技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種高純度的環(huán)己肽類化合物FR179642的制備方法。
背景技術(shù)：
：真菌對于健康人體而言通常是條件致病菌，當(dāng)肌體免疫力下降，外部因素不良時(shí)，就可能造成局部或全身真菌感染。近年來，隨著廣譜抗生素免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素的不當(dāng)應(yīng)用以及器官移植、放療化療、外科介入等的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致深部真菌感染發(fā)病率日益增高。真菌感染會(huì)侵犯內(nèi)臟器官和深部組織，因此，有效控制深部真菌病具有十分重要的臨床意義。棘白菌素類是近年來新上市的一種抗真菌藥物，能抑制真菌細(xì)胞壁的β-1,3-D-葡萄糖合成酶，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞缺乏β-1,3-D-葡萄糖合成酶，故該類化合物對真菌細(xì)胞具有高度的特異性，能迅速殺滅真菌而對人體正常細(xì)胞影響較小，因而療效好，安全性高。目前已上市的此類藥物有：卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈。米卡芬凈(Micafungin，其結(jié)構(gòu)式如式1所示)由日本藤澤公司開發(fā)，于2002年12月在日本上市，商品名為Fungusrd，2005年3月通過美國FDA認(rèn)證，目前被批準(zhǔn)用于治療食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS患者中性粒細(xì)胞減少癥的預(yù)防治療。米卡芬凈由環(huán)己肽類化合物FR179642(結(jié)構(gòu)式如式2所示)修飾而得到的水溶性半合成的新型抗真菌藥，環(huán)己肽類化合物FR179642是鞘莖點(diǎn)霉Coleophomaempetri發(fā)酵代謝產(chǎn)物。因此，要得到高純度的米卡芬凈，純度高的式2即環(huán)己肽類化合物FR179642是關(guān)鍵。式1：米卡芬凈式2：FR179642目前，關(guān)于環(huán)己肽類化合物FR179642提取分離的文獻(xiàn)報(bào)道較少。中國專利CN102443050A披露了以一種環(huán)脂肽化合物為前體通過酶解掉側(cè)鏈得到FR179642，并報(bào)道了該種前體環(huán)脂肽化合物的分離提純方法，但沒有涉及到FR179642的提純方法。此外還有文獻(xiàn)中報(bào)道由FR179642制備米卡芬凈的合成方法(Ueda,S.；Ezaki,M.；Tanaka,M.；etal.StudiesonanovellipopeptideacylasefromStreptomycesspp.forproductionofFR179642,akeyintermediateofantifungallipopeptidedrugFK463.38thIntersciConfAntimicrobAgentsChemother(Sept241998,SanDiego)1998,AbstF-145)。中國專利CN201110244301.5公開了一種純化環(huán)己肽類化合物FR179642的方法：將發(fā)酵液過濾后進(jìn)行樹脂吸附、解吸、濃縮、結(jié)晶后得到環(huán)己肽類化合物FR179642粗品，然后再借助反向填料C18對粗提物進(jìn)行層析分離，最后得到較高純度(98.1％～98.6％)的環(huán)己肽類化合物FR179642。與本發(fā)明技術(shù)方案相比，現(xiàn)有技術(shù)有如下缺點(diǎn)：1)進(jìn)行樹脂吸附后再進(jìn)行反向填料層析分離，增加了操作步驟和生產(chǎn)成本；2)借助反向填料C18，價(jià)格較貴；3)解吸、結(jié)晶、層析分離過程中均使用了甲醇這種有毒溶劑，對操作人員的身體健康構(gòu)成威脅，且對環(huán)境造成污染，不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域急需找到一種操作步驟簡單、減小生產(chǎn)成本的純化方法，克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，并且，同時(shí)能進(jìn)一步提高環(huán)己肽類化合物FR179642產(chǎn)品的純度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種操作簡便、所用溶劑毒性低、適合于工業(yè)生產(chǎn)的環(huán)己肽類化合物FR179642的制備方法，其特征在于采用大孔樹脂提取分離FR179642，工藝簡單易行，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)；并通過低溫重結(jié)晶進(jìn)一步純化，以制備高純度的環(huán)己肽類化合物FR179642產(chǎn)品。