糖的胺基會幫助將所述聚合物附著于帶負電荷的細胞膜，這會促進疏水側(cè)鏈向脂質(zhì)膜中的插入以及姜黃素的細胞攝取。
[0230]A.自組裝的mPEG-聚酯膠束的制備和姜黃素的加載
通過開環(huán)聚合(Liggins等人(2002) Adv Drug Deliv Rev 54:191-202,通過引用并入本文)，合成T mPEG-PCL (聚ε -己內(nèi)酯)、mPEG_PLGA (聚乳酸-乙醇酸)和mPEG-PLA (聚乳酸)。PLA、PCL、PLGA的分子量為4000，PEG的分子量為2000，與在初步研究中使用的mPEG-PDLLA的分子量相同。
[0231]為了試驗隨著親水親脂平衡值而變化的膜修復(fù)效率，通過D，L-丙交酯的開環(huán)聚合，合成了具有不同I3DLLA分子量(4000、8000、16000 Da)的mPEG (2000)-PDLLA共聚物。使用不同的D，L乳酸與甲氧基PEG進料比來制備具有不同的D，L乳酸聚合程度的mPEG-PDLLA共聚物。在所有情況下，通過膜透析來制備膠束。通過監(jiān)測被捕集在膠束疏水芯中的芘的熒光行為，測量CMC (Schild等人(1991) Langmuir 7:665-671,通過引用并入本文)。通過動態(tài)光散射，確定膠束的直徑。使用在IH NMR譜中的質(zhì)子峰強度，測量疏水塊的數(shù)量平均分子量，在運行于500 MHz的Varian Unity Inova 500NB譜儀(Palo Alto, CA)上記錄所述IH NMR譜。
[0232]通過疏水相互作用，將姜黃素加載進mPEG-PDLLA膠束的芯中。將溶解在丙酮或二甲亞砜(DMSO)中的mPEG-PDLLA共聚物和姜黃素放入多孔透析管(Spectra/Pro)中，隨后針對4 L蒸餾水在25°C透析超過24 h。改變聚合物與藥物的進料比，以發(fā)現(xiàn)最大藥物加載含量和最佳加載效率。將得到的溶液在-80°C冰柜中冷凍，并使用冷凍干燥器FD-5N(EYELA, Tokyo,日本)干燥。在施用當(dāng)天，通過使用聲處理將凍干粉末溶解在PBS溶液中，制備新鮮的加載姜黃素的膠束溶液。
[0233]B.加載姜黃素的膠束的表征 1.膠束大小和穩(wěn)定性
膠束大小是與在血流中的溶解效率和活性相關(guān)的重要參數(shù)。通過透射電子顯微術(shù)(TEM; Philips CM 10, 80kV)，測量處于干燥狀態(tài)的顆粒的大小(Lee等人(2007)Biomacromolecules 8:202-208，通過引用并入本文)。通過動態(tài)光散射(DLS,與PD2000DLS檢測器連接的PDLLS/Batch DLS儀器，Precision Detectors)，測量空膠束或加載姜黃素的膠束在水性條件中的大小。通過大小在水性水和血清中隨著時間的變化，確定這些膠束的穩(wěn)定性。通過ZetaPALS (Brookhaven Instruments),測量表明聚合物膠束的凈電荷的ζ電位。[0234]2.藥物加載量和效力
為了定量姜黃素在膠束載體中的增加的溶解度，測量了藥物加載量和效力。將藥物加載量定義為加載的藥物與膠束的重量比。藥物加載效率是摻入膠束中的藥物相對于在膠束化中使用的藥物的初始量的百分比。簡而言之，將I mg冷凍干燥的加載姜黃素的膠束溶解在ImL DMSO中，使得膠束解離并釋放出姜黃素。使用紫外光譜測定法(Spectra Max M5,Molecular Devices)通過分光光度計法在427 nm測量姜黃素的熒光。基于含有預(yù)定量的姜黃素的標(biāo)準樣品集合，計算藥物加載量和加載效力。
[0235]3.藥物釋放
靜脈內(nèi)注射后，姜黃素被釋放進血液中，其中親脂組分(例如白蛋白)充當(dāng)漏槽條件(sink condition)。為了測量姜黃素的釋放動力學(xué)，將2 mg/ml加載姜黃素的膠束分散在勒緊的透析袋中，并置于裝有40 mL PBS (pH 7.4，含有15%血清)的玻璃瓶中。在研究過程中，在維持于37°C的恒溫水槽中搖動所述玻璃瓶。在預(yù)定的時間間隔采集大約1.0 mL釋放介質(zhì)，并補充相同體積的PBS/血清。通過分光光度計法在DMSO中測量釋放的姜黃素的累積量，并使用姜黃素在DMSO中的標(biāo)準曲線計算釋放的姜黃素的濃度。可以一式三份地進行所有實驗。
[0236]實施例3
HGC納米粒的制各和表征 A.加載姜黃素的HGC納米粒的制備
為了合成具有不同分子量和疏水性的疏水地修飾的乙二醇殼聚糖(HGC)納米粒，使用酸性降解方法制備具有不同分子量(250、100和50 kDa)的乙二醇殼聚糖(GC)。然后，通過綴合阿魏酸(FA)，疏水地修飾GC，所述阿魏酸是姜黃素水解的一種產(chǎn)物(參見圖3a)。通過控制FA與GC的綴合程度，可以調(diào)控疏水性。詳細地講，將50 mg GC (分子量為50、100或250 kDa)溶解在15 ml去離子水中，然后用甲醇(15 ml)稀釋，并與FA (3.5、7.0和10.5mg,這對應(yīng)于GC中10、20和30 mol%的伯胺)混合。通過加入比FA 1.5倍摩爾過量的EDC/NHS,開始FA中的羧基與GC中的胺基的綴合。將得到的溶液在室溫輕輕渦旋24小時，針對過量的水/甲醇(1:4體積比)透析(分子截止值=12 kDa) 72小時，隨后針對去離子水透析，并將產(chǎn)物低壓凍干，得到HGC (參見圖3b)。[0237]使用溶劑蒸發(fā)方法將姜黃素包封進HGC納米粒中。將HGC和姜黃素都溶解在由水和甲醇(1:1體積比)制成的共溶劑中。隨著甲醇的蒸發(fā)，水溶液中的HGC會疏水地自組裝進由親水殼和疏水芯組成的納米粒中(參見圖3c)。詳細地講，將HGC (5 mg)溶解在去離子水(2.5 ml)中，并與在甲醇(2.5 ml)中的姜黃素溶液(1.25 mg, 20重量％)混合。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，除去混合物溶液中的甲醇。初步數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)A-綴合的乙二醇殼聚糖有效地增加姜黃素在PBS溶液中的溶解度(參見圖3d)。對于包封在HGC納米粒中的姜黃素而言，在I個月內(nèi)沒有觀察到沉淀。
