本發(fā)明涉及新的環(huán)肽衍生物，更加具體地涉及通過環(huán)肽上特定的硫轉(zhuǎn)化砜或者亞砜結(jié)構(gòu)，從而得到新的衍生物。此外，本發(fā)明涉及含有這些化合物的藥物和這些化合物在制備藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)肽化合物是十分重要的一類藥物基本結(jié)構(gòu)。而在環(huán)肽化合物中，含硫或者含硫橋的環(huán)肽衍生物極具有特色。例如，Romidepsin就是其中之一的例子。
1994年來自Fujisawa的研究人員首先報道了從Chromobacterium violaceum了分離得到了Romidepsin。該化合物只有很微弱或者根本沒有抗菌活性，卻對各種腫瘤細(xì)胞有抑制作用而對正常細(xì)胞則沒有影響。動物腫瘤模型試驗表明，Romidepsin具有明顯的抗癌作用(Ueda H,Nakajima H,Hori Y,et al.FR901228,a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum No.968.I.Taxonomy,fermentation,isolation,physico-chemical and biological properties,and antitumor activity[J].The Journal of antibiotics,1994,47(3):301-310.)。
Harvard大學(xué)的科研人員于1996年第一報道了Romidepsin的全合成(Li K W,Wu J,Xing W,et al.Total synthesis of the antitumor depsipeptide FR-901,228[J].Journal of the American Chemical Society,1996,118(30):7237-7238.)。然而，其作用機理直到1998年才通過與HDAC抑制劑trichostatin A進(jìn)行了全面比較從而獲得證實(Nakajima H,Kim Y B,Terano H,et al.FR901228,a potent antitumor antibiotic,is a novel histone deacetylase inhibitor[J].Experimental cell research,1998,241(1):126-133.)。
在美國國立癌癥研究院的資助下，1997年開始對Romidepsin臨床-I期研究。在后來進(jìn)行的II-期臨床試驗中，針對潛力腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等進(jìn)行了治療試驗研究。但是，最好的治療效果來自對皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和外周T細(xì)胞淋巴瘤的治療研究(Clinical Trials.gov NCT00098397.Retrieved on November 8,2009.Clinical Trials.gov NCT00085527.Retrieved on November8,2009.Clinical Trials.gov NCT00104884.Retrieved on November 8,2009.Clinical Trials.gov NCT00084461.Retrieved on November 8,2009.Clinical Trials.gov NCT00062075.Retrieved on November 8,2009)。
2004年，Romidepsin獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入“快速通道”，擬用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。此外，F(xiàn)DA和歐洲藥品管理局同時批準(zhǔn)Romidepsin可以作用孤兒藥開發(fā)，用于治療某些特別的腫瘤。而最終，Romidepsin在2009年獲得FDA批準(zhǔn)上市，用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。
但是，由于Romidepsin存在一些副作用，包括貧血、血小板減少、白細(xì)胞減少癥等，吸引了眾多的結(jié)構(gòu)優(yōu)化的努力，以提高療效進(jìn)一步降低副作用([No authors listed](November 2009)."ISTODEX Label Information".U.S.Food and Drug Administration.Retrieved 2009-11-07)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明通過對環(huán)肽分子上的硫特別是硫橋原子改造成為有砜或者亞砜，從而得到一類新的衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式I所示：
