本申請涉及生物工程領域，具體涉及一種新型的酪氨酸酶抑制劑。

背景技術(shù)：

茶為世界三大飲料之一，是我國的國飲，又是21世紀天然的綠色飲料。我國是產(chǎn)茶大國，目前我國茶園面積穩(wěn)定在110萬hm²，年產(chǎn)量超過60萬噸，居世界第一位。但隨著茶葉消費日趨高檔化，有10萬噸左右的中低檔茶滯銷和積壓，此外每年茶葉加工的副產(chǎn)品(片、末、梗等)至少達1.6萬噸，其經(jīng)濟價值低，難處理，茶葉的利用率很低，成為茶廠生產(chǎn)中的負擔。因此，開發(fā)茶葉的新用途，開展茶葉的綜合利用，尤其是利用積壓的庫存茶、低檔茶葉和下腳料來生產(chǎn)副加值高的精細化學品，是一項具有重要意義的研究課題。

科學研究和臨床醫(yī)學實驗表明，茶葉有降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、抗輻射等諸多保健作用。茶多酚為茶葉中最主要的功能性成分，已有大量研究表明，茶多酚不僅是一種天然的無毒的抗氧化劑，而且也是一種理想的天然藥物，具有清除自由基和抗氧化等生物活性，在抑菌、抗病毒、防癌抗癌、抑制腫瘤、防治心血管疾病等方面具有良好功效。因此，茶多酚成為目前天然產(chǎn)物研究的熱點，由于具有多種生理活性和功能，在醫(yī)療保健、食品行業(yè)、日用品等領域都得到了廣泛的應用。因此，優(yōu)化提取工藝，以中低檔茶葉和下角料作為生產(chǎn)茶多酚的原料，分離提純茶多酚則可以使茶葉資源得到充分利用，變廢為寶，具有十分重要的經(jīng)濟和社會效益。

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，Tyrosinase)是一種結(jié)構(gòu)復雜的多亞基的含銅氧化還原酶，是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，也是黑色素合成的限速酶。并且，酪氨酸酶在生物體中具有重要的生理功能，除了形成動物皮膚中的保護性黑色素外，它還與昆蟲的傷口愈合與發(fā)育，果蔬的褐變有密切關(guān)系。因此多年來，酪氨酸酶一直受到國內(nèi)外的關(guān)注，其研究涉及生物、醫(yī)學、農(nóng)學、化學、藥學等多個學科和領域。近年來對酪氨酸酶尤其是酪氨酸酶抑制劑的關(guān)注度總體上呈上升趨勢。目前已有一些抑制劑得到臨床應用，作為化妝品添加劑，保護皮膚、去除黑斑；作為殺蟲劑，防治田間害蟲；作為保鮮劑，防止食品、果蔬的褐化過程。從天然植物組織中分離提取酪氨酸酶抑制劑是篩選尋找具有特異的、高效的酪氨酸酶抑制劑的一個主要渠道。

通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，有研究者做過從紫娟茶中提取蘑菇酪氨酸酶抑制物，并研究了抑酶效應，而對抑酶類型和機理未做研究。也有研究者做過從4種茶葉嶗山綠茶、福建花茶、福建鐵觀音和云南普洱中提取土豆酪氨酸酶的抑制物，研究抑制效應，但對抑制類型和抑制機理未做研究。同時，已報道的研究并沒有對茶葉中的縮合單寧進行分離純化，只是用粗提物進行酪氨酸酶的抑制作用研究，而且沒有發(fā)現(xiàn)對黃金桂茶葉縮合單寧的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本申請?zhí)峁┝艘环N酪氨酸酶抑制劑，其中該酪氨酸酶抑制劑是以黃金桂茶葉為原料制備得到的。在一些實施方案中，該酪氨酸酶抑制劑可以由原花青素、原天竺葵定和原翠雀定形成的同聚物和異聚物組成，其中原花青素為主要成分。在一些實施方案中，該酪氨酸酶抑制劑通過MALDI-TOF-MS顯示一系列在m/z 999，1287，1575，1863，等的質(zhì)譜峰(圖1)，HPLC-ESI-MS顯示11個對應峰(圖2)。在一些實施方案中，該酪氨酸酶抑制劑對酪氨酸酶的半抑制率為54.8±1.27μg/mL，對酪氨酸酶的抑制類型為可逆抑制，抑制機理表現(xiàn)為混合型。

