本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，尤其涉及一種礦化引導(dǎo)組織再生膜及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牙周病是危害人類健康的三大非染性疾病之一，是指發(fā)生在牙支持組織(牙周組織)的疾病，包括僅累及牙齦組織的牙齦病和波及深層牙周組織(牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì))的牙周炎兩大類。牙周病的治療包括三個(gè)方面：消除炎癥，防止感染的復(fù)發(fā)及牙周組織正常結(jié)構(gòu)和功能的重建。傳統(tǒng)的治療方法只能達(dá)到消除炎癥，控制病變的發(fā)展，而已破壞的牙周組織難以恢復(fù)正常。有研究發(fā)現(xiàn)只有源于牙周膜的牙周前體細(xì)胞才能形成牙周質(zhì)，牙槽骨和牙周膜的能力。要使牙周前體細(xì)胞占據(jù)病損的部位并有效的重建牙周組織，必須阻止不能形成牙周組織的細(xì)胞占據(jù)病損部位，改善病變根面的生物相容性和增強(qiáng)牙周前體細(xì)胞的活性。引導(dǎo)組織再生技術(shù)(Guided Tissue Regeneration，GTR)是80年代末90年代初發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，是口腔臨床上經(jīng)常使用的一種治療骨缺損和獲得牙周組織再生的方法，其原理是利用膜的物理屏障功能將病損區(qū)與周圍組織隔離，創(chuàng)造一個(gè)相對(duì)封閉的組織環(huán)境，從而使特定組織的再生功能得到最大程度的發(fā)揮。

GTR膜根據(jù)膜材料是否在體內(nèi)被吸收、降解，可分為可吸收性膜和不可吸收性膜。

(1)不可吸收膜可在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮機(jī)械屏障作用，為目標(biāo)組織的再生提供充足時(shí)間。

聚四氟乙烯膜(e-PTFE膜)是應(yīng)用最為廣泛的不可吸收材料，在臨床應(yīng)用中顯示了比較好的引導(dǎo)組織再生作用，它不可降解，不會(huì)引起組織發(fā)生炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，骨再生效果理想。最近有臨床報(bào)道使用鈦片加強(qiáng)的e-PTFE膜能成功地增加牙槽嵴的垂直高度。e-PTFE膜的缺點(diǎn)是組織親和性差，創(chuàng)口易開裂，膜早期暴露機(jī)率高，暴露后成骨的效果受影響大；由于膜不能在體內(nèi)降解，需二次手術(shù)取出，且價(jià)格昂貴，不易被患者接受?，F(xiàn)主要用在實(shí)驗(yàn)研究中對(duì)比其他屏障膜的功效時(shí)采用。

鈦膜在口腔種植外科的植骨術(shù)中應(yīng)用較多，有報(bào)道稱在唇腭裂的牙槽嵴增高術(shù)中，將鈦膜覆蓋于植骨表面，可以更有效地?cái)U(kuò)增牙槽骨骨量。但是鈦膜具有易暴露和需二次取出等缺點(diǎn)，同時(shí)鈦膜在使用時(shí)，需要特殊的鈦釘固定位置，使用上有一定的不方便，因此，對(duì)其性能的改進(jìn)也在不斷地研究中。有研究在鈦膜表面制備微孔，發(fā)現(xiàn)有利于加快微循環(huán)的早期建立；有報(bào)道通過降低鈦膜的厚度來增加鈦膜的組織親和性，也能減少膜早期暴露的機(jī)率；目前僅有部分醫(yī)生根據(jù)臨床適應(yīng)癥采用。

(2)可吸收GTR膜材料

理想的GTR膜應(yīng)該在選擇性的引導(dǎo)組織再生這一過程完成時(shí)，膜材料被完全降解吸收?？晌盏腉TR膜材料可分為以聚酯為代表的高分子材料和膠原為代表的天然高分子材料。

聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乙醇酸優(yōu)點(diǎn)在于可以通過調(diào)控合成條件可以方便地改變膜的理化特性，以期達(dá)到臨床使用的效果；價(jià)格相對(duì)低，容易被患者接受；其缺點(diǎn)在于降解、代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體成骨可能有不利的影響；對(duì)工業(yè)化制膜工藝的研究還有待改進(jìn)。因此，雖然也有一些研究報(bào)道了這類膜的良好性能，但總體上看，這類膜的成骨效率還不穩(wěn)定，要達(dá)到完美的臨床要求仍然需要繼續(xù)深入研究。