本發(fā)明提供了一種環(huán)己肽類化合物FR179642的純化方法，所述的方法包括如下步驟：1)向環(huán)己肽類化合物FR179642的發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌均勻；2)將步驟1)中加入助濾劑的發(fā)酵液進(jìn)行過濾或者離心，得到環(huán)己肽類化合物FR179642的濾液，并將濾液濃縮；3)將步驟2)中的濃縮液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進(jìn)行富集；4)將極性溶劑與水混合而成的溶液作為解吸液對上述大孔吸附樹脂進(jìn)行解吸并收集，得到解吸混合液；5)向解吸混合液中加入脫色物質(zhì)，攪拌均勻、過濾，得到脫色液；6)將脫色液濃縮，結(jié)晶，真空加熱干燥，得到環(huán)己肽類化合物FR179642的精粉。其中，步驟1)中的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，其用量為發(fā)酵液的2～6％(w/v)。步驟2)中的固液分離方式為離心或板框過濾。步驟2)和步驟6)中的濃縮方法為納濾、旋蒸或閃蒸中的一種或多種，步驟2)濃縮至濃縮液中環(huán)己肽類化合物FR179642含量為1mg/ml～10mg/ml，步驟6)濃縮至濃縮液中環(huán)己肽類化合物FR179642含量為10mg/ml～50mg/ml。步驟3)中的大孔吸附樹脂是非極性或中等極性吸附樹脂。步驟3)中的大孔吸附樹脂選自XAD1600、XAD16HP、XAD1180、XAD7HP、XAD18、XAD16N或XAD761，樹脂柱徑高比為1/5～1/10，其用量與納濾濃縮液中環(huán)己肽類化合物FR179642粗品的體積重量比為70～150：1(ml/g)，吸附流速為0.8～3.2BV/h。步驟4)在解吸前，需用純化水水洗大孔吸附樹脂3～7BV，流速1～2BV；解吸極性溶劑為異丙醇、乙醇、丙酮中的一種，含量為2％～15％(v/v)，體積為2～10BV，流速為0.5～2.0BV；解吸后，收集產(chǎn)品含量在500μg/ml，純度在90％以上的組分，組成解吸混合液。步驟5)中的脫色物質(zhì)為767針用活性炭，加入量為0.05～0.15％(w/v)，優(yōu)選0.08～0.10％；攪拌脫色時(shí)間為10～60min，優(yōu)選20～30min。步驟6)中的結(jié)晶溫度控制在0～25℃，優(yōu)選10～15℃；結(jié)晶時(shí)間為2～16h，優(yōu)選8～12h；真空加熱干燥溫度控制在25～30℃，干燥時(shí)間為4～16h。步驟6)中結(jié)晶可以為一次結(jié)晶或重復(fù)多次結(jié)晶，重復(fù)結(jié)晶時(shí)可采用純化水作為溶劑溶解前次結(jié)晶品，用量為每克濕晶體需加入純化水0.5～5ml。環(huán)己肽類化合物FR179642是合成新型抗真菌藥米卡芬凈的關(guān)鍵中間體，本發(fā)明所得的FR179642產(chǎn)品的含量為97％(重量)以上，純度高達(dá)99％以上，樣品總的回收率大于60％。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明提供了一種成本低廉的純化環(huán)己肽類化合物，特別是棘白菌素類化合物FR179642的新方法；2、本發(fā)明采用大孔吸附樹脂結(jié)合使用脫色劑和低溫重結(jié)晶的方法對環(huán)己肽類化合物FR179642進(jìn)行純化，具有純化路線短、純化條件溫和、產(chǎn)品收率高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在較大程度上減輕了工藝操作和對設(shè)備的要求，降低了生產(chǎn)成本；3、本發(fā)明在采用低濃度的極性有機(jī)溶劑(2％～15％)做洗脫劑，洗脫效率高，大大提高產(chǎn)品的收率，洗脫液用量較少(洗脫液體積為2～10倍濃縮液體積)，對環(huán)境污染小，對操作人員危害較??；4、本發(fā)明后處理過程加入脫色劑對產(chǎn)品進(jìn)行處理，可顯著提高產(chǎn)品色澤和純度；5、本發(fā)明提供的方法制備的環(huán)己肽類化合物FR179642精粉較穩(wěn)定，純度高，有利于終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)；6、使用本發(fā)明提供的方法制備的目標(biāo)產(chǎn)物FR179642完全可以滿足合成新型抗真菌藥米卡芬凈要求，便于米卡芬凈規(guī)模化合成。附圖說明圖1為實(shí)施例1中FR179642發(fā)酵液濾液的HPLC圖譜。圖2為實(shí)施例1中FR179642一次結(jié)晶潮品的HPLC圖譜。圖3為實(shí)施例1中FR179642二次結(jié)晶精粉的HPLC圖譜。具體實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不意味著對本發(fā)明有任何限制。