其中：n＝0，1，2；m＝0，1。
R1和R2獨立選自H、烷基、硝基、氰基、鹵素、鹵代烷基、鹵代烯基、羥基、羥烷基、烷氧基、烷氧羰基、芳基氧基、烯氧基、炔氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、酰胺基、烷基氨基羰基、磺?；?、烷基磺?；⑼榛鶃喕酋；被酋；Ⅴ；?、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、環(huán)烷基雜烷基、雜環(huán)烷基雜烷基、雜芳基雜烷基、芳基雜烷基。
L選自:
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，R1和R2獨立優(yōu)選自H、C1－C6烷基、C1－C6烷氧基。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，L優(yōu)選自:
本發(fā)明所述式(I)化合物選自：
本發(fā)明提供了一種制備式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體或者光學(xué)異構(gòu)體的方法，所述方法包括：式(II)化合物經(jīng)氧化劑氧化得到式(I) 化合物，
其中，R1，R2，L，n，m如上述所定義，M選自-S-，-S-S-，-S-S-S-。
在優(yōu)選的實施方案中，其中所述氧化劑選自間氯過氧苯甲酸，過氧乙酸，過硫酸氫鉀復(fù)合鹽(Oxone)，過氧化氫異丙苯，過氧化氫叔丁醇，過氧丙酮，雙氧水(H2O2)。
在優(yōu)選的實施方案中，將合適的起始原料溶于合適溶劑(例如但不限于二氯甲烷等)中，加入0.001-2當(dāng)量的合適氧化劑，在-20-60℃下，攪拌反應(yīng)一定的時間，即可得通式I化合物。合適的氧化劑包括但不限于：間氯過氧苯甲酸，過氧乙酸，過硫酸氫鉀復(fù)合鹽(Oxone)，過氧化氫異丙苯，過氧化氫叔丁醇，過氧丙酮，雙氧水(H2O2)。
在優(yōu)選的實施方案中，L為含有亞砜的結(jié)構(gòu)片斷的式I化合物存在立體異構(gòu)體，相應(yīng)的立體異構(gòu)體可以通過但不限于HPLC來分離。例如，通過硅膠柱來分離可以得到但不限于化合物A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、C4、D1、D2、D3、E1、E2、F1、F2、F3。
本發(fā)明提供了包括有效劑量的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體或者光學(xué)異構(gòu)體的藥物組合物，其中所述藥物組合物為適于經(jīng)口、直腸、腸胃外、鼻內(nèi)或經(jīng)皮給藥或通過吸入或通過栓劑給藥的形式，所述藥物組合物為片劑、膠囊、錠劑、糖錠、水或油懸劑、可分散性粉劑或顆粒劑或舌下片劑的形式。
本發(fā)明公開了式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、立體異構(gòu)體或者光學(xué)異構(gòu)體在治療由細(xì)胞增殖和/或血管新生所導(dǎo)致、與該增殖和/或新生關(guān)聯(lián)或伴隨的病癥的應(yīng)用，其中，所述病癥選自：抗增生性病癥(例如癌癥)；神經(jīng)變性疾 病，包括：亨廷頓病、聚谷氨酰胺病、帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇發(fā)作、紋狀體黑質(zhì)變性、進(jìn)行性核上性麻痹、扭轉(zhuǎn)張力不全、痙攣性斜頸和運動障礙、家族性震顫、抽動穢語綜合癥、彌漫性Lewy體疾病、皮克病、顱內(nèi)出血、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、脊髓性肌肉萎縮癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、肥大性間質(zhì)性多神經(jīng)病、視網(wǎng)膜色素變性、遺傳性視神經(jīng)萎縮、遺傳性痙攣性截癱、進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)癥和Shy-Drager癥候群；代謝性疾病，包括:2型糖尿??