本發(fā)明涉及下式的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA代表L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-C(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl)殘基)，涉及它的制備，涉及它對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，涉及它對腫瘤生長的抑制作用，進(jìn)一步涉及它的抗炎活性。結(jié)果表明，3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定義同上)是具有抗腫瘤和抗炎雙重活性的化合物。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥是一組可影響身體任何部位的多種疾病的通稱。使用的其它術(shù)語為惡性腫瘤和贅生物。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，癌癥是世界上的頭號死因之一，尤其是在發(fā)展中國家。而全世界癌癥死亡人數(shù)預(yù)計(jì)將繼續(xù)上升，到2030年將超過1310萬。因此，開發(fā)新的高效，低毒，毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是新藥研究的重要課題之一。

隨著對腫瘤特性和發(fā)病本質(zhì)的認(rèn)識，發(fā)明人曾經(jīng)公開下式代表的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表L-氨基酸殘基)在1μmol/kg劑量下顯示一定的抗腫瘤活性。通過進(jìn)一步研究發(fā)明人認(rèn)識到，在3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl的6-甲?；虯A-OBzl基之間插入Trp殘基，不僅可以延緩它的代謝達(dá)到提高抗腫瘤活性的目的，而且可以獲得抗炎癥活性。炎癥是危害腫瘤患者預(yù)后的并發(fā)癥。通過這種修飾，獲得的下面通式的具有抗腫瘤和抗炎癥雙重活性的化合物，具有良好的臨床應(yīng)用前景。根據(jù)這些認(rèn)識，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個內(nèi)容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(1(式中AA代表L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-C(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl)殘基)。

本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定義同上)的合成方法，該方法包括：

(1)L-組氨酸在稀硫酸催化下與甲醛進(jìn)行Pictet-Spengler縮合生成6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸轉(zhuǎn)化為6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高錳酸鉀氧化為3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)Boc-Trp與氨基酸芐酯(選自L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-C(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl氨基酸芐酯)偶聯(lián)得到Boc-Trp-AA-OBzl；

(6)Boc-Trp-AA-OBzl(式中AA的定義同上)在4N氯化氫/乙酸乙酯中得到L-Trp-AA-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸與L-Trp-AA-OBzl偶聯(lián)得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl。

本發(fā)明的第三個內(nèi)容是評價3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定義同上)對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

本發(fā)明的第四個內(nèi)容是評價3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定義同上)對S180小鼠腫瘤生長的抑制作用。

本發(fā)明的第五個內(nèi)容是評價3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl(式中AA的定義同上)對ICR雄性小鼠耳腫脹模型上的抗炎活性。

附圖說明

圖1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-AA-OBzl的合成路線.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，三乙胺，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；vi)4N氯化氫/乙酸乙 酯，0℃；vii)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，DMF；viii)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，DMF。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1制備6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)

10.00g(64.5mmol)L-組氨酸，30mL水混合于100mL茄瓶中，冰浴下用恒壓漏斗逐滴加入2mL濃硫酸，隨濃硫酸的加入，原料逐漸溶解，待其完全溶解后，向反應(yīng)液中加入10mL40％的甲醛溶液，在微波加速反應(yīng)儀65℃下反應(yīng)5小時。反應(yīng)完畢后，冰浴下緩慢滴加濃氨水調(diào)溶液pH 7，有大量無色沉淀析出，減壓過濾，得到10.76g(99.2％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：168[M+H]⁺。

實(shí)施例2制備6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(2)

冰浴下在100mL茄瓶里加15.6mL甲醇，用恒壓漏斗緩慢滴加1.56mL二氯亞砜，30min后加入1.00g(6mmol)6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室溫反應(yīng)3天后，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，反應(yīng)混合物減壓濃縮，殘留物加甲醇溶解并減壓濃縮。該操作重復(fù)3次得白色泡狀固體，再加乙醚抽干重復(fù)3次得無色粉末，最后用甲醇/乙醚重結(jié)晶得0.58g(53％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

實(shí)施例3制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)