本發(fā)明所用的環(huán)己肽類化合物FR179642發(fā)酵液為重慶乾泰生物醫(yī)藥有限公司發(fā)酵部門用微生物培育手段，得到的FR179642發(fā)酵液或者現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法制備得到含有FR179642的發(fā)酵液，包括但不限于CN102443050A、CN201110244301.5公開的方法得到的FR179642發(fā)酵液；XAD1600樹脂、XAD1180樹脂均來自于鄭州勤實(shí)科技有限公司；乙醇、丙酮等溶劑均為市售。本發(fā)明所用的高效液相色譜儀為島津公司。下述實(shí)施例中環(huán)己肽類化合物FR179642HPLC檢測所用的方法：反相HPLC分析采用的色譜柱為C18柱(4.6mm*250mm*5um)，保持在40℃，以0.05mol/LNaH2PO4:乙腈＝97:3(v/v)作流動(dòng)相，流速為1.0ml/min，并在210nm下UV檢測。具體實(shí)施例實(shí)施例1含有FR179642發(fā)酵液22.7L，發(fā)酵單位為700μg/ml。向其中加入1kg硅藻土，攪拌半小時(shí)后離心分離，得到18.9L濾液(HPLC的圖譜見圖1和表1)。將濾液進(jìn)行閃蒸濃縮，得到濃縮液3.8L，單位為3642μg/ml。將濃縮液導(dǎo)入XAD1600吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為1500ml，上樣流速為2700ml/h。樹脂用12L純化水水洗，流速1800ml/h，然后用12L，5％的乙醇水溶液解吸，流速2700ml/h。每隔300ml收集一個(gè)解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到7.2L解吸混合液。向解吸混合液中加入767針用活性炭7.2g，攪拌30min后過濾得到脫色液。將脫色液進(jìn)行納濾濃縮，濃縮至380ml。再將納濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45℃下濃縮至13ml，然后濃縮液在4℃下攪拌結(jié)晶2h后，得到13.52g潮晶(HPLC的圖譜見圖2和表2)，純度為98.4％。然后用8ml純化水將潮晶溶解，于9℃下攪拌過夜，抽濾，得到的白色晶體進(jìn)行真空加熱干燥，得到9.60g二次結(jié)晶FR179642精粉(HPLC的圖譜見圖3和表3)，純度為99.8％，總收率為60.4％。表1：FR179642濾液的HPLC譜圖數(shù)據(jù)峰保留時(shí)間面積峰高％面積11.1874433946780.12022.195451479927720712.26032.52114601721248083.96542.907797674539462.16653.312646738583401.75663.475520249512621.41374.11818379091252754.99185.85925174136136841468.36197.0501872110090.051107.3831768210970.048118.2015888524080.160129.2653308014440.0901310.46810744738730.2921413.5211441593319043.9151515.6863519412260.0961618.97411649826410.316總計(jì)368251152109533100.000表2：FR179642一次潮晶的HPLC譜圖數(shù)據(jù)峰保留時(shí)間面積峰高％面積13.38326242810.01923.823181123173461.28334.15045584930.03245.2821389919394267098.44856.167129600.00966.96450043000.035711.121245098100.174總計(jì)14118308961901100.00表3：FR179642精粉的HPLC譜圖數(shù)據(jù)峰保留時(shí)間面積峰高％面積13.8611112213590.17724.111441490.00735.349627269746745299.80747.068582430.009總計(jì)6284842468903100.00實(shí)施例2發(fā)酵液FR179642放罐73.6L，發(fā)酵單位為628μg/ml。向其中加入1.5kg硅藻土，攪拌半小時(shí)后板框壓濾，得到62.1L濾液(HPLC峰型與圖1相似)。將濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到濃縮液13.3L，發(fā)酵單位為3642μg/ml。將濃縮液導(dǎo)入XAD1600吸附樹脂(φ15*100cm)，裝量為3.4L，上樣流速為10.8L/h。樹脂用80L純化水水洗，流速13.2L/h，然后用26L，5％的丙酮水溶液解吸，流速13.2ml/h。每隔600ml收集一個(gè)解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到解吸混合液22.4L。向解吸混合液中加入767針用活性炭20g，攪拌脫色處理30min后過濾得到脫色液。然后將脫色液進(jìn)行納濾濃縮，濃縮至5600ml，再將納濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45℃下濃縮至600ml。