膠原膜具有良好的組織相容性，其抗張強(qiáng)度和彈性較高，而免疫原性較低，并可完全降解。目前應(yīng)用最多的膠原膜是Bio-Gide，它是由純Ⅰ型和Ⅲ豬膠原組成，其最大的優(yōu)點(diǎn)是在體內(nèi)可以降解，無需二次手術(shù)取出，即使在愈合期發(fā)生暴露，其也具有一定的抗感染能力。但是對(duì)于較嚴(yán)重的牙周疾病，單純的應(yīng)用GTR膜和植骨術(shù)難以取得療效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)單純的膠原膜引導(dǎo)組織再生功能不強(qiáng)的缺陷，提供一種礦化引導(dǎo)組織再生膜及其制備方法和應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一方面，提供了一種礦化引導(dǎo)組織再生膜，包括：

疏松層，由Ⅰ型膠原和納米羥基磷灰石復(fù)合而成；

致密層，其位于所述疏松層上，所述致密層由Ⅰ型膠原構(gòu)成。

在根據(jù)本發(fā)明所述的礦化引導(dǎo)組織再生膜中，所述疏松層呈海綿狀，且平均孔徑為100-250um，孔隙率為75％-90％。

在根據(jù)本發(fā)明所述的礦化引導(dǎo)組織再生膜中，所述致密層表面光滑，且所述致密層的密度為0.7-1.5g/cm³。

在根據(jù)本發(fā)明所述的礦化引導(dǎo)組織再生膜中，所述疏松層的厚度為0.08-0.15mm，所述致密層的厚度為1-2mm。

在根據(jù)本發(fā)明所述的礦化引導(dǎo)組織再生膜中，所述納米羥基磷灰石的粒徑為20～200nm。

本發(fā)明第二方面，還提供了一種礦化引導(dǎo)組織再生膜的制備方法，包括以下步驟：

步驟S1、礦化膠原顆粒的制備，具體包括：

步驟S1-1、將膠原溶于鹽酸、硝酸或醋酸中的任何一種，配置成膠原的酸溶液，其中膠原濃度為0.01～0.5g/ml；

步驟S1-2、在所述膠原的酸溶液中滴加鈣鹽溶液，其中鈣離子的加入量為每克膠原對(duì)應(yīng)加入鈣離子0.1～2mol；

步驟S1-3、在步驟S1-2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根離子的加入量與步驟S1-2中鈣離子加入量的摩爾比為Ca/P＝1/1～2/1；

步驟S1-4、在步驟S1-3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，調(diào)節(jié)pH值為6～8；

步驟S1-5、將步驟S1-4所得的混合溶液靜置4～12小時(shí)后，以3000～6000r/min的速度離心出沉淀后在50-70℃鼓風(fēng)干燥24～72小時(shí)，得到礦化膠原顆粒；

步驟S2、疏松層的制備，具體包括：

步驟S2-1、將膠原溶于純化水中，配制第一膠原水溶液，其中膠原的質(zhì)量濃度為0.1％～2％；

步驟S2-2、在第一膠原水溶液中加入步驟S1-5所得的礦化膠原顆粒，其中加入的礦化膠原顆粒與步驟S2-1中膠原的質(zhì)量比為4:1-3:2，攪拌4～12小時(shí)；

步驟S2-3、將步驟S2-2得到的溶液注入到模具中，冷凍干燥24～72小時(shí)，得到疏松層；

步驟S3、致密層的制備，具體包括：

步驟S3-1、將膠原溶于純化水中，配制第二膠原水溶液，其中膠原的質(zhì)量濃度為0.01％～1％；

步驟S3-2、將放置有疏松層的模具夾持在勻膠機(jī)上，通過勻膠機(jī)在所述疏松層上滴加所述第二膠原水溶液；

步驟S3-3、將步驟S3-2的模具放置在真空干燥機(jī)中，干燥后得到在疏松層上復(fù)合有致密層的礦化引導(dǎo)組織再生膜。

在根據(jù)本發(fā)明所述的礦化引導(dǎo)組織再生膜的制備方法中，所述步驟S3-2中調(diào)節(jié)勻膠機(jī)的速度為1000～10000r/min，旋轉(zhuǎn)10～60s。