[0238]B.加載姜黃素的HGC納米粒的表征
通過凝膠滲透色譜法(GPC)，測量酸降解的GC的分子量。通過膠體滴定(Kwon等人(2003) Langmuir 19:10188-10193，通過引用并入本文)和 FA 在 DMSO 中在 250-350 nm的紫外吸光度，確定FA與GC的綴合程度。使用與前述相同的方法，檢驗姜黃素在HGC中的加載量和加載效力。使用前述的方法，進行加載姜黃素的HGC納米粒的生理化學(xué)性能的測量和姜黃素釋放試驗。另外，使用X-射線衍射來確定在納米粒內(nèi)的姜黃素的結(jié)晶程度。
[0239]制備了兩類兩親聚合物:不同分子量的PEG-聚酯和FA-修飾的乙二醇殼聚糖。將表現(xiàn)出不同疏水性且能夠加載姜黃素的聚合納米結(jié)構(gòu)的集合準備好用于細胞試驗、離體試驗和體內(nèi)試驗。在下述部分中，將使用“聚合納米結(jié)構(gòu)”表示PEG-聚酯膠束和/或FA-修飾的HGC納米粒。除了 DLS測量以外，使用F0rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)光譜法來監(jiān)測膠束在血清中的穩(wěn)定性。如以前所述，將FRET對DiIC18(3)和DiOC18(3)加載進膠束中(Chen等人(2008) Proc Natl AcacI Sci USA 105:6596-6601，通過引用并入本文)。通過監(jiān)測 FRET效率，實時監(jiān)測芯加載的探針向周圍介質(zhì)中的釋放。
[0240]實施例4
使用光聲膜穿孔模型確定聚合納米結(jié)構(gòu)的細胞挽救效率` 篩選在實施例2和3中制備的膠束和HGC納米粒，以鑒別能夠在延長的時間窗中挽救受損傷細胞的納米結(jié)構(gòu)，和更好地理解疏水性如何影響聚合物-膜相互作用。使用光聲膜穿孔模型來模仿外傷性細胞損傷。通過將細胞對不同分子量的熒光標(biāo)記的葡聚糖的攝取成像，定量膜密封效率。通過細胞凋亡和壞死測定、以及炎癥標(biāo)志物，測定細胞。
[0241]A.光聲膜穿孔模型
已經(jīng)建立了涉及祀向細胞表面的金納米棒(gold nanorods)的飛秒(fs)激光福照的膜穿孔模型(Tong等人(2007) Adv Mater 19:3136-3141，通過引用并入本文)。在該模型中，用帶正電荷的肽(八精氨酸，R8)綴合納米棒表面，用于將所述納米棒連接至帶負電荷的細胞表面。因為尺寸效應(yīng)，即，這些納米棒的流體動力學(xué)直徑是約100 nm，所述納米棒在進入細胞之前在細胞表面上停留至少I小時。納米棒的激光輻照會通過等離子體吸收和光能向納米棒中的聲子能的弛豫而產(chǎn)生光熱效應(yīng)。納米棒的熱膨脹會產(chǎn)生損害細胞膜的完整性的爆炸聲波(或機械波)。質(zhì)膜的穿孔會導(dǎo)致Ca2+向細胞中的流入和隨后鈣蛋白酶的活化，所述鈣蛋白酶會降解細胞骨架和造成質(zhì)膜的起泡。可以用碘化丙啶(一種壞死標(biāo)志物)標(biāo)記受損傷的細胞(參見圖4)。該方法高度模仿外傷損傷以后的神經(jīng)元細胞膜的損傷。在沒有激光輻照下，我們以前已經(jīng)證實，R8-綴合的納米棒(R8-NR)沒有對細胞造成毒性。
[0242]為了使用該模型篩選膜修復(fù)劑，在膠原包被的96-孔板中生長PC12細胞(關(guān)于模仿神經(jīng)元細胞)，并與R8-NR (0.D.1, 10μ1) —起溫育I小時。在激光輻照之前，通過雙光子發(fā)光(TPL)成像，證實R8-NR在細胞表面上的結(jié)合。在用PBS洗滌以后，使用具有130 fs脈沖寬度和80 MHz重復(fù)率的fs T1:藍寶石激光器(MaiTai HP, Spectra-Physics)，通過激光輻照誘導(dǎo)膜穿孔。將激光器調(diào)至R8-NR的等離子體共振峰的波長。通過定量具有不同分子量(例如4 KDaUO KDa,70 KDa)的葡聚糖-FITC的細胞攝取，試驗孔在質(zhì)膜上的形成和孔徑。在輻照之前，加入葡聚糖-FITC。對于每種類型的葡聚糖-FITC，優(yōu)化輻照條件(激光能量、福照時間)以誘導(dǎo)至少80%的細胞為可透過的。在Weldon School of BiomedicalEngineering中，使用Olympus FV1000共焦顯微鏡觀察細胞。
[0243]B.試驗方法
1.細胞生存力
使用標(biāo)準的細胞凋亡試劑盒(Invitrogen)確定細胞死亡，所述試劑盒包括AlexaFluor 680膜聯(lián)蛋白V (用于指示早期細胞凋亡)和碘化丙啶(用于標(biāo)記壞死)。如以前所述，在處理后，將共5PL Alexa Fluor 680膜聯(lián)蛋白V和WL碘化丙啶(lOOPg/mL)加給細胞或者不經(jīng)處理作為對照(Tong等人(2009) Nanomedicine 4:265-276,通過引用并入本文)。還獨立地進行MTT測定以定量細胞死亡。在激光輻照和處理以后，將IOPL MTT溶液(5 mg/mL，在PBS中)加入96孔板的每個孔中，并在37°C溫育3小時。除去培養(yǎng)基以后，將200KL DMSO加入每個孔中，并使用分光光度計(SpectraMAX 190, Molecular DevicesCorp., CA)在570 nm讀出光密度。在光聲穿孔后24小時，評估細胞生存力。
[0244]2.細胞膜完整性
通過加入葡聚糖-羅丹明(在輻照前)和葡聚糖-cy5.5 (在輻照后的不同時間點)，試驗細胞質(zhì)膜的密封。一旦細胞膜被修復(fù)，葡聚糖_cy5.5的攝取被停止。通過(Nrho陽性-Ncy5.5陽性)/Nrho陽性,計算細胞挽救的百分比,其中N是被羅丹明或cy5.5標(biāo)記的細胞的數(shù)目。用共焦顯微鏡拍攝圖像，并通過ImageJ軟件計數(shù)細胞的數(shù)目。