冰浴下在100mL茄瓶里加1.1g(6.1mmol)6S-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)，加DMF使溶解。向該溶液中滴加1mL三乙胺調(diào)pH 8，分3次加入1.2g(7.6mmol)高錳酸鉀。反應(yīng)6小時后，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢。反應(yīng)物減壓濃縮至干，得到的黑色固體用1N HCl溶液溶解，冰浴下滴加2N NaOH溶液調(diào)pH 7，析出大量無色固體。該固體以二氯甲烷/甲醇為洗脫劑用硅膠柱純化，得0.68g(63％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

實(shí)施例4制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(4)

冰浴下在100mL茄瓶里加40mL NaOH溶液(2N)，10min后加入5.30g(29.9mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反應(yīng)1小時后TLC顯示反應(yīng)完畢，冰浴下向反應(yīng)液中滴加2NHCl溶液調(diào)pH到7，析出大量無色固體。該固體以二氯甲烷/甲醇為洗脫劑用硅膠柱純化，得1.50g(30％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)162[M-H]^-。

實(shí)施例5制備Boc-Trp-Asp(OBzl)-OBzl

稱取4.54g(14.93mmol)Boc-Trp于250mL茄瓶中，加入50mL THF。在冰浴和攪拌下依次加入1.92g(14.93mmol)HOBt及3.52g(17.08mmol)DCC，活化30min。稱取6.8g (14.24mmol)Tos·Asp(OBzl)-OBzl于100mL小三角瓶中，用THF溶解后，于冰浴下用NMM調(diào)pH至7，然后將該溶液滴加至茄形瓶的反應(yīng)液中，最后用NMM調(diào)反應(yīng)液pH值至8。室溫反應(yīng)過夜，TLC顯示反應(yīng)完畢后，反應(yīng)混合物減壓濃縮至于，殘留物加60mL乙酸乙酯溶解，過濾除去二環(huán)己基脲(DCU)，濾液層依次用飽和NaHCO₃溶液(20mL×3)和飽和NaCl溶液(20mL×3)洗，有機(jī)層用無水Na₂SO₄干燥，過濾、濾液減壓濃縮至干，得到的黃色油狀物經(jīng)硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇為洗脫劑)，得到4.7g(51.37％)標(biāo)題化合物，為無色固體。

實(shí)施例6制備Boe-Trp-AA-OBzl(式中AA代表L-Pro，L-Gly，L-Ala，L-Cys(PMB)，L-Phe，L-Ile，L-Leu，L-Met，L-Asn，L-Arg，L-Ser，L-Tyr，L-Val，L-Trp，L-Thr和L-Glu(OBzl)殘基)

按照實(shí)施例5的方法，從912mg(3mmol)Boc-Trp和(3.6mmol)Tos·AA-OBzl得到標(biāo)題化合物，為無色固體。收率為80-90％。

實(shí)施例7制備HCl·Trp-Asp(OBzl)-OBzl

將3g Boc-Trp-Asp(OBzl)-OBzl置于100mL茄瓶中，用15mL干燥乙酸乙酯將其完全溶解，于冰浴下攪拌并加入30mL 4N氯化氫/乙酸乙酯，于冰浴下攪拌1.5h，有無色固體析出。TLC顯示反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液于37℃溫水浴下減壓濃縮。將殘留物用無水乙醚(10mL×3)減壓濃縮，得到1.997g(80％)標(biāo)題化合物，為無色固體。

實(shí)施例8制備HCl·Trp-AA-OBzl(式中AA的定義同上)

按照實(shí)施例7的方法，從1.202g Boc-Trpt-AA-OBzl得到標(biāo)題化合物，為無色固體。收率為95-98％。

實(shí)施例9制備3H-瞇唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Asp(OBzl)-OBzl(5a)