在根據(jù)本發(fā)明所述的礦化引導(dǎo)組織再生膜的制備方法中，所述步驟S3-3中真空干燥機(jī)的溫度為30-50℃，干燥4～24小時(shí)后取下薄膜。

本發(fā)明第三方面，提供了上述礦化引導(dǎo)組織再生膜在治療牙周病、拔牙位點(diǎn)保留、先天畸形或外傷導(dǎo)致的口腔骨缺損的應(yīng)用。尤其針對(duì)具有骨缺損的嚴(yán)重的牙周病具有非常好的修復(fù)及引導(dǎo)組織再生效果。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)以及所帶來的預(yù)想不到的技術(shù)效果至少包括如下幾點(diǎn)：

(1)構(gòu)建了雙層結(jié)構(gòu)的礦化引導(dǎo)組織再生膜，其中疏松層由Ⅰ型膠原和納米羥基磷灰石復(fù)合構(gòu)成，與自體骨成份相一致，能夠與病變的口腔骨缺損面貼合誘導(dǎo)新骨生成；而致密層的表面光滑，能夠很好地利用膜的物理屏障功能將病損區(qū)與周圍組織隔離，使特定組織的再生功能得到最大程度的發(fā)揮；礦化引導(dǎo)組織再生膜本身具有良好的組織相容性，其抗張強(qiáng)度和彈性較高，而免疫原性較低，并可完全降解。

(2)如果使用單純的膠原膜搭配牙科骨粉使用來治療嚴(yán)重的牙周疾病，也能比單純使用膠原膜得到更好的治療效果，但是使用牙粉必然會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，本發(fā)明的礦化引導(dǎo)組織再生膜不僅減少了患者購買牙科骨粉的費(fèi)用，而且通過將納米羥基磷灰石復(fù)合在膠原膜內(nèi)部形成礦化膠原，可以得到更適于牙齒根面修復(fù)的降解性能和促進(jìn)細(xì)胞生長的能力，對(duì)于非常嚴(yán)重的牙周疾病有很好的治療效果。

(3)本發(fā)明制得的礦化引導(dǎo)組織再生膜的孔徑和孔隙率適中，平均孔徑為100-250um，孔隙率為75％-90％，能更好地促進(jìn)口腔骨缺損面的細(xì)胞生長；且礦化引導(dǎo)組織再生膜的厚度適中，材料的降解速度與口腔骨缺損的修復(fù)速度匹配。

(4)制備方法中采用的膠原溶液濃度為0.01～0.5g/ml，整體溶液粘度適中，在提高膠原濃度的情況下保障了礦化的程度，避免因粘度造成局部離子濃度過大或過小所帶來的影響。

(5)制備方法中每克膠原對(duì)應(yīng)加入鈣離子0.1～2mol，避免過多的鈣離子導(dǎo)致鈣鹽的浪費(fèi)或者材料中殘留多余的游離鈣離子，同時(shí)又避免了鈣離子過少可能導(dǎo)致的膠原礦化不足，強(qiáng)度變低的缺陷，使得制得的礦化引導(dǎo)組織再生膜的成分更符合口腔骨缺損的病損區(qū)域修復(fù)材料要求，更好地發(fā)揮引導(dǎo)組織再生作用。

(6)制備方法中采用鈣磷摩爾投料比為Ca：P＝1/1～2/1，提高了鈣鹽和磷鹽的利用效率，減少了材料中游離鈣鹽和磷鹽的殘留。

(7)制備方法中采用第一膠原水溶液和第二膠原水溶液制備，與膠原的酸溶液相比，使用水溶液更有利于保持膠原的粘性，使致密層更好的黏附在疏松層上。并且第一膠原水溶液中膠原的質(zhì)量濃度為0.1％～2％，可以使得疏松層中平均孔徑與孔隙率達(dá)到所需的100至250μm以及70至95％。第二膠原水溶液中膠原的質(zhì)量濃度為0.01％～1％，真空干燥后得到的致密層的密度達(dá)到0.7-1.5g/cm³。

(8)制備方法中加入的礦化膠原顆粒與第一膠原水溶液中膠原的質(zhì)量比為4:1-3:2，此質(zhì)量比更接近人體骨成分。

(9)制備方法中調(diào)節(jié)勻膠機(jī)的速度為1～10千轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)10～60s，可以匹配第二膠原水溶液的濃度，在疏松層上形成形態(tài)完整且厚度適中的致密層結(jié)構(gòu)。