[0245]3.細胞內(nèi)炎癥
使用細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)作為炎癥的標(biāo)志物。處理后24小時，將羧基-H2DCFDA(Invitrogen)( 一種ROS指示劑)加給細胞，并溫育30分鐘。用共焦顯微鏡拍攝圖像。對比處理組和對照組之間的強度，以表征ROS的量。
[0246]4.實驗設(shè)計
為了確定細胞挽救效率，將PC12細胞分成4組:組I含有沒有經(jīng)過光聲穿孔的細胞，組2含有在光聲穿孔以后用加載姜黃素的聚合納米結(jié)構(gòu)處理過的細胞，組3含有在光聲穿孔以后用不含姜黃素的聚合納米結(jié)構(gòu)處理過的細胞，組4含有僅經(jīng)過光聲穿孔處理的細胞。為了檢驗聚合納米結(jié)構(gòu)在穿孔和施用之間的不同延遲時間時的有效性，分別在組2和組3中在光聲穿孔后15分鐘、I小時、2小時和6小時，將納米結(jié)構(gòu)加入細胞培養(yǎng)溶液中。使用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)試驗來統(tǒng)計對比不同處理的效率。
[0247]鑒別出有效的納米 結(jié)構(gòu)，并進一步檢驗劑量響應(yīng)，以提供用于離體和體內(nèi)研究的給藥方案的參考。如以前的研究所示(Shi等人(2010))，當(dāng)施用給脊髓組織時，低至3.3μΜ的mPEG-PDLLA共聚物是有效的，因此，在光聲穿孔以后，將具有0.33μΜ、3.3μΜ、33μΜ和330μΜ的單聚體(unimer)濃度的聚合納米結(jié)構(gòu)應(yīng)用于在96-孔板中培養(yǎng)的細胞。
[0248]在本文中認為膜密封取決于所述聚合物的兩親性質(zhì)?？梢澡b別出許多能夠密封受損傷的膜并且還經(jīng)由加載的姜黃素而抑制細胞內(nèi)炎癥的聚合納米結(jié)構(gòu)。最佳納米結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)具有良好的細胞挽救效力，具有至少2小時的延遲時間。因為電荷和大小都會影響分子在組織環(huán)境中的擴散，將在實施例5中試驗具有不同大小和電荷性能的、在細胞水平有效的納米結(jié)構(gòu)。
[0249]膜穿孔的一種替代方法是使用可在Purdue University Bindley BioscienceCenter得到的、激光實現(xiàn)的分析和加工(LEAP)儀器。
[0250]實施例5
用納米級修復(fù)劑處理過的離體脊髓的功能和形態(tài)應(yīng)答的確定在實施例4中的細胞研究提供了快速篩選大量候選納米結(jié)構(gòu)的方法。在本實施例中確定了對這些納米結(jié)構(gòu)的組織水平功能和形態(tài)應(yīng)答。脊髓組織是更緊湊的，且與細胞培養(yǎng)條件相比可能不會被聚合納米結(jié)構(gòu)容易地達到。功能測量會為進一步的體內(nèi)研究提供重要的選擇標(biāo)準。作為例子，將分離自成年豚鼠的脊髓壓傷，用在實施例4中選擇的、加載了姜黃素的候選納米結(jié)構(gòu)處理，并通過電生理學(xué)測量和形態(tài)學(xué)研究進行評估。
[0251]A.用雙蔗糖間隙記錄室記錄CAP
按照在(Wang等人(2005) Biophys J 89:581-591,通過引用并入本文)中描述的操作，進行脊髓白質(zhì)的分離。
[0252]使用雙蔗糖間隙記錄室，記錄CAP (參見圖5)。將分離的豚鼠脊髓白質(zhì)的4.0 cm長條支持在中央隔室中，并連續(xù)灌注在37°C維持在水浴中的充氧的Krebs氏溶液(約2.0ml/min)。使脊髓條的游離端穿過蔗糖間隙通道至裝有等滲(120 mM)氯化鉀的側(cè)隔室。使用塑料蓋玻片碎片和少量硅脂(用于將所述蓋玻片附著于通道壁并在組織周圍密封)，將所述白質(zhì)條密封在蔗糖間隙通道的任一側(cè)上。使等滲蔗糖溶液(230 mM)以1.0 ml/min的速率連續(xù)跑過間隙通道。通過位于側(cè)室 和中央浴槽內(nèi)的銀/氯化銀絲電極，在白質(zhì)條的相對末端處刺激軸突，并記錄CAP。調(diào)節(jié)刺激(呈0.1 ms持續(xù)時間的雙極矩形脈沖的形式)至最小振幅，其會產(chǎn)生每種樣品的完全動作電位。
[0253]B.壓傷和處理
通過將脊髓不斷置于5-30秒擠壓而產(chǎn)生壓傷，使用改進的鑷子處理隔離物，直到CAP下降至O mV (Luo等人(2002) J Neurochem 83:471-480,通過引用并入本文)。對于膠束的局部施用，在損傷以后，立即將脊髓白質(zhì)條保持于以2.0 ml/min的速度灌注的Krebs氏溶液中。然后停止灌注，并在壓傷后15分鐘、I小時、2小時和4小時，以通過實施例4確定的期望濃度，將聚合納米結(jié)構(gòu)輕輕加入中央隔室內(nèi)的Krebs氏溶液中。在處理10分鐘以后，用Krebs氏溶液徹底沖洗脊髓條。貫穿整個實驗，所有溶液都富含95% 02/5% C02。
[0254]C.用于監(jiān)測Ca2+向軸突中的進入的多模態(tài)NLO成像
已經(jīng)開發(fā)了多模態(tài)NLO顯微鏡，其在同一個平臺上組合了 CARS和TPEF (Chen等人(2009) Opt Express 17:1282-1290,通過引用并入本文)。使用髓鞘的CARS成像來定義軸突內(nèi)空間。為了監(jiān)測鈣向軸突中的進入，將脊髓樣品在不含Ca2+的Krebs氏溶液中預(yù)溫育 30 min,隨后在含有 40 μ M Oregon Green 488 BAPTA-2 AM (Sigma)的不含 Ca2+ 的Krebs氏溶液中溫育2小時。此后，將健康脊髓對照組在含有Ca2+的正常的充氧的Krebs氏溶液中溫育I小時；對損傷脊髓的對照組進行擠壓，然后在含有Ca2+的正常的充氧的Krebs氏溶液中溫育I小時；對納米結(jié)構(gòu)治療組進行擠壓，然后以在Aim 2中鑒別出的濃度，在補充了聚合納米結(jié)構(gòu)的充氧的Krebs氏溶液中溫育I小時。通過2個520/40帶通過濾器(Ealing Catalog Inc.),傳送Oregon Green的TPEF信號，并通過外部光電倍增管(H7422-40, Hamamatsu)進行檢測。使用 FluoView 軟件(Olympus,日本東京)合并 TPEF和CARS圖像，并定量軸突內(nèi)的TPEF強度。