然后濃縮液在4℃下攪拌結(jié)晶2h后，得到28.6g潮晶(HPLC的峰型與圖2相似)，純度為98.7％。然后用50ml純化水將潮晶50℃下攪拌20min，再在室溫條件下攪拌30min，最后于8℃下攪拌過夜，抽濾得到的白色晶體進(jìn)行真空加熱干燥，得到26.7g二次結(jié)晶FR179642精粉(HPLC的峰型與圖3相似)，純度為99.3％，總收率為58.3％。實(shí)施例3發(fā)酵液FR179642放罐4.9L，發(fā)酵單位為1350μg/ml。向其中加入0.2kg珍珠巖，攪拌半小時(shí)后，抽濾分離，得到4.7L濾液(HPLC峰型與圖1相似)。將濾液進(jìn)行閃蒸濃縮，得到濃縮液1.5L，發(fā)酵單位為4410μg/ml。將濃縮液導(dǎo)入XAD1180吸附樹脂(φ4*50cm)，裝量為790ml，上樣流速為1000ml/h。樹脂用4L純化水水洗，流速1000ml/h，然后用15L，15％的乙醇水溶液解吸，流速800ml/h。每隔200ml收集一個(gè)解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到解吸混合液1.4L。向解吸混合液中加入767針用活性炭1.5g，攪拌脫色處理25min后，過濾，得到脫色液。然后將脫色液進(jìn)行納濾濃縮至350ml后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45℃下濃縮至10ml，然后濃縮液在8℃下攪拌結(jié)晶3h后，得到4.7g潮晶(HPLC峰型與圖2相似)，純度為98.5％。再用4ml純化水將潮晶溶解，于10℃下攪拌過夜，抽濾，得到的晶體進(jìn)行真空加熱干燥，得到4.12g二次結(jié)晶FR179642精粉(HPLC峰型與圖3相似)，純度為99.1％，總收率為62.3％。實(shí)施例4發(fā)酵液FR179642放罐34.3L，發(fā)酵單位為850μg/ml。向其中加入2.1kg硅藻土，攪拌半小時(shí)后抽濾分離，得到28.5L濾液(HPLC峰型與圖1相似)。將濾液進(jìn)行閃蒸濃縮，得到濃縮液5000ml，發(fā)酵單位為,5830μg/ml。將濃縮液導(dǎo)入XAD1180吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為2.0L，上樣流速為2400ml/h。樹脂用12L純化水水洗，流速2000ml/h，然后用12L，15％的丙酮水溶液解吸，流速2400ml/h。每隔500ml收集一個(gè)解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，得到解吸混合液10.9L。向解吸混合液中加入767針用活性炭10.5g，攪拌脫色處理25min后，過濾，得到脫色液。然后將脫色液進(jìn)行納濾濃縮，濃縮至650ml。再將納濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45℃下濃縮至16ml后在8℃下攪拌結(jié)晶4h后，得到21.5g潮晶(HPLC峰型與圖2相似)，純度為98.3％。然后用12ml純化水將潮晶溶解，于4℃下攪拌過夜，抽濾，得到的白色晶體進(jìn)行真空加熱干燥，得到17.3gFR179642精粉(HPLC峰型與圖3相似)，純度為99.0％，總收率為59.3％。對比實(shí)施例1含有FR179642發(fā)酵液22.7L，發(fā)酵單位為700μg/ml。向其中加入1kg硅藻土，攪拌半小時(shí)后離心分離，得到18.9L濾液。將濾液進(jìn)行閃蒸濃縮，得到濃縮液3.8L，單位為3642μg/ml。將濃縮液導(dǎo)入XAD1600吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為1500ml，上樣流速為2700ml/h。樹脂用20％的乙醇洗滌，流速1800ml/h，然后用50％的乙醇水溶液解吸，流速2700ml/h。每隔300ml收集一個(gè)解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，組成解吸混合液。然后將解吸混合液進(jìn)行納濾濃縮，濃縮至380ml。最后將納濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45℃下濃縮至13ml，純度為90.2％，總收率為31.8％。對比實(shí)施例2含有FR179642發(fā)酵液22.7L，發(fā)酵單位為700μg/ml。向其中加入1kg硅藻土，攪拌半小時(shí)后離心分離，得到18.9L濾液。將濾液進(jìn)行閃蒸濃縮，得到濃縮液3.8L，單位為3642μg/ml。將濃縮液導(dǎo)入XAD1600吸附樹脂(φ8*80cm)，裝量為1500ml，上樣流速為2700ml/h。樹脂用40％的乙醇洗滌，流速1800ml/h，然后用60％的乙醇水溶液解吸，流速2700ml/h。每隔300ml收集一個(gè)解吸組分，并將純度在90％以上的組分混合，組成解吸混合液。然后將解吸混合液進(jìn)行納濾濃縮，濃縮至380ml。最后將納濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在45℃下濃縮至13ml，純度為90.5％，總收率為30.2％。當(dāng)前第1頁1 2 3