附圖說明

圖1為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例提供的礦化引導(dǎo)組織再生膜的制備方法流程圖；

圖2為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的礦化引導(dǎo)組織再生膜的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的礦化引導(dǎo)組織再生膜中疏松層的SEM結(jié)果圖；

圖4為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的礦化引導(dǎo)組織再生膜中致密層的SEM結(jié)果圖；

圖5為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的礦化引導(dǎo)組織再生膜截面的SEM結(jié)果圖。

圖6a和圖6b分別為本發(fā)明中拔牙位點(diǎn)保留實(shí)驗(yàn)的A組和B組術(shù)后12周的樣品大體觀察圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

請(qǐng)參閱圖1，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例提供的礦化引導(dǎo)組織再生膜的制備方法流程圖。如圖1所示，該制備方法包括以下步驟：

步驟S1、礦化膠原顆粒的制備，具體包括：

步驟S1-1、將膠原溶于鹽酸、硝酸或醋酸中的任何一種，配置成膠原的酸溶液，其中膠原濃度為0.01～0.5g/ml(例如0.01、0.1、0.2或0.5g/ml)。本發(fā)明中使用的膠原均為Ⅰ型膠原。

步驟S1-2、在所述膠原的酸溶液中滴加鈣鹽溶液，其中鈣離子的加入量為每克膠原對(duì)應(yīng)加入鈣離子0.1～2mol(例如0.1、0.5、1、1.5或2mol)。更優(yōu)選為每克膠原對(duì)應(yīng)加入鈣離子1～2mol。

步驟S1-3、在步驟S1-2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根離子的加入量與步驟S1-2中鈣離子加入量的摩爾比為Ca/P＝1/1～2/1(例如1、1.2、1.4、1.6、1.8或2mol)。

步驟S1-4、在步驟S1-3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，調(diào)節(jié)pH值為6～8(例如6、7或8)。

步驟S1-5、將步驟S1-4所得的混合溶液靜置4～12小時(shí)(例如4、7、10或12小時(shí))后，以3000～6000r/min(例如3000、4500或6000r/min)的速度離心出沉淀后在50-70℃(例如50℃、60℃或70℃)鼓風(fēng)干燥24～72小時(shí)(例如24、36、48或72小時(shí))，得到礦化膠原顆粒。

步驟S2、疏松層的制備，具體包括：

步驟S2-1、將膠原溶于純化水中，配制第一膠原水溶液，其中膠原的質(zhì)量濃度為0.1％～2％(例如0.1％、0.5％、1％或2％)。

步驟S2-2、在第一膠原水溶液中加入步驟S1-5所得的礦化膠原顆粒，其中加入的礦化膠原顆粒與步驟S2-1中膠原的質(zhì)量比為4:1-3:2(例如4:1、3:1、2:1或3:2)，攪拌4～12小時(shí)(例如4、7、10或12小時(shí))。

步驟S2-3、將步驟S2-2得到的溶液注入到模具中，冷凍干燥24～72小時(shí)(例如24、36、48或72小時(shí))，得到疏松層。

步驟S3、致密層的制備，具體包括：

步驟S3-1、將膠原溶于純化水中，配制第二膠原水溶液，其中膠原的質(zhì)量濃度為0.01％～1％(例如0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、0.8％或1％)。

步驟S3-2、將放置有疏松層的模具夾持在勻膠機(jī)上，通過勻膠機(jī)在所述疏松層上滴加所述第二膠原水溶液；優(yōu)選地，該步驟中調(diào)節(jié)勻膠機(jī)的速度為1000～10000r/min(例如1000、3000、5000、8000或10000r/min)，旋轉(zhuǎn)10～60s(例如10s、30s或60s)。

步驟S3-3、將步驟S3-2的模具放置在真空干燥機(jī)中，干燥后得到在疏松層上復(fù)合有致密層的礦化引導(dǎo)組織再生膜。優(yōu)選地，該步驟中真空干燥機(jī)的溫度為30-50℃(例如30℃、40℃或50℃)，干燥4～24小時(shí)(例如4、8、12、18或24小時(shí))后取下薄膜。