[0255]D.抗炎應(yīng)答的測量
通過勻漿化的脊髓組織中的IL-1和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3水平的蛋白質(zhì)印跡法，試驗了姜黃素的抗炎作用。通過測量脂質(zhì)過氧化作用的程度和受損傷組織內(nèi)的谷胱甘肽的含量，確定了姜黃素在減少氧化應(yīng)激中的作用。
[0256] E.實驗設(shè)計
使用得自成年雌性豚鼠(350-500 g體重)的脊髓腹側(cè)白質(zhì)。將脊髓分成3組，分別用加載姜黃素的mPEG-聚酯膠束、加載姜黃素的HGC和鹽水處理。試驗了 mPEG-聚酯膠束和HGC0在SCI后15分鐘、I小時、2小時和4小時，施用膠束和HGC。這些時間點會產(chǎn)生每種納米結(jié)構(gòu)的時間依賴性的曲線。對于CAP測量而言，使用10條各自具有4.5 cm長度的脊髓來試驗每種施用。將Ι-cm區(qū)段的脊髓用于成像實驗和抗炎應(yīng)答的測量(η = 5/試驗)。
[0257]還可以使用3種具有不同分子量的分子測定質(zhì)膜損傷:溴化乙錠(ΕΒ， 400Da)，辣根過氧化物酶(HRP，MW 44kDa，VI型)和乳酸脫氫酶(LDH，MW 140kDa)。將EB和HRP加入溶液中，并監(jiān)測EB和HRP通過脊髓組織的膜裂口的攝取。定量EB陽性細胞和HRP標(biāo)記的軸突的數(shù)目。LDH通常被限制在細胞內(nèi)，因為它不能穿過完整膜。因此，該酶向細胞外空間的滲漏會指示膜破裂。為了檢測LDH釋放，在每次處理結(jié)束時收集浸泡脊髓組織的溶液?？焖俚貙⒓顾杞M織勻漿化，并通過乳酸脫氫酶試驗試劑盒(Sigma，MO)評估殘余的組織LDH。
[0258]實施例5在組織水平確定了所述聚合納米結(jié)構(gòu)的膜密封效應(yīng)和抗炎效應(yīng)。最佳納米結(jié)構(gòu)或納米粒應(yīng)具有良好的促進CAP恢復(fù)的效力，具有至少2小時的延遲時間，且可以用于實施例6中。
[0259]實施例6
使用挫傷SCI模型確定由加載姜黃素的共聚物膠束和HGC納米粒介導(dǎo)的解剖學(xué)恢復(fù)和功能恢復(fù)
先前的研究表明了 mPEG-PDLLA膠束在比PEG低IO5量級的濃度在恢復(fù)受損傷的脊髓白質(zhì)組織的CAP中的有效性。此外，已經(jīng)證實，靜脈內(nèi)施用的mPEG-PDLLA膠束能夠顯著改善擠壓脊髓損傷的Long-Evans大鼠模型的運動功能(參見圖1)。
[0260]為了確定由mPEG-聚酯納米結(jié)構(gòu)和/或HGC納米粒介導(dǎo)的SCI后的解剖學(xué)恢復(fù)和功能恢復(fù)，可以在臨床上有關(guān)的成年大鼠挫傷損傷模型中通過尾靜脈施用聚合納米結(jié)構(gòu)，并可以通過使用生理學(xué)、行為學(xué)和形態(tài)學(xué)評估的組合來檢驗所述結(jié)果。在圖6中解釋了體內(nèi)研究的流程圖，下面詳述了方法。
[0261]A.體內(nèi)脊髓損傷模型
計算機控制的撞擊挫傷被SCI研究團體廣泛地使用。簡而言之，使用多中心動物脊髓損傷研究(Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study,MASCIS)脊髓撞擊器,通過 10g棒從12.5 mm高度的落重法，可以誘導(dǎo)中等挫傷損傷。詳細的操作描述于(Cao等人(2005)Experimental Neurology 191: S3-S16 ;和 Titsworth 等人(2009) Glia 57:1521-1537, 二者通過引用并入本文)。[0262]B.生物利用度測定
通過尾靜脈或頸靜脈注射，可以遞送聚合納米結(jié)構(gòu)或HGC納米粒。認為加載姜黃素的納米結(jié)構(gòu)或納米粒會穿透損傷的血液-脊髓屏障(BSCB)和以高濃度積累在損傷部位處。為了促進穿透，如果必要的話，可以鞘內(nèi)地或通過直接注射進脊髓實質(zhì)中來遞送納米結(jié)構(gòu)或納米粒。
[0263]自發(fā)熒光姜黃素和cy5.5標(biāo)記的共聚物可以用于生物利用度研究?？梢栽谧⑸浼{米結(jié)構(gòu)以后24小時，提取包括脊髓在內(nèi)的器官，并在具有50 μ m空間分辨率的CaliperIVIS Lumina II上進行檢查。使用共焦顯微鏡，可以觀察載體和姜黃素在細胞水平的生物分布。
[0264]對于生物利用度測定，還可以使用同位素標(biāo)記的姜黃素作為外標(biāo)，使用質(zhì)譜法來確定姜黃素(MW 368)在每個提取的器官中的濃度。
[0265]C.行為試驗
喪失的運動功能的有效恢復(fù)可以是本實施例在實驗性的SCI中的主要目的。可以進行下述試驗以評估SCI結(jié)果的不同方面。
[0266]D.運動評分
普及的和標(biāo)準化的運動評級量表是在MASCIS中使用的BBB運動評級量表(Basso等人(1995) Journal of Neurotrauma 12:1-21)。使用標(biāo)準的BBB范例，首先將動物預(yù)訓(xùn)練以移動進開放場中，所述開放場由直徑為大約90 cm的、壁高7-10 cm的塑料池組成。2位獨立的檢查人員研究每個試驗受試者的運動能力大約4分鐘，然后使用21-點量表對受試者運動評級。在SCI和聚合納米結(jié)構(gòu)處理以后，隨后可以在早至處理后I天開始試驗動物，每周重復(fù)試驗,例行地延長至處理后 8周。
[0267]E.TreadScan 步態(tài)分析