稱取163mg(1mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸于100mL茄瓶中，加入15mL DMF。在冰浴和攪拌下加入380mg(1mmol)HATU，活化30min。稱取531.5mg(1mmol)HCl·Trp-Asp(OBzl)-OBzl于50mL小三角瓶中，用DMF溶解后，然后將該溶液滴加至茄形瓶的反應(yīng)液中，最后用NMM調(diào)反應(yīng)液pH值至8。室溫?cái)嚢柽^夜，TLC顯示反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物加60mL乙酸乙酯溶解，過濾除去不溶物，濾液層依次用飽和NaHCO₃溶液(20mL×3)和飽和NaCl溶液(20mL×3)洗，有機(jī)層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，得到的黃色油狀物經(jīng)硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇為洗脫劑)，得到40mg(9％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：644.94[M+H]⁺；Mp：90～92℃；[α]_D²⁵＝-110.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.15(s，1H)，10.80(s，1H)，8.93(s，1H)，8.89(d，J＝6.0Hz，1H)，8.70(d，J＝9.0Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)， 7.57(d，J＝6.0Hz，1H)，7.56-6.87(m，10H)，7.13(s，1H)，7.02(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.88(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.09(d，J＝12.0Hz，4H)，4.90(m，1H)，4.80(m，1H)，3.11-3.35(m，2H)，2.96(dd，J＝6.0Hz，J＝15.0Hz，1H)，2.80(dd，J＝6.0Hz，J＝15.0Hz，1H)。

實(shí)施例10制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Pro-OBzl(5b)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.026g(2.4mmol)HCl·Trp-Pro-OBzl得到107mg(10％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：537[M+H]⁺；Mp：187～189℃；[α]_D²⁵＝-106.66(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.13(s，1H)，10.84(s，1H)，8.95(s，1H)，8.76(d，J＝6.0Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)，7.57(d，J＝6.0Hz，1H)，7.56-6.87(m，6H)，7.24(s，1H)，7.04(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.94(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.17(s，2H)，5.04(m，1H)，4.46(m，1H)，3.65-3.75(m，1H)，3.2(m，2H)，2.2(m，1H)，1.87(m，3H)。

實(shí)施例11制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Trp-OBzl(5c)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.196g(2.4mmol)HCl·Trp-Trp-OBzl得到37.5mg(3.0％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：625.94[M+H]⁺；Mp：109～111℃；[α]_D²⁵＝-110.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.00(s，2H)，3.30(m，2H)。

實(shí)施例12制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Val-OBzl(5d)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.031g(2.4mmol)HCl·Trp-Val-OBzl得到216mg(20％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：539.94[M+H]⁺；Mp：128～130℃；[α]_D²⁵＝-70.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.15(s，1H)，10.80(s，1H)，8.92(s，1H)，8.73(d，J＝9Hz，1H)，8.58(d，J＝6Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)，7.51(d，J＝6Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.04(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.94(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝9Hz，2H)，4.98(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.31(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.43(m，2H)，2.11(m，1H)，0.89(t，J＝6.0Hz，J＝12.0Hz，6H)。

實(shí)施例13制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ala-OBzl(5e)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和0.963g(2.4mmol)HCl·Trp-Ala-OBzl得到255mg(25％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：510.94 [M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.43(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，2H)，1.35(d，J＝9Hz，3H)。

實(shí)施例14制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Met-OBzl(5f)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.107g(2.4mmol)HCl·Trp-Met-OBzl得到30mg(2.6％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：570.94[M+H]⁺；Mp：123～125℃；[α]_D²⁵＝-101.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.13(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，2H)，8.53(s，1H)，8.18(s，1H)，7.60(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.04(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，6.94(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.13(s，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，2H)，2.47(m，1H)，2(m，5H)。

實(shí)施例15制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ile-OBzl(5g)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Ile-OBzl得到200mg(18％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：552.94[M+H]⁺；Mp：131～133℃；[α]_D²⁵＝-111.00(c＝0.1，甲醇)，¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.98(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.35(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，2H)，1.85(m，1H)，1.40(m，1H)，1.18(m，1H)，0.86(m，6H)。

實(shí)施例16制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Leu-OBzl(5h)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Leu-OBzl得到200mg(18％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：552.94[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)，¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.98(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.35(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.2(m，2H)，1.65(m，3H)，0.9(d，J＝9Hz，3H)，0.85(d，J＝9Hz，3H)。