請(qǐng)參閱圖2，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的礦化引導(dǎo)組織再生膜的結(jié)構(gòu)示意圖。該礦化引導(dǎo)組織再生膜可以采用前述制備方法制得，也可以采用其它方法制備。如圖所示，本發(fā)明提供的礦化引導(dǎo)組織再生膜具有雙層結(jié)構(gòu)，包括：疏松層1和致密層2。

其中疏松層1由Ⅰ型膠原和納米羥基磷灰石復(fù)合而成，Ⅰ型膠原和納米羥基磷灰石的質(zhì)量份數(shù)比為0.7-0.9:0.3-0.1。優(yōu)選地，該疏松層呈海綿狀，且平均孔徑為100-250um，孔隙率為75％-90％。其中納米羥基磷灰石的粒徑為20～200nm。該疏松層1的成份與自體骨成份相一致。在使用時(shí)，將礦化引導(dǎo)組織再生膜的疏松層1與口腔骨缺損表面貼合，該疏松層1中復(fù)合有納米羥基磷灰石的Ⅰ型膠原構(gòu)成了礦化膠原，能夠誘導(dǎo)新骨生成。

致密層2位于疏松層1上，該致密層由Ⅰ型膠原構(gòu)成。該致密層表面光滑，致密層2的密度優(yōu)選為0.7-1.5g/cm³。致密層2中Ⅰ型膠原纖維束緊密排列，具有粘合水化性、促進(jìn)細(xì)胞貼附和增殖和分化的生物學(xué)功能。

優(yōu)選地，上述疏松層1的厚度為0.08-0.15mm，所述致密層2的厚度為1-2mm。

本發(fā)明還提供了上述礦化引導(dǎo)組織再生膜在治療牙周病、拔牙位點(diǎn)保留、先天畸形或外傷導(dǎo)致的口腔骨缺損的應(yīng)用。尤其針對(duì)具有骨缺損的嚴(yán)重的牙周病具有非常好的修復(fù)及引導(dǎo)組織再生效果。

在本發(fā)明中，本發(fā)明人至少在如下方面進(jìn)行了改進(jìn)并取得了相應(yīng)的技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明不是直接對(duì)膠原進(jìn)行礦化得到疏松層，而是通過兩個(gè)步驟，即先在步驟S1中制備礦化膠原顆粒，再將其溶于一定比例的膠原水溶液中，這樣以膠原為支架，使礦化膠原顆粒均勻的分布在膠原支架內(nèi)，當(dāng)?shù)V化膠原膜植入口腔骨缺損的病損區(qū)時(shí)，膠原逐漸降解，礦化膠原顆粒逐步與病損區(qū)接觸，誘導(dǎo)新骨生成。

(2)采用每克膠原滴加鈣離子0.1～2mol；現(xiàn)有技術(shù)中有時(shí)候會(huì)滴加過少的鈣離子，有時(shí)甚至低至0.01mol；有時(shí)候又滴加過多的鈣離子，有時(shí)高至2.5mol/g；過多的鈣離子會(huì)導(dǎo)致鈣鹽的浪費(fèi)或者材料中殘留多余的游離鈣離子，使得后續(xù)的清洗變得復(fù)雜甚至困難，如果鈣離子過少，則可能導(dǎo)致膠原礦化不足，強(qiáng)度變低，不符合口腔骨缺損的病損區(qū)域修復(fù)要求，影響引導(dǎo)組織再生作用。

(3)采用膠原溶液濃度為0.01～0.5g/ml，整體溶液粘度適中，在提高膠原濃度的情況下保障了礦化的程度，避免因粘度造成局部離子濃度過大或過小所帶來的影響。

(4)采用鈣磷摩爾投料比為Ca/P＝1/1～2/1，使得材料的無機(jī)鹽成份更加符合羥基磷灰石的理論鈣磷比1.667，提高了鈣鹽和磷鹽的利用率，減少鈣離子和/或磷酸根離子在材料中的殘留，降低后續(xù)洗滌等操作難度，提高時(shí)間效率，避免游離鈣離子或磷酸根離子殘留造成的材料強(qiáng)度不足的問題。

(5)制備方法中采用第一膠原水溶液和第二膠原水溶液制備，與膠原的酸溶液相比，使用水溶液更有利于保持膠原的粘性，使致密層更好的黏附在疏松層上。并且第一膠原水溶液中膠原的質(zhì)量濃度為0.1％～2％，使得疏松層中平均孔徑與孔隙率達(dá)到所需的100至250μm以及70至95％。第二膠原水溶液中膠原的質(zhì)量濃度為0.01％～1％，可以使真空干燥后得到的致密層的密度達(dá)到0.7-1.5g/cm³。