TreadScan系統(tǒng)會測量被迫運動，其滿足了對動物的步態(tài)分析的需求。步態(tài)分析會實現(xiàn)在SCI中發(fā)生的許多病理生理狀況的高度靈敏的、非侵襲性的檢測和評價。TreadScan系統(tǒng)會使用高速數(shù)字照相機拍攝在透明的帶式跑臺上跑動的動物的視頻。TreadScan系統(tǒng)可以可靠地分析視頻，并確定各種特征參數(shù)，包括站姿時間、搖擺時間、總行進時間、步長、腳接觸面積大小、身體-腳間隔距離、腳間隔距離、跑動速度、步頻、腳偶合量度(foot coup lingmeasures)和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)有關(guān)的量度(諸如腳印相對于身體的放置旋轉(zhuǎn)角和足印寬度)。TreadScan會將這些參數(shù)的詳細結(jié)果輸入Microsoft Excel文件中，并給出統(tǒng)計結(jié)果以滿足研究需求。
[0268]F.通過電生理學(xué)監(jiān)測神經(jīng)元活性
可以使用軀體感覺誘發(fā)電位(SSEP) (Kearse等人(1993) Journal of ClinicalAnesthesia 5:392-398; Hurlbert 等人(1993) J Neurotrauma 10:181-200, 二者通過引用并入本文)來評價通過SCI的電生理學(xué)傳導(dǎo)的損失和恢復(fù)?？梢栽谧蛋迩谐g(shù)之前在擠壓后立即進行電生理學(xué)測量，并在恢復(fù)期中每周進行。SSEP代表穿過上升長段感覺柱的多突觸傳入傳導(dǎo)，且可以通過擠壓刺激位點和記錄位點之間的脊髓而立即消除。產(chǎn)生神經(jīng)沖動的上升沖擊的后肢脛神經(jīng)刺激可以記錄在腦的對側(cè)感覺皮層處。每個完整的電記錄可以包含200個刺激的單獨串(〈2 mA方波，200 μ s持續(xù)時間:在3 Hz)，所述刺激由來自放置在頭蓋骨上的真皮下針式電極的Neuropak 8刺激器/記錄器(Nihon Kohden Inc.,日本東京)提供(由脛神經(jīng)的兩側(cè)同時刺激誘發(fā))。
[0269]G.形態(tài)學(xué)評估
使用組織學(xué)的形態(tài)學(xué)評估可以提供軸突、蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)細胞活性的形態(tài)學(xué)改變和恢復(fù)的可見證據(jù)，這有助于深入研究SCI發(fā)病機制和修復(fù)機制。使用免疫組織化學(xué)，可以研究星形膠質(zhì)細胞和免疫細胞的活性。這些測定的細節(jié)描述于初步研究(Shi等人(2010))中。另外，可以進行髓磷脂損失和軸突內(nèi)血影蛋白破壞的形態(tài)學(xué)試驗，以獨立地評價恢復(fù)。通過受損傷的組織中的IL-1和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的蛋白質(zhì)印跡法，可以檢驗姜黃素的抗炎效應(yīng)。
[0270]H.毒性評估
為了檢驗納米結(jié)構(gòu)或納米粒的安全性，可以在施用之前和之后測量血壓和心電圖，隨后每隔日監(jiān)測動物體重。對于完全血細胞計數(shù)(CBC)，可以在施用后每4周從頸靜脈收集Iml血液。在運動功能恢復(fù)研究結(jié)束時，可以進行全部肉眼能看到的尸體剖檢?？梢杂涗浉?、脾和腎、以及任何顯著改變大小的器官的重量。在10%中性緩沖福爾馬林中固定組織，常規(guī)地加工進石蠟中，并可以用蘇木精和曙紅將5- ym切片染色?？梢杂刹恢榈拇笫螳F醫(yī)病理學(xué)家通過光學(xué)顯微術(shù)檢查肝、脾、腎、心臟、肺、胰腺、膀胱、腦和脊髓?？梢栽趽p傷后第一周的每天和此后每周I次地收集尿樣品，用于分析pH、葡萄糖、蛋白。
[0271]1.實驗設(shè)計
可以使用Long-Evans大鼠來檢驗在損傷后的不同延遲時間靜脈內(nèi)地注射的納米結(jié)構(gòu)或納米粒的有效性?？梢允褂霉灿?組大鼠來覆蓋3個延遲時間(2、8和24小時)和I個對照(在2小時的鹽水注射) 。這些時間點可以基于原發(fā)性損傷的時程進行選擇?？梢允褂迷诮M織-水平研究過程中鑒別為有效的劑量。為了監(jiān)測運動功能恢復(fù)，可以由2位對治療不知情的獨立觀察人員記錄BBB評分(n=15/組)。對于生物利用度測定，可以在3個延遲時間(2、8和24小時)施用Cy5.5-標(biāo)記的納米結(jié)構(gòu)或納米粒(n=5/組)?？梢栽u估用于治療的劑量的聚合納米結(jié)構(gòu)的急性和慢性毒性(n=10/組)。對于免疫分析，可以在治療后2周處死動物(n=5/組)。對于IL-1和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的蛋白質(zhì)印跡測定，可以在治療后7天處死動物(n=5/組)。
[0272]本實施例可以鑒別當(dāng)在SCI后數(shù)小時施用時有效地恢復(fù)SCI大鼠的納米結(jié)構(gòu)或納米粒?？梢越┝宽憫?yīng)曲線，以確定納米結(jié)構(gòu)或納米粒的最佳濃度。所述劑量可以用于隨后的治療時間窗的確定，這對于治療效力的臨床前試驗而言是重要的。
[0273]實施例7
FA-GC/姜黃素納米粒的合成和表征 A.方法
據(jù)信，疏水地修飾的乙二醇殼聚糖(HGC)納米粒的藥代動力學(xué)取決于所述聚合物的疏水性。試驗了 3種不同的阿魏酸(FA)與乙二醇殼聚糖(GC)的摩爾比(即，45、90和180)。在所有情況下，在10 mMHEPES緩沖液(pH 7.2) /DMSO共溶劑中，在有EDAC和NHS存在下，將FA與GC偶聯(lián)。將得到的溶液在室溫攪拌I天，針對過量的水/甲醇(lv:4v)透析(分子截止值=12 kDa) 3天，隨后針對蒸餾水透析，并將產(chǎn)品低壓凍干，以得到FA-GC綴合物。通過FA在DMSO中在316 nm的紫外吸光度，確定取代度，其被定義為每I個乙二醇殼聚糖鏈的FA的數(shù)目。得到了具有3種不同取代度(每個GC鏈5、11和21個FA)的FA-GC綴合物。