；眼部退化疾病，包括：青光眼、老年黃斑變性、虹膜紅變性青光眼；炎性疾病和/或免疫系統(tǒng)病癥，包括：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、骨性關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、牛皮癬、哮喘、脊椎關(guān)節(jié)病變、牛皮癬、克羅恩病、炎性腸病、結(jié)腸潰瘍、酒精性肝炎、糖尿病、Sjoegrens綜合征、多發(fā)性硬化癥、強直性脊椎炎、膜性腎小球病、椎間盤性疼痛、全身性紅斑狼瘡；涉及血管新生的疾病，包括：癌癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；心理病癥，包括：雙相性精神障礙、精神分裂癥、躁狂癥、抑郁和癡呆；心血管疾病包括：心力衰竭、再狹窄和動脈硬化；纖維化疾病，包括：肝纖維化、囊性纖維病和血管纖維痛；感染性疾病，包括：真菌感染，例如：白色念珠菌，細(xì)菌感染、病毒性感染，例如：單純皰疹，原蟲感染，例如：瘧疾、利什曼原蟲感染、布氏錐蟲感染、弓形體病和球蟲??；以及造血性病癥，包括：海洋性貧血、貧血和鐮狀細(xì)胞性貧血。
本文所用的術(shù)語“未取代的”表示不存在取代基或僅有的取代基為氫。
本文所用的術(shù)語“任選取代”表示該基團(tuán)可經(jīng)一或多個非氫取代基進(jìn)一步取代或稠合。這些取代基獨立選自下面的一或多個基團(tuán)：鹵素、＝O、＝S、-CN、-NO2、-CF3、-OCF3、烷基、鹵代烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、環(huán)烷基雜烷基、雜環(huán)烷基雜烷基、雜芳基雜烷基、芳基雜烷基、羥基、烷氧基、羥基烷基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、?；被?、烷基磺酰基和?；?。
“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。
作為基團(tuán)或基團(tuán)的部分，“烷基”為C1-C14直鏈或支鏈脂族烴基團(tuán)，另有說明的除外。優(yōu)選的烷基包括C1－C6烷基，更優(yōu)選甲基、乙基、丙基、異丙基、3,3-二甲基丁基、丁基、戊基，特別優(yōu)選異丙基。
“雜原子”指S、O和N原子。
“雜烷基”是指直鏈或含有支鏈烷基的基團(tuán)，并且在主鏈中，至少含有一個或多個選自S，O和N的雜原子。雜烷基優(yōu)先選擇含有2-14個原子鏈。雜烷基包括，但不限于：醚類、硫醚類、烷基酯類，第二或第三烷基胺類、烷基亞磺酸類等。
“環(huán)烷基”是指飽和或部分飽和的單環(huán)、稠環(huán)或螺環(huán)的碳環(huán)。以3-9個碳原子組成的環(huán)為優(yōu)先選擇。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“環(huán)烯基”是指非芳香性單環(huán)或多環(huán)環(huán)系。其中至少含有一個碳-碳雙鍵且每環(huán)優(yōu)選具有5-10個碳原子。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“雜環(huán)烷基”是指至少含有一個雜原子的環(huán)烷基。優(yōu)選含有1-3個雜原子。優(yōu)選的環(huán)為3-14元環(huán)，更優(yōu)先選擇的環(huán)為4-7元環(huán)。環(huán)烷基、雜原子的定義如上所述。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“芳基”表示可被任選取代的單環(huán)或稠多環(huán)、芳香族的碳環(huán)(芳基基團(tuán)可被一個或多個取代基取代)，每環(huán)優(yōu)選包含5至12個碳原子(環(huán)原子均為碳的環(huán)狀構(gòu)造)。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“雜芳基”指含有芳環(huán)的基團(tuán)，其在芳環(huán)的環(huán)原子中具有一或多個雜原子。雜原子的定義如上所述。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。雜芳基基團(tuán)可被一個或多個取代基取代。