本申請以設計分離、篩選新的酪氨酸酶抑制劑為出發(fā)點，對黃金桂茶葉縮合單寧提取物的結(jié)構(gòu)進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抑制酪氨酸酶活性的特性，安全有效，對環(huán)境友好。

本申請以天然的黃金桂茶葉為組織材料，分離出酪氨酸酶的抑制劑，鑒定了其結(jié)構(gòu)特征，確證了其抑酶特性。

本申請采用黃金桂茶葉作為提取酪氨酸酶抑制劑的原料，采用茶多酚浸提工藝進行處理，通過MALDI-TOF-MS和HPLC-ESI-MS分析驗證提取產(chǎn)物，確定產(chǎn)物縮合單寧是復雜的混合物，由原花青素、原天竺葵定和原翠雀定形成的同聚物和異聚物組成，其中原花青素為主要成分。該研究提取物對酪氨酸酶的半抑制率為54.8±1.27μg/mL，抑制效果明顯，對酪氨酸酶的抑制類型為可逆抑制，抑制機理表現(xiàn)為混合型。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請具有如下優(yōu)點：

①選定以普通綠茶為原料，來源廣泛，取材方便。

②通過酪氨酸酶的反應動力學研究發(fā)現(xiàn)，此酪氨酸酶抑制劑對酪氨酸酶活力的抑制效果明顯，且安全無毒。

③在多個領域如醫(yī)療美容、果蔬保鮮、病蟲害防治等領域，具有很好的應用前景。

④采用的丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷和葡聚糖凝膠等試劑價格低廉，操作簡便，適合企業(yè)或個人的大中小規(guī)模生產(chǎn)加工。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變得明顯，或者通過實施本發(fā)明而了解。本發(fā)明的目的和其他優(yōu)點可通過在說明書、權(quán)利要求書以及附圖中所特別指出的結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)和獲得。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明技術(shù)方案的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本申請的實施例一起用于解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，并不構(gòu)成對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。

圖1：MALDI-TOF-MS鑒定實施例1獲得的黃金桂茶葉縮合單寧提取物。

圖2：反相HPLC鑒定實施例1獲得的黃金桂茶葉縮合單寧提取物。各峰表示：1，表棓兒茶素；2，兒茶素；3，表兒茶素；4，表棓兒茶素沒食子酯；5，(表)阿福豆素；6，表兒茶素沒食子酯；7，(表)棓兒茶素芐硫醚；8，(表)棓兒茶素沒食子酯芐硫醚；9，(表)兒茶素芐硫醚；10，(表)兒茶素沒食子酯芐硫醚；11，(表)阿福豆素芐硫醚；12，過量的芐硫醇；13，硫解副產(chǎn)物。

圖3：實施例1獲得的黃金桂縮合單寧提取物對酪氨酸酶活力的影響?？v坐標表示相對酶活(即加入不同濃度的抑制劑后的酪氨酸酶的活力相對于沒有加入抑制劑時酪氨酸酶活力的百分比)，橫坐標表示抑制劑(黃金桂縮合單寧提取物)的濃度，其中I為抑制劑的縮寫。

圖4：實施例1獲得的黃金桂縮合單寧提取物對酪氨酸酶的抑制機理的判斷。曲線0～3所代表的黃金桂縮合單寧提取物的濃度分別為：0、6.66、33.3、66.6μg/mL，其中E為酶的縮寫。

圖5：實施例1獲得的黃金桂縮合單寧提取物對酪氨酸酶的抑制類型的判斷。曲線0～3所代表的黃金桂縮合單寧提取物的濃度分別為：0、6.66、33.3、66.6μg/mL，其中I為抑制劑的縮寫，S為底物的縮寫。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下文中將結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進行詳細說明。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。

實施例中采用的蘑菇酪氨酸酶、L-DOPA、葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)購買自Sigma-Aldrich公司；丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷均為國產(chǎn)分析純。