[0274]姜黃素加載是基于姜黃素與FA的疏水相互作用。通過溶劑蒸發(fā)方法，將姜黃素包封進FA-GC納米粒中。簡而言之，將FA-GC綴合物和姜黃素(20重量％)溶解在由水和甲醇(1:1體積比)制成的共溶劑中。在真空下在55°C蒸發(fā)甲醇以后，水溶液中的FA-GC自組裝成納米粒。
[0275]通過姜黃素在DMSO中在430 nm的紫外吸光度，確定姜黃素在所述納米粒中的加載含量。在更高的FA取代度，證實了更大的姜黃素加載效率(參見表1)。
[0276]表1.隨著FA取代度而變化的姜黃素加載效率..—11............................................................................................................................................................................................................................................4.34
GC-FA (IIS=S)14.26
GC-FA(DS=Il)15.54
C€-FA(i>S=2UΠ.?,?
DS:取代度，由每個GC鏈的FA單元的數(shù)目指示 。
[0277]對于具有取代度(DS) = 21的FA-GC納米粒，加載的姜黃素在PBS中溫育I天以后沉淀(參見圖7)。相比而言，具有DS = 11的FA-GC能夠穩(wěn)定地包封姜黃素。
[0278]為了將Cy5.5標(biāo)記至FA-GC聚合物，將I重量％的Cy5.5的羥基琥珀酰亞胺酯溶解在DMSO中，并與FA-GC溶液混合。使該反應(yīng)在室溫在暗處進行6小時。通過針對蒸餾水透析(分子量=12 kDa)，歷時2天的時段除去副產(chǎn)物和未反應(yīng)的Cy5.5分子，并將得到的產(chǎn)物低壓凍干。如通過在DMSO中在690 nm的吸光度所確定的，在FA-GC中的Cy5.5的量被證實為0.7重量％。使用與上述相同的方法，將姜黃素加載至FA-GC (_Cy5.5)。
[0279]對于生物分布試驗，將納米粒施用給脊髓挫傷以后的Long-Evans大鼠。在注射后I小時，收獲包括受損傷的脊髓的組織樣本，并均質(zhì)化。將華法林(0.5 ppm)加入得到的溶液以后，用丙酮提取所述組織中的姜黃素。為了定量組織中的姜黃素的濃度，進行紙噴霧MS0
[0280]使用探針型超聲波儀，通過聲處理，在PBS緩沖液(pH 7.4)中形成加載姜黃素的FA-GC 納米粒。使用動態(tài)光散射(DLS, 90Plus, Brookhaven Instruments C0., NY)在633 nm和25°C確定納米粒尺寸和多分散性(μ 2/ 2)。使用透射電子顯微術(shù)(TEM，CM 200電子顯微鏡，Philips)，觀察蒸餾水(I mg/ml)中的納米粒的形態(tài)學(xué)。使用ζ電位分析儀(ZetaPlus, Brookhaven Instruments C0., NY),確定蒸懼水中的表面電荷。
[0281]用配有氬(488 nm)和HeNe (633 nm)激光器和60X/L 2 NA水物鏡的FVlOOO共焦系統(tǒng)(Olympus, Tokyo,日本)，得到共焦突光圖像。分別用488 nm和633 mm激發(fā)獲得姜黃素和FA-GC (_Cy5.5)圖像。
[0282]對于穩(wěn)定性試驗，將姜黃素和納米粒分散在PBS (pH 7.4)中，并在室溫溫育。監(jiān)測溶液I個月。
[0283]B.結(jié)果
用阿魏酸(FA)化學(xué)綴合乙二醇殼聚糖(GC，250 kDa)，以使姜黃素加載效率最大化，所述阿魏酸是姜黃素水解的一種產(chǎn)物(參見圖8(a))。通過優(yōu)化FA綴合度，實現(xiàn)了15.54重量％姜黃素的包封效率(參見表1)。通過透射電子顯微術(shù)(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)，確定加載姜黃素的GC-FA納米粒的平均直徑(參見圖8(b))為320 nm (參見圖8(c))。多分散性值(0.207)指示納米粒的狹窄尺寸分布。測量ζ電位為19.5 mV，這指示納米粒的帶正電荷的表面。得自姜黃素(參見圖8(d)，左，綠色)和Cy5.5-標(biāo)記的FA-GC(參見圖8(d)，右，紅色)的熒光信號的共同局部化證實了姜黃素向納米粒中的包封。在I個月中沒有觀察到存在于FA-GC中的姜黃素的沉淀(參見圖8(e)和圖7)。
[0284]實施例8
FA-GC/姜黃素的藥代動力學(xué)和生物分布 A.方法
在挫傷損傷后2小時，通過大鼠的頸靜脈(n=3)，靜脈內(nèi)地注射包含姜黃素(5 mg/1ml，在鹽水中)或姜黃素(0.77 mg/1 ml，在含有0.l(v/v)%吐溫20的鹽水中)的Cy5.5-標(biāo)記的FA-GC納米粒。在確定的時間，從頸靜脈抽取血液樣品(100 μ I)。將所述血液(50μ I)與5 μ I Κ3 EDTA (作為抗凝劑)和華法林(20 ng/4 μ I, 0.5 ppm，作為質(zhì)譜法分析的內(nèi)標(biāo))一起混合。為了提取姜黃素，將丙酮(150 μ I)加入該溶液中，并渦旋10分鐘。將得到的溶液離心(rpm 5000, 10 min)，并在質(zhì)譜法分析之前在_20°C儲存上清液。為了得到用于定量分析的校正曲線，制備了不同濃度(0-50 ppm)的在大鼠血液中的姜黃素，然后通過上述相同方法提取姜黃素。
[0285]對于姜黃素的生物分布試驗，在脊髓挫傷以后2小時，將具有藥代動力學(xué)研究的相同劑量的納米?；蚪S素/吐溫20施用給Long-Evans大鼠(n=3)。在注射后I小時,收獲包括受損傷的脊髓的組織樣本，并使用磨床將所述組織勻漿化。向組織溶液(50 μ I)中加入華法林(20 ng/4 μ I, 0.5 ppm)以后,通過加入丙酮(150 μ?)來提取姜黃素。