“環(huán)烷基烷基”表示環(huán)烷基-烷基，其中環(huán)烷基和烷基部分如上所述，該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“芳基烷基”是指：(芳基-烷基)的基團(tuán)。其中，芳基和烷基見本文有關(guān)定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“雜芳基烷基”是指(雜芳基-烷基)的基團(tuán)。其中，芳基和烷基部分見本文有關(guān)定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“芳基雜烷基”是指(芳基-雜烷基)的基團(tuán)。其中，芳基和雜烷基見本文有關(guān)定義，該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“環(huán)烷基雜烷基”是指(環(huán)烷基-雜烷基)的基團(tuán)。其中，環(huán)烷基和雜烷基見本文有關(guān)定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“雜環(huán)烷基雜烷基”是指(雜環(huán)烷基-雜烷基)的基團(tuán)。其中，雜環(huán)烷基和雜 烷基見本文有關(guān)定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“雜芳基雜烷基”是指(雜芳基-雜烷基)的基團(tuán)。其中，雜芳基和雜烷基見本文有關(guān)定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“氨基烷基”是指(氨基-烷基)的基團(tuán)。其中，烷基見本文有關(guān)定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“烷氧基”指-O-烷基，其中烷基如本文所定義。該烷氧基優(yōu)選C1-C6烷氧基。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“環(huán)烷氧基”指-O-環(huán)烷基，其中環(huán)烷基如本文定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“烯氧基”指-O-低級烯烴-，其中低級烯烴如本文所定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“炔氧基”指-O-低級炔烴-，其中低級炔烴C2-C6的鏈炔烴。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)?！胺蓟趸敝?O-芳基-，其中芳基如本文定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“雜環(huán)烷氧基”指-O-雜環(huán)烷氧基-，其中雜環(huán)烷基如本文定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
除非另有說明，否則“烷基氨基”指單烷基氨基和二烷基氨基?！皢瓮榛被敝?NH-烷基，其中烷基如上定義?！岸榛被敝?N(烷基)2，其中各烷基可以相同或不同，且都符合本文關(guān)于烷基的定義。該基團(tuán)可為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
除非指定，否則“芳基氨基”包括單芳基氨基和二芳基氨基?！皢畏蓟被北硎臼椒蓟?NH-，其中芳基如上定義。二芳基氨基表示式(芳基)2N-，其中各芳基可以相同或不同，且都符合本文對芳基的定義。該基團(tuán)可以為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“?；北硎就榛?CO-，其中烷基如本文所定義。該基團(tuán)可以為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“磺?；北硎?S(O)2-。該基團(tuán)可以為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“?；被北硎??；?氨基)-的基團(tuán)，其中?；绫疚乃x。該基團(tuán)可以為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“氨基磺酰基”表示(氨基-磺?；?-的基團(tuán)，其中磺酰基如本文所定義。 該基團(tuán)可以為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“烷基磺酰基”指-S(O)2-烷基，“烷基亞磺?；敝?SO-烷基，其中烷基如本文所定義。該基團(tuán)可以為末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。
“羥基烷基”是指-烷基-羥基的基團(tuán)。其中烷基如本文所定義。
本發(fā)明包括通式(Ⅰ)所表示的化合物及其可能的各種異構(gòu)型式。包括：非鏡像異構(gòu)體、鏡像異構(gòu)體、互變異構(gòu)體和“E”或“Z”構(gòu)型異構(gòu)體的幾何異構(gòu)體等。任何具有一定基礎(chǔ)的化學(xué)工作者均可以分離出上述光學(xué)純或者立體異構(gòu)純的化合物。
本發(fā)明包括通式(Ⅰ)所表示的化合物及其可能的消旋體或/和鏡像異構(gòu)物/或/和非鏡像異構(gòu)物的混合物。