實施例1.黃金桂茶葉縮合單寧提取物的獲得

取黃金桂的冷凍干燥葉粉(新鮮葉子采于福建安溪，冷凍干燥采用真空冷凍干燥機(christ，ALPHA1-2LD Plus)進行)10g，用200mL的70％丙酮室溫下浸取24h，3500g離心15min，收集上清。上述步驟重復三次。合并丙酮提取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI，R-205V)在38℃減壓蒸餾除去丙酮。將剩余的水相先后用正己烷和二氯甲烷分相，從而去除了色素、脂類和非極性物質(zhì)。得到的水溶液凍干后用50％甲醇溶解，通過Sephadex LH-20柱(30×2.5cm)，先后用50％甲醇和70％丙酮洗脫。減壓蒸餾去除丙酮，剩余的水溶液經(jīng)過冷凍干燥即獲得黃金桂茶葉縮合單寧提取物。

實施例2.實施例1獲得的黃金桂茶葉縮合單寧提取物的結(jié)構(gòu)特征的鑒定

通過MALDI-TOF-MS(方法參考文獻Wei SD,Lin YM,Liao MM,Zhou HC,Li YY.Characterization and antioxidative properties of condensed tannins from the mangrove plant Aegiceras corniculatum.J Appl Polym Sci 2012,124:2463–2472.)，實施例1獲得的黃金桂茶葉縮合單寧提取物顯示一系列在m/z999，1287，1575，1863，等的質(zhì)譜峰(圖1)，HPLC-ESI-MS(方法參考文獻Wei SD,Lin YM,Liao MM,Zhou HC,Li YY.Characterization and antioxidative properties of condensed tannins from the mangrove plant Aegiceras corniculatum.J Appl Polym Sci 2012,124:2463–2472.)顯示11個對應峰(圖2)。最終確定實施例1獲得的產(chǎn)物縮合單寧提取物是復雜的混合物，由原花青素、原天竺葵定和原翠雀定形成的同聚物和異聚物組成，其中原花青素為主要成分。原花青素是酪氨酸酶催化底物的類似物，能競爭地結(jié)合酪氨酸酶，抑制酪氨酸酶的活性。

實施例3.實施例1獲得的黃金桂茶葉縮合單寧提取物對酪氨酸酶的抑制酪氨酸酶活性

測活體系如下：0.3mL 1mg/mL的L-多巴(L-DOPA)，0.75mL 0.2mM，PH＝6.8的磷酸緩沖液，1.8mL的蒸餾水，0.1mL不同濃度(分別是0、5、15、25、35、50、65μg/mL)的實施例1獲得的縮合單寧提取物，0.05mL酪氨酸酶水溶液(sigma，蘑菇酪氨酸酶)。恒溫條件為30℃，測定波長為475nm。

如圖3所示，實施例1獲得的黃金桂縮合單寧提取物對酪氨酸酶的半抑制率為54.8±1.27μg/mL。

以L-DOPA的濃度為定量，加入的酪氨酸酶的量為變量，測定不同濃度的實施例1獲得的縮合單寧提取物(分別是0、6.67、33.33、66.67 μg/mL)下酪氨酸酶催化L-DOPA的活力隨酶量的關(guān)系。以酶活對酶量作圖得到一組通過原點的直線，如圖4所示，隨著效應物濃度的增大，直線的斜率降低，說明實施例1獲得的縮合單寧提取物對酶的抑制屬于可逆抑制。對于實施例1獲得的縮合單寧提取物的抑制類型的判斷及測定相關(guān)抑制常數(shù)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。

如圖5所示，固定反應體系的酶量，改變底物L-DOPA和縮合單寧提取物的濃度，可以得到一組相交于第二象限的直線。說明隨著實施例1獲得的縮合單寧提取物濃度的增大，不但導致酶促反應的最大反應速度(V_max)變小，還導致米氏常數(shù)(K_m)變大，其抑制機理表現(xiàn)為混合型。并得出實施例1獲得的縮合單寧提取物對游離酶(E)的抑制常數(shù)(K_I)和效應物對酶和底物絡合物(ES)的抑制常數(shù)(K_IS)。實施例1獲得的黃金桂縮合單寧提取物的抑制常數(shù)(K_I)為69.76μg/mL，抑制常數(shù)(K_IS)為20.27μg/mL。

雖然本發(fā)明所揭露的實施方式如上，但所述的內(nèi)容僅為便于理解本發(fā)明而采用的實施方式，并非用以限定本發(fā)明。任何本發(fā)明所屬領域內(nèi)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明所揭露的精神和范圍的前提下，可以在實施的形式及細節(jié)上進行任何的修改與變化，但本發(fā)明的專利保護范圍，仍須以所附的權(quán)利要求書所界定的范圍為準。