實(shí)施例17制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Phe-OBzl(5i)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.189g(2.4 mmol)HCl·Trp-Phe-OBzl得到23mg(2.0％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：586.94[M+H]⁺；Mp：141～143℃；[α]_D²⁵＝-70.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，11H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝9Hz，4H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.78(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.26(m，4H)。

實(shí)施例18制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Gly-OBzl(5j)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和930g(2.4mmol)HCl·Trp-Gly-OBzl得到159mg(16％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：496.94[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D²⁵＝-98.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.00(s，2H)，3.30(m，2H)。

實(shí)施例19制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Tyr-OBzl(5k)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.184g(2.4mmol)HCl·Trp-Tyr-OBzl得到60mg(2.6％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：602.94[M+H]⁺；Mp：100～101℃；[α]_D²⁵＝-120.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.80(s，1H)，9.2(s，1H)，8.94(s，1H)，8.78(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，11H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝15Hz，J＝15Hz，4H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.78(q，J＝9Hz，J＝6Hz，2H)，3.20(m，2H)，2.95(m，2H)。

實(shí)施例20制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Ser-OBzl(5l)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.002g(2.4mmol)HCl·Trp-Ser-OBzl得到42mg(4.0％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：526.94[M+H]⁺；Mp：118～120℃；[α]_D²⁵＝-101.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.75(m，2H)，3.49(m，2H)，3.22(m，2H)。

實(shí)施例21制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Cys(PMB)-OBzl(5m)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.808g(2.4 mmol)HCl·Trp-Cys(PMB)-OBzl得到265mg(2.6％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：662.94[M+H]⁺；Mp：98～100℃；[α]_D²⁵＝-110.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，3H)，7.06(m，3H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.75(s，2H)，3.21(m，2H)，2.8(m，1H)，2.68(m，1H)，2.21(m，3H)。

實(shí)施例22制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-R(NO₂)-OBzl(5n)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.275g(2.4mmol)HCl·Trp-R(NO₂)-OBzl得到256mg(20％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：640.94[M+H]⁺；Mp：122～124℃；[α]_D²⁵＝-125.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.25(m，4H)，1.85(m，1H)，1.65(m，1H)，1.52(m，2H)。

實(shí)施例23制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Asn-OBzl(5o)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.064g(2.4mmol)HCl·Trp-Asn-OBzl得到200mg(18％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：553.94[M+H]⁺；Mp：111～113℃；[α]_D²⁵＝-114.00(c＝0.1，甲醇)，1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.43(s，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.96(s，1H)，6.95(m，1H)，5.13(q，J＝9Hz，J＝15Hz，2H)，4.90(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.50(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.25(m，2H)，2.6(m，2H)。

實(shí)施例24制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Glu(OBzl)-OBzl(5p)

按照實(shí)施例9，從1250mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.432g(2.4mmol)HCl·Trp-Glu(OBzl)-OBzl得到66mg(5％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：658[M+H]⁺；Mp：157～159℃；[α]_D²⁵＝-116.66(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.15(s，1H)，10.80(s，1H)，8.93(s，1H)，8.89(d，J＝6.0Hz，1H)，8.70(d，J＝9.0Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.20(s，1H)，7.57(d，J＝6.0Hz，1H)，7.56-6.87(m，10H)，7.13(s，1H)，7.02(t，J＝9.0Hz，J＝18.OHz，1H)，6.88(t，J＝9.0Hz，J＝18.0Hz，1H)，5.09(d，J＝12.0Hz，4H)，4.90(m，1H)，4.80(m，1H)，3.11-3.35(m，2H)，2.49(m，2H)，2.08(m，1H)，1.94(m，1H)。

實(shí)施例25制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-Thr-OBzl(5q)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和1.026g(2.4mmol)HCl·Trp-Thr-OBzl得到28mg(3％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：540.94[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.78(s，1H)，8.94(s，1H)，8.89(d，J＝9Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(s，2H)，5.02(m，2H)，4.49(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，4.22(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.25(m，2H)，1.10(d，J＝9Hz，2H)。

實(shí)施例26制備3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Trp-OBzl(6)