此外，通式(Ⅰ)所表示的化合物在應(yīng)用上也涵蓋該化合物的溶劑化及非溶劑化型式。因此，各式均包括具有所指明構(gòu)造的化合物，包括其水合及無水合型式。
除了通式(Ⅰ)所表示的化合物的外，還包括藥學(xué)上可接受的鹽，前藥和該等化合物的活性代謝物。和該等代謝物的藥學(xué)上可接受的鹽。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指上述化合物能保持原有生物活性并且適合于醫(yī)藥用途的某些鹽類。通式(Ⅰ)所表示的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽有兩種形成形式：一是與酸形成的鹽；另一是與堿或者堿金屬形成的鹽。與通式(Ⅰ)所表示的化合物形成藥學(xué)上可接受的鹽的酸包括無機酸和有機酸。合適的無機酸包括：鹽酸、硫酸和磷酸。合適的有機酸可選自脂肪族、環(huán)脂肪族、芳香性、雜環(huán)羧酸和磺酸類有機酸；其實例包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、甘氨酸、精氨酸、檸檬酸、反丁烯二酸、烷基磺酸、芳級磺酸等。與通式(Ⅰ)所表示的化合物形成藥學(xué)上可接受的鹽的堿金屬包括：鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、鋁、鋅等；與通式(Ⅰ)所表示的化合物形成藥學(xué)上可接受的鹽的堿包括：膽堿、二乙醇胺、嗎啉等。
“前藥”是一種通式(Ⅰ)所表示的衍生物，借助于在體內(nèi)代謝的方式將其于活體內(nèi)轉(zhuǎn)化(例如：藉由水解，還原或氧化)成通式(Ⅰ)所表示的化合物。例如，可以將通式(Ⅰ)所表示的、含有羥基基團(tuán)的化合物與酸反應(yīng)制備成相應(yīng)的酯。相應(yīng)的酯即為前藥，可以再活體內(nèi)水解母體藥物。適合來制備“前藥”的酸包括但不限于：乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、草酸、水楊酸、琥珀酸、反丁烯 二酸、順丁烯二酸、亞甲基-雙-β-羥基萘酸、龍膽酸、羥乙基磺酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。
具體實施方式
在下列實施例中，除非另有指明，所有溫度單位為攝氏度。
本發(fā)明的Romidepsin是采用專利CN103173390A方法通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)制備得到(白驊等，一種紫色桿菌菌株及其應(yīng)用：CN103173390A[P].2013-06-26)，本發(fā)明的三硫醚環(huán)肽是采用引用專利CN104072589A方法制備得到(白驊等，抗腫瘤三硫化合物及其制備方法與應(yīng)用：CN104072589A[P].2014-10-01)，其他各種起始原料和試劑均來自市售。供應(yīng)商包括但不限于：Aldrich Chemical Company、Lancaster Synthesis Ltd等等。除非另有指明，市售原料和試劑均不經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。玻璃器皿用烘箱干燥和/或加熱干燥。
1H-NMR圖譜是用Bruker儀器(400MHz)測定而得，化學(xué)位移用ppm表示。使用氯仿作為參照標(biāo)準(zhǔn)(7.25ppm)或四甲基硅烷內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(0.00ppm)。視需要，也可以使用其它NMR常用的溶劑。1H NMR的表示方法：s＝單峰，d＝雙重峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝加寬的，dd＝雙重峰的雙重峰，dt＝三重峰的雙重峰。若提供偶合常數(shù)時，其單位為Hz。
高分辨質(zhì)譜是用Bruker儀器(micrOTOF-QII)測定得到，離子化方式可為ESI。
以下的實例僅僅是用來說明所發(fā)明的具體化合物的合成方法。但在合成方法上并沒有任何限制。在實施例中未列出的化合物，也可以用與下面同樣的合成路線與合成方法，選擇適當(dāng)?shù)钠鹗荚希谟斜匾牡胤缴约舆m當(dāng)?shù)某ＷR性的反應(yīng)條件調(diào)整即可制備。
實施例1
化合物A、B、C的合成