(6)制備方法中加入的礦化膠原顆粒與第一膠原水溶液中膠原的質(zhì)量比為4:1-3:2，此質(zhì)量比更接近人體骨成分。

(7)制備方法中調(diào)節(jié)勻膠機(jī)的速度為1～10千轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)10～60s，可以匹配第二膠原水溶液的濃度，在疏松層上形成形態(tài)完整且厚度適中的致密層結(jié)構(gòu)。本發(fā)明在加入致密層后測(cè)抗縫線強(qiáng)度，致密層膠原的濃度越高，厚度越大，力學(xué)強(qiáng)度越大，穿入線后維持的時(shí)間越久，但是致密層的膠原濃度過高，在均膠的時(shí)候?qū)⒉灰卒侀_，無法得到形態(tài)完整且厚度適中的結(jié)構(gòu)。

綜上，本發(fā)明的制備方法具有成本低、材料利用率高、易操作等優(yōu)點(diǎn)，由該方法制得的礦化引導(dǎo)組織再生膜具有力學(xué)強(qiáng)度高、降解時(shí)間與口腔骨缺損修復(fù)時(shí)間匹配、平均孔徑和孔隙率復(fù)合要求、引導(dǎo)性和誘導(dǎo)性優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)。

外，本發(fā)明人還在質(zhì)量體系建立過程中，對(duì)部分原材料進(jìn)行了如下改進(jìn)并取得了相應(yīng)的技術(shù)效果：

(1)采用了Ⅰ型膠原蛋白，非凝膠狀態(tài)的纖維作為膠原原料，避免因?yàn)槟z中固含量的不一致，造成投料量不一致；同時(shí)Ⅰ型膠原是在動(dòng)物體中發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是自體骨的主要有機(jī)組成部分。Ⅰ型膠原蛋白是脊柱動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是成骨過程中成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，是鈣鹽沉積的支架和骨基質(zhì)礦化的促進(jìn)劑、礦化的模板；能促進(jìn)細(xì)胞遷移、吸附、分化，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，作為生物材料已被美國FDA認(rèn)可，并有一系列膠原植入產(chǎn)品，包括骨植入產(chǎn)品。

(2)采用了藥用或藥用輔料級(jí)別的鈣鹽、磷鹽，避免因?yàn)樵系募?jí)別造成雜質(zhì)、重金屬、灰分的超標(biāo)，也影響材料的生物相容性。

(3)采用雙層結(jié)構(gòu)的礦化引導(dǎo)組織再生膜，不僅減少了患者購買牙科骨粉的費(fèi)用，而且通過將納米羥基磷灰石復(fù)合在膠原膜內(nèi)部形成礦化膠原，可以得到更適于口腔骨缺損修復(fù)的降解性能和促進(jìn)細(xì)胞生長的能力，對(duì)于非常嚴(yán)重的牙周疾病有很好的治療效果。

需要特別指出的是，本說明書的數(shù)值范圍表示該數(shù)值范圍的上限值、下限值以及處在該數(shù)值范圍之內(nèi)的任何數(shù)值或者子范圍。因此，如果沒有特別說明，在本說明書中涉及數(shù)值范圍時(shí)就不再詳細(xì)列舉包含在該數(shù)值范圍內(nèi)的具體數(shù)值。

實(shí)施例

下文將通過實(shí)施例的形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不應(yīng)被理解為限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

(1)將Ⅰ型膠原溶于濃度為0.5M的醋酸，配置成膠原的酸溶液，其中Ⅰ型膠原濃度為0.01g/ml；

(2)在所述膠原的酸溶液中滴加鈣鹽溶液，其中鈣離子的加入量為每克膠原對(duì)應(yīng)加入鈣離子1mol；

(3)在步驟2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根離子的加入量與步驟S1-2中鈣離子加入量的摩爾比為Ca/P＝1.5/1；