[0286]為了確定姜黃素的藥代動力學(xué)和生物分布，采用了紙噴霧質(zhì)譜法。使用TSQQuantum、LTQ離子講和ExactiveOrbitrap質(zhì)譜儀,進行紙噴霧質(zhì)譜法分析。
[0287]使用抗凝血劑華法林，在確定的時間點收集血液樣品。加入華法林(0.5 ppm)以后，通過與丙酮一起混合以解離姜黃素-白蛋白復(fù)合物，提取血液中的姜黃素。將得到的溶液加載在色譜用紙上。向血液斑點滴加10μ1甲醇以后，通過施加DC電壓來順序地離子化血液中的組分。
[0288]通過基于熒光的分析，確定FA-GC的藥代動力學(xué)和生物分布。將在姜黃素的藥代動力學(xué)研究中收集的血液樣品(50 μ I)的一半用于檢測大鼠(η=3)的血液中的Cy5.5。在損傷后2小時，將作為對照組的GC(-Cy5.5) (5 mg/1 ml，在鹽水中)靜脈內(nèi)地施用給大鼠(n=3)，然后通過上述的相同方法抽取血液。在給大鼠注射加載姜黃素的FA-GC(_Cy5.5)后I天，通過經(jīng)穿心灌注鹽水，處死大鼠，然后收獲組織。通過在675 nm激發(fā)和在695 nm發(fā)射的突光光譜儀(SpectraMax M5, Molecular Devices, CA)以及在640 nm激發(fā)和在695-770nm發(fā)射的IVIS Lumina (Caliper Life Sciences, Inc., MA)，測量和觀察血液和組織樣品中標(biāo)記至FA-GC聚合物上的Cy5.5的突光強度。使用Living Imaging Software (CaliperLife Sciences, Inc., MA),進行FA-GC聚合物的生物分布的定量分析。
[0289]B.結(jié)果
在注射Cy5.5-標(biāo)記的FA-GC納米粒以后， 通過它們在質(zhì)譜圖中的離子化片段(對于姜黃素，m/z=149 ;對于華法林，m/z=161)(參見圖9)，檢測姜黃素和華法林。使用從姜黃素和華法林的質(zhì)量強度之間的比例衍生出的校正曲線(參見圖10(a)，插圖)，得到姜黃素的濃度。為了確定我們的制劑是否會延長姜黃素的血液保留時間，我們對比了 GC-FA組和對照組之間的姜黃素的血漿濃度，在所述對照組中，使用吐溫20表面活性劑作為姜黃素的增溶劑。使用一室模型，分別測得吐溫20組和FA-GC組的血液中的姜黃素的半衰期為6分鐘和36分鐘。
[0290]還通過質(zhì)譜法研究了姜黃素的生物分布。經(jīng)確定，F(xiàn)A-GC納米粒中的姜黃素主要通過腎消除(參見圖11)。重要的是，F(xiàn)A-GC組證實，受損傷的脊髓中的姜黃素濃度是正常脊髓的6.6倍(參見圖10 (b))。相比而言，在吐溫20組的正常脊髓和受損傷的脊髓之間沒有發(fā)現(xiàn)差異(參見圖10(b))。
[0291]在GC聚合物的血液保留時間的確定中，通過一室模型確定，F(xiàn)A-GC表現(xiàn)出長血液保留時間，具有20小時的半衰期(參見圖10(c))。與此相比，未修飾的GC表現(xiàn)出6小時的半衰期(參見圖12)。
[0292]對于生物分布評估，在注射后I天收獲主要器官，并通過IVIS儀器定量Cy5.5熒光的量。除了腎以外，在受損傷的脊髓處的熒光強度顯著高于其它器官(參見圖13)。此外，僅在脊髓的損傷部位處觀察到強信號(參見圖10(d))。這些數(shù)據(jù)共同地證實，用FA對GC的疏水修飾允許延長所述聚合物的循環(huán)和增加聚合物和姜黃素向損傷部位的遞送。
[0293]進一步使用多模態(tài)非線性光學(xué)顯微鏡在單細胞水平確定FA-GC的分布，所述顯微鏡允許膜的受激拉曼散射(SRS)成像(綠色)和Cy5.5-標(biāo)記的FA-GC的雙光子激發(fā)熒光(TPEF)成像(紅色)。在受損傷的白質(zhì)和受損傷的灰質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了所述聚合物。重要的是，在非常易受挫傷損傷影響的灰質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了強熒光信號，其由腔的形成來指示(參見圖14(a))?；屹|(zhì)的聞放大率SRS圖像顯不出紅細胞的凝塊(參見圖14 (d),白色箭頭)。如白質(zhì)中的髓鞘表現(xiàn)出高度卷曲(參見圖14(e))，而后白質(zhì)中和中央管附近的髓鞘表現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)學(xué)(參見圖14(b)和14(c))。這些結(jié)果一起提示FA-GC納米粒對受損傷的脊髓的革巴向。
[0294]實施例9
體外模型
使用PC12細胞作為神經(jīng)元細胞的簡單模型來評價所述納米粒的神經(jīng)保護作用(如前面在圖15中所示，在與GC-FA納米粒一起溫育4小時以后，姜黃素進入細胞中，且GC-FA靶向細胞膜)。在本實施例中，將PC12細胞與加載姜黃素的GC(-Cy5.5)-FA納米粒一起溫育4小時。此后，通過共焦成像(參見圖16(a))，證實GC-FA的細胞膜附著和姜黃素的細胞內(nèi)化。
[0295]因為氧化應(yīng)激和谷氨酸興奮性中毒是脊髓損傷以后的2種主要的不同的病理[X]，使用過氧化氫(H2O2)和谷氨酸損傷的PC12細胞進一步評估了所述納米粒的神經(jīng)保護作用。在與FA-GC/姜黃素、FA-GC或姜黃素一起溫育細胞4小時以后，通過鈣黃綠素和碘化丙啶(PI)雙重染色來測量細胞生存力。
[0296]使用0.2 mg/ml GC-FA/姜黃素的處理會顯著減小PI染色的細胞的數(shù)目(參見圖16 (b))。GC-FA/姜黃素處理使存活率從20%增加至95%，而單獨的GC-FA幫助挽救了 55%的細胞(參見圖16 (c))。在谷氨酸損傷模型中，所有3種處理顯著地保護了 PC12細胞(參見圖16(d))。這些結(jié)果一起提示，所述納米?？捎行У乇ＷoPC12細胞免于H2O2和谷氨酸損傷。[0297]實施例10