將1g Romidepsin溶于10ml二氯甲烷中，加入0.38g間氯過氧苯甲酸(3-Chloroperbenzoic acid，MCPBA),在0℃下，攪拌反應(yīng)2小時，HPLC監(jiān)測反應(yīng)終點。反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC(分離條件：流動相：A:水B:乙腈(2min:A 80％,B 20％；16min:A 20％,B 80％；18min:A 20％,B 80％；18.2min:A 80％,B 20％；21min:A 20％,B 80％)；色譜柱：C18，5um，21.2X150mm；流速：10ml/min；檢測波長：w＝214)分離，分別得到化合物A、化合物B和化合物C?；衔顰、化合物B和化合物C通過HPLC(分離條件：流動相：A:水/乙腈/三氟乙酸＝90/10/0.1B:乙腈/水＝90/10(5min:A 15％,B 85％；55min:A 25％,B 75％；55.5min:A 25％,B 75％；56min:A 15％,B85％；61min:A 15％,B 85％)；色譜柱：C18，5um，21.2X150mm；流速：10ml/min；檢測波長：w＝214)分離得化合物A1，A2，A3，B1，B2，B3，C1，C2，C3，C4，它們的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如表1。
實施例2
化合物D、E、F的合成
將1g三硫醚環(huán)肽溶于10ml二氯甲烷中，加入0.38g間氯過氧苯甲酸(3-Chloroperbenzoic acid，MCPBA)，在0℃的溫度下，攪拌反應(yīng)2小時，HPLC監(jiān)測反應(yīng)終點。反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC(分離條件：流動相：A:水，B:乙腈(2min:A80％,B 20％；16min:A 20％,B 80％；18min:A 20％,B 80％；18.2min:A 80％,B 20％；21min:A 20％,B 80％)；色譜柱：C18，5um，21.2X150mm；流速：10ml/min； 檢測波長：w＝214)分離，分別得到化合物D、化合物E和化合物F?；衔顳、化合物E和化合物F通過HPLC(分離條件：流動相：A:水/乙腈/三氟乙酸＝90/10/0.1，B:乙腈/水＝90/10(5min:A 15％,B 85％；55min:A 25％,B 75％；55.5min:A 25％,B 75％；56min:A 15％,B85％；61min:A 15％,B 85％)；色譜柱：C18，5um，21.2X150mm；流速：10ml/min；檢測波長：w＝214)分離得化合物D1，D2，D3，E1，E2，F(xiàn)1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，它們的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)見表1。
表1本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)
一.本發(fā)明化合物的體外活性試驗驗證：
通過體外細(xì)胞活性證明本發(fā)明的生物學(xué)功效。利用SRB法(磺酰丹明染色法，Sigma Pte Ltd)測定本發(fā)明之化合物的體外抗癌活性。將人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF7)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人肺癌細(xì)胞(NCI-H460)、人早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)、人肝腫瘤細(xì)胞(HEPG2)和小鼠成纖維細(xì)胞(L929)細(xì)胞接種于96孔板，150μL/孔，每孔分別為4000～6000個細(xì)胞,孔板的第一排加150μL/孔的培養(yǎng)基，將96孔板于37℃,5％CO2,100％相對濕度培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時。配制10uM的化合物溶液加入96孔板中，50μL/孔?？装宓谝慌藕偷诙欧謩e設(shè)置為空白對照(細(xì)胞培養(yǎng)液，不含細(xì)胞)和無藥對照孔(不加藥物，加等量完全培養(yǎng)基)。于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱在全濕(100％相對濕度)條件下培養(yǎng)48h。于培養(yǎng)液液面上加入50μL預(yù)冷的50％(質(zhì)量/體積)TCA固定細(xì)胞。然后在4℃中放置1h，棄上清，各孔用去離子水洗滌3遍，以去除TCA和血清蛋白等。在空氣中干燥后，每孔加足夠量的0.4％SRB(用1％乙酸配制)約100μL，室溫放置20～30min。棄去各孔內(nèi)液體，各孔用去離子水洗滌3遍，然后快速用1％乙酸洗滌2遍?？諝庵懈稍镏钡娇床灰姖駳夂?，用150μL Tris base溶解，在平板振蕩器上振蕩30min，隨后在多功能儀上(M5detection system,MD Group Ltd.)測定，690nm空白對照調(diào)零，檢測波長為515nm，測定其抑制率。