(4)在步驟3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，調(diào)節(jié)pH值為8；

(5)將步驟4所得的混合溶液靜置4小時(shí)后，以3000r/min的速度離心出沉淀后在50℃鼓風(fēng)干燥24小時(shí)，得到礦化膠原顆粒。

(6)將膠原溶于純化水中，配制第一膠原水溶液，其中膠原的質(zhì)量濃度為0.1％；

(7)在第一膠原水溶液中加入步驟5所得的礦化膠原顆粒，其中加入的礦化膠原顆粒與步驟6中膠原的質(zhì)量比為，攪拌4小時(shí)；

(8)將步驟7得到的溶液注入到模具中，冷凍干燥24小時(shí)，得到疏松層。

(9)將膠原溶于純化水中，配制第二膠原水溶液，其中膠原的質(zhì)量濃度為0.01％；

(10)將放置有疏松層的模具夾持在勻膠機(jī)上，通過勻膠機(jī)在所述疏松層上滴加所述第二膠原水溶液；優(yōu)選地，該步驟中調(diào)節(jié)勻膠機(jī)的速度為1000r/min，旋轉(zhuǎn)10s；

(11)將步驟10的模具放置在真空干燥機(jī)中，干燥后得到在疏松層上復(fù)合有致密層的礦化引導(dǎo)組織再生膜。其中真空干燥機(jī)的溫度為40℃，干燥4小時(shí)后取下薄膜。

(12)根據(jù)臨床需求對(duì)獲得的礦化引導(dǎo)組織再生膜進(jìn)行切割、修剪，即得具有雙層結(jié)構(gòu)的礦化引導(dǎo)組織再生膜。

實(shí)施例2至14

除了下表1和表2的內(nèi)容之外，以與實(shí)施例1基本相同的方式進(jìn)行。

注：第二膠原水溶液中膠原濃度表示膠原的質(zhì)量濃度。

SEM結(jié)果觀察

通過掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)實(shí)施例1制得的礦化引導(dǎo)組織再生膜進(jìn)行觀察。請(qǐng)參閱圖3為其中疏松層的SEM結(jié)果圖，圖4為致密層的SEM結(jié)果圖，圖5為礦化引導(dǎo)組織再生膜截面的SEM結(jié)果圖。如圖所示，其中疏松層為多孔結(jié)構(gòu)，致密層則表面光滑，從兩者的截面圖可以看出，致密層由Ⅰ型膠原纖維束緊密排列構(gòu)成，疏松層中則復(fù)合有納米羥基磷灰石顆粒，并且兩者的連接面緊密，無分層現(xiàn)象。

抗縫線強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)

取實(shí)施例1制得的礦化引導(dǎo)組織再生膜10×10mm置于生理鹽水中浸泡1min、漂洗后，用扁平夾子夾住一邊5mm處，垂直懸掛在支架上，下邊3mm處穿一3/0的線環(huán)，線環(huán)上加掛50g砝碼，5min后，該礦化引導(dǎo)組織再生膜不會(huì)破裂。

拔牙位點(diǎn)保留實(shí)驗(yàn)

拔除牙齒后，由于失去了生理性的刺激，牙槽嵴骨質(zhì)會(huì)發(fā)生進(jìn)行性、不可逆性的吸收，牙槽窩周圍硬組織和軟組織出現(xiàn)不同程度的改變，常常會(huì)造成牙槽嵴的低平及原有形態(tài)的變化，從而嚴(yán)重影響到未來義齒的修復(fù)，更不利于種植體的植入。充足的牙槽嵴高度和寬度對(duì)于義齒的修復(fù)至關(guān)重要，尤其是種植修復(fù)。目前，礦化引導(dǎo)組織再生膜與人工骨修復(fù)材料結(jié)合廣泛用于拔牙后保存牙槽嵴。

1.實(shí)驗(yàn)方法：

除6犬下頜雙側(cè)第三前磨牙，共有24個(gè)牙槽窩，隨機(jī)分成A，B，C三組，分別是8，8，8個(gè)牙槽窩。A、B、C三組拔牙窩分別做如下處理：

A組實(shí)驗(yàn)組：在牙槽窩內(nèi)植入納米羥基磷灰石/膠原人工骨材料并覆蓋實(shí)施例1制得的礦化引導(dǎo)組織再生膜；

B組對(duì)照組1：在牙槽窩內(nèi)植入納米羥基磷灰石/膠原人工骨材料；

C組為空白對(duì)照：拔牙窩內(nèi)充滿血液并頰舌側(cè)對(duì)位間斷縫合(圖4)。

注：上述納米羥基磷灰石/膠原人工骨材料為北京奧精醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品。術(shù)后，每天一次給所有動(dòng)物喂食預(yù)防抗感染和抗炎藥物。術(shù)后12周在麻醉下處死動(dòng)物。所取樣本包括實(shí)驗(yàn)拔牙位點(diǎn)及其周圍的牙槽骨，進(jìn)行大體觀察和形態(tài)學(xué)測(cè)量。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