體內(nèi)脊髓損傷模型和FA-GC/姜黃素施用
A.方法
本實施例的所有方案都得到Purdue動物管理和使用委員會(Purdue Animal Care andUse Committee)的批準。使用90 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg賽拉嗪,麻醉成年Long-Evans大鼠。進行TlO椎板切除術(shù)，以暴露下面的胸部脊髓段(一個或多個)。使用由New YorkUniversity (Tcuner, 1992)開發(fā)的落重裝置和由多中心協(xié)會(Basso等人，1996)開發(fā)的方案，產(chǎn)生脊髓挫傷損傷。使用從12.5 mm高度下落的IOg棒(直徑2.5 mm),對暴露的脊髓背側(cè)面進行落重撞擊。損傷以后，將肌肉和皮膚逐層封閉，并將大鼠放置在加熱墊上以維持大鼠的體溫，直到它們蘇醒。在麻醉恢復(fù)期中，并且在外科手術(shù)后前3天，每12小時通過皮下注射施用鎮(zhèn)痛劑丁丙諾啡(0.05-0.10 mg/kg),用于手術(shù)后的疼痛控制。
[0298]將大鼠隨機分成4個施用組進行對比:1 ml FA-GC/姜黃素(5 mg/ml，在鹽水中；n=10) ；1 ml單獨的FA-GC (4 mg/ml,在鹽水中；n=8) ；1 ml甲潑尼龍琥拍酸鈉(MPSS, 30mg/kg; n=5);或等容劑量的鹽水(n=10)。在損傷后2小時,通過靜脈內(nèi)頸靜脈注射,施用治療。每天3次地進行手工膀胱表達，直到建立反射性膀胱排空。
[0299]使用Basso Beattie Bresnahan (BBB)運動分級評分,評估運動恢復(fù)。該試驗由2人獨立地進行，并在完成評分之前就評分達成一致。在手術(shù)后第1、7、14、21、28天，記錄BBB評分。
[0300]B.結(jié)果
評價了運動功能恢復(fù)，并將結(jié)果顯示在圖17中。在第7天和隨后的3周中發(fā)現(xiàn)了FA-GC/姜黃素治療的大鼠和MP治療的大鼠之間的顯著差異。在第28天，F(xiàn)A-GC/姜黃素組比MP組明顯好6.3點。令人驚奇地，單獨FA-GC的組也在第14天和隨后的2周中表現(xiàn)出與鹽水對照動物相比顯著更高的評分。
[0301]還在理解修復(fù)機制的嘗試中，評價了血液和尿試驗。如表2所示，在FA-GC治療后，鎂和BUN (2種重要的腎損傷指示劑)的水平顯著減小(參見圖18)。
[0302]表2.血液試驗結(jié)果:
【權(quán)利要求】
1.一種包含疏水地修飾的納米粒的組合物，所述納米粒包含多糖和藥效團，其中所述多糖與所述藥效團共價地結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述多糖經(jīng)由酰胺鍵與所述藥效團共價地結(jié)入口 ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述多糖是乙二醇殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述藥效團是阿魏酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述多糖是乙二醇殼聚糖，且所述藥效團是阿魏酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物另外包含治療有效量的抗炎劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述抗炎劑是姜黃素。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述抗炎劑是甲潑尼龍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述納米粒的平均直徑是約200至約400納米(nm) ο
10.一種包含聚合納米結(jié)構(gòu)的組合物，所述聚合納米結(jié)構(gòu)包含疏水芯、親水殼和治療有效量的抗炎劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組 合物，其中所述納米結(jié)構(gòu)是膠束。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述抗炎劑是姜黃素。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述抗炎劑是甲潑尼龍。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述納米結(jié)構(gòu)的平均直徑是約50至約150納米(nm)。
15.—種治療患有神經(jīng)元損傷的患者的方法,所述方法包括下述步驟:給所述患者施用治療有效量的權(quán)利要求1的疏水地修飾的納米粒。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述神經(jīng)元損傷是脊髓損傷。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述神經(jīng)元損傷是外傷性腦損傷。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述施用在發(fā)生神經(jīng)元損傷的24小時內(nèi)進行。
19.一種藥物制劑，其包含權(quán)利要求1的疏水地修飾的納米粒。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物制劑，所述藥物制劑另外包含藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號】A61K9/26GK103491950SQ201280018731
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月24日
【發(fā)明者】J.程 申請人:普渡研究基金會