表2本發(fā)明化合物體外活性數(shù)據(jù)
Selective Index:化合物對正常細(xì)胞GI50和腫瘤細(xì)胞平均GI50的比值，數(shù)值越大表明化合物的安全性越高，化合物對腫瘤細(xì)胞的選擇性越高。
體外活性數(shù)據(jù)表明：本發(fā)明化合物A對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用與Romidepsin相當(dāng)，化合物A對正常細(xì)胞的殺傷作用比Romidepsin對正常細(xì)胞的殺傷作用小，化合物A對腫瘤細(xì)胞的選擇性比Romidepsin對腫瘤細(xì)胞的選擇性高。
二.體內(nèi)藥效學(xué)篩選
1.動物模型建立
取5-6周齡雌性或雄性BALB/C裸鼠，體重約18-20克，飼養(yǎng)。建造人癌裸鼠異體移植性腫瘤模型：人類乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB231、人類肺癌細(xì)胞株NCI-H460，均來自ATCC。培養(yǎng)，將單層培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞消化脫壁后，收集并重懸于不含血清的培養(yǎng)液，調(diào)整到濃度2×106/0.2mL，放于冰盒中攜至動物房，直接用帶6號針頭的注射器取0.2mL細(xì)胞懸液移植于裸鼠左腋窩后方肩胛部皮下，2×106/0.2mL/只，每2-3天測一次成瘤體積，兩周后選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤裸鼠，在無菌條件下，取出腫瘤，將瘤組織剪成直徑約2-3mm接種于裸鼠左腋窩后方肩胛部皮下，傳三代后，當(dāng)腫瘤體積生長至100mm3時去掉瘤塊過大或過小的裸鼠隨機分組給藥。
2.篩選化合物
隨機分5個組，包括陰性對照組(溶媒)，陽性對照組(Romidepsin，2.4mg/kg)，化合物A高中低三個劑量的治療組(分別為7.2mg/kg，4.8mg/kg，2.4mg/kg，其中高劑量低于MTD)，每組6只裸鼠，靜脈注射給藥，每4天一次，給藥4次。期間每2天檢測動物體重，瘤體積并記錄動物死亡數(shù)。末次給藥后24小時處死動物，測量腫瘤體積大小、瘤重、裸鼠體重，繪制腫瘤體積生長曲線、裸鼠體重生長曲線和腫瘤抑制率，動物死亡率，計算相對腫瘤增殖率T/C(％)，根據(jù)公式T/C(％)＝TRTV/CRTV*100％。(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV，相對腫瘤體積RTV＝Vt/V0，其中V0為分組給藥時腫瘤體積，Vt 為給藥后腫瘤體積)。
3.篩選結(jié)果
通過體內(nèi)藥效篩選實驗，以Romidepsin作為陽性藥，結(jié)果顯示化合物A在體內(nèi)具有較好的抑制腫瘤生長作用，并且具有劑量效應(yīng)關(guān)系，同等劑量下抗腫瘤作用與Romidepsin藥效相當(dāng)，篩選結(jié)果見表3。
表3化合物A對裸鼠腫瘤模型抑瘤率
三.化合物對血球影響
1.實驗方法
BAB-C小鼠飼養(yǎng)一周后，分成3組，正常組，Romidepsin組，化合物A組，正常組注射溶劑，藥物組注射0.5mg/kg藥物，分別于給藥后24h和48h進(jìn)行血球分析(CBC)，所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),組間數(shù)據(jù)兩兩采用T檢驗。
2.實驗結(jié)果
血球分析結(jié)果表明Romidepsin給藥后，具有顯著性殺傷白細(xì)胞(WBC)作用，在24h時，白細(xì)胞下降75％，在48h時恢復(fù)至正常組的40％；化合物A在24h和48h時，白細(xì)胞與正常組相比，未見顯著性差異，實驗結(jié)果表明化合物A在體內(nèi)對WBC無影響；Romidepsin和化合物A給藥后，動物PLT24h和48h時較正常組均有顯著性降低，Romidepsin和化合物A兩組無顯著 性差異(結(jié)果見表4)。本實驗結(jié)果表明化合物A作為化療藥物用于腫瘤治療時，相對于Romidepsin將不會產(chǎn)生白細(xì)胞降低的副作用，不對機體的免疫細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。
表4化合物A對血球影響
*p<0.05vs正常組；**p<0.01vs正常組
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