(1)大體觀察

實(shí)驗(yàn)犬由于傷的疼痛刺激術(shù)后4天大多飲食及一般情況不佳，術(shù)后1周飲食正常。術(shù)后1-4天，口內(nèi)黏膜輕度充血發(fā)紅，5天后黏膜色澤正常，拔牙創(chuàng)表面完全被上皮組織覆蓋。2周后傷口愈合良好，均達(dá)到一期愈合。所有動(dòng)物均生存良好，未發(fā)生明顯傷口出血、感染或拔牙窩內(nèi)植入物脫落情況。術(shù)后10周口內(nèi)黏膜色澤正常，質(zhì)地堅(jiān)韌而富有彈性。術(shù)后12周A組牙槽嵴輪廓飽滿，探測(cè)質(zhì)地堅(jiān)硬，與鄰牙牙槽骨質(zhì)地相當(dāng)，表面未見材料殘留(如圖6a所示)。B組牙槽嵴外形豐滿度稍遜于A組，表面可見少許殘余材料(如圖6b所示)，質(zhì)地不如A組，C組可見唇側(cè)骨壁坍塌明顯，高度和寬度下降明顯。

(2)形態(tài)學(xué)測(cè)量

10周測(cè)量實(shí)驗(yàn)各組頰舌側(cè)牙槽窩嵴頂高度差，10周內(nèi)，A，B，C三組的頰舌側(cè)牙槽窩嵴頂高度差分別為1.12±0.13mm，1.38±0.12mm，1.74±0.12mm，如表3所示。三組統(tǒng)計(jì)有顯著性差異。A組牙槽嵴高度和寬度降低明顯小于B組和C組，有效的減緩牙槽骨的吸收。

表3實(shí)驗(yàn)各組頰舌側(cè)牙槽嵴頂高度差(mm)

與C組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05.

(3)X射線顯微CT檢測(cè)

12周，X射線顯微CT顯示A組納米羥基磷灰石/膠原人工骨和礦化引導(dǎo)組織再生膜材料吸收降解，新生骨組織表面疏松多孔，A組新生骨與周圍頰舌側(cè)骨板界限較為模糊，已基本完成骨性結(jié)合，其它兩組界限較A組更為明顯且骨結(jié)合效果不及A組。A組新生骨組織充滿整個(gè)拔牙窩，排列緊密有序。超微結(jié)構(gòu)顯示大量新生的骨小梁緊密有序地排列成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分已改建形成成熟骨，并有部分新生骨小梁正在發(fā)生改建，B組新生骨組織較A組相對(duì)排列比較疏松、無規(guī)則，且數(shù)目少于A組。超微結(jié)構(gòu)表明B組雖形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)但結(jié)構(gòu)立體網(wǎng)狀的緊密有序性差于A組，只有部分新骨完成改建，成熟骨數(shù)量不如A組，成骨效果不如A組。C組新生骨組織最少，排列最為疏松，紊亂。超微結(jié)構(gòu)顯示C組新生骨小梁數(shù)目稀少且未形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，幾乎未見改建后的成熟骨，成骨效果最差。分析三組3個(gè)VOI區(qū)域內(nèi)骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)以及骨小梁分離度之和(Th.Sp)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差見表4。12周六項(xiàng)指標(biāo)組間比較時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BMD，TMD，BV/TV，Tb.Th，Th.N越大，骨結(jié)構(gòu)越趨于穩(wěn)定和成熟，相反Th.Sp越大，骨小梁之間距離越大，三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的緊密有序性越差，骨的結(jié)構(gòu)越差。該結(jié)果可在一定程度上表明A組的成骨效果最為理想。

表4術(shù)后12周三組3個(gè)VOI區(qū)域內(nèi)骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV),骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)以及骨小梁分離度(Th.Sp)之和的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差

Tb.Th，Th.Sp單位為mm，Tb.N單位為mm^-1，BMD單位為g/cm³?！钆cC組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05。