按照實(shí)施例9，從326mg(2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸和793.2g(2.4mmol)HCl·Trp-OBzl得到263mg(30％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/z)：440.04[M+H]⁺；Mp：68～71℃；[α]_D²⁵＝-11.00(c＝0.1，甲醇)；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.12(s，1H)，10.88(s，1H)，8.94(s，1H)，8.86(d，J＝9Hz，1H)，8.55(s，1H)，8.24(s，1H)，7.51(d，J＝9Hz，1H)，7.31(m，6H)，7.13(d，J＝3Hz，1H)，7.06(m，1H)，6.95(m，1H)，5.13(s，2H)，4.95(dd，J＝9Hz，J＝15Hz，1H)，3.45(m，2H)。

實(shí)驗(yàn)例1測定化合物的細(xì)胞毒作用

1)本發(fā)明的化合物用含0.1％DMSO的培養(yǎng)基配制成所需濃度。

2)實(shí)驗(yàn)用的腫瘤細(xì)胞為MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)，HL60(人早幼粒白血病細(xì)胞)，K562(人白血病慢性粒細(xì)胞)，A549(人肺癌細(xì)胞系)，HaCa-T(人表皮永生化細(xì)胞)，L02(人正常肝細(xì)胞)。

3)實(shí)驗(yàn)方法

MCF-7，HL-60，K562和S180細(xì)胞選用RPMI-1640培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中含10％經(jīng)滅活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L鏈霉素。

貼壁細(xì)胞MCF-7、HaCa-T、L02和半貼壁細(xì)胞S180的培養(yǎng)：分別將生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以3×10⁴個/mL的密度接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)4小時，然后按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入經(jīng)滅菌處理的化合物5a，5b與含0.1％DMSO的培養(yǎng)基配制成的溶液，每孔25μL，對照組加入等體積的溶解樣品的溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，每孔加25μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)4小時。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振蕩約10min溶解紫色殘留物(甲瓚)，立即于酶標(biāo)儀上檢測O.D.(吸光度)值，波長為570nm。

懸浮細(xì)胞HL60和K562的培養(yǎng)：分別將生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×10⁴個/mL的密度接種于96孔板，每孔100μL，然后按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入經(jīng)滅菌處理的化合物5a，5b 與含0.1％DMSO的培養(yǎng)基配制成的溶液，每孔25μL，對照組加入等體積的溶解樣品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)48小時后，每孔加入25μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)置于條件為37℃和5％CO₂的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)4小時。2500rpm離心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMSO，振蕩約10min溶解紫色殘留物(甲瓚)，立即于酶標(biāo)儀上檢測O.D.(吸光度)值，波長為570nm。

按下式求出各個濃度下化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性：

細(xì)胞增殖(％)＝(化合物組平均O.D.值/對照組平均O.D.值)×100％，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以細(xì)胞增殖對藥物濃度作圖，按作圖法求出IC₅₀(半數(shù)有效抑制濃度)值。

4)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，化合物抑制六種腫瘤細(xì)胞不顯示細(xì)胞毒作用。

表1化合物的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性(IC₅₀，μM)

實(shí)驗(yàn)例2評價化合物抑制腫瘤生長的活性

1)本發(fā)明的化合物用含吐溫80的生理鹽水溶解，阿霉素用生理鹽水溶解作為陽性對照，

含吐溫80的生理鹽水作為陰性對照；

2)化合物，含吐溫80的生理鹽水和阿霉素均為腹腔給藥，化合物的給藥劑量為100nmol/kg，含吐溫80的生理鹽水的給藥劑量為0.2mL/20g，阿霉素給藥劑量為2μmol/kg，連續(xù)給藥10天，共給藥10次。

3)實(shí)驗(yàn)動物為ICR雄性小鼠(清潔級)，體重20±2g，每組12只小鼠。

4)瘤源為小鼠S180肉瘤，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心，自行傳代維持。

5)動物模型與治療

無菌條件下抽取接種生長旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理鹽水稀釋成(1∶2)的液體充分 混合，將腫瘤細(xì)胞懸液用新鮮配制的0.2％臺盼藍(lán)染色，混勻后按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)，染藍(lán)色者為死細(xì)胞，不染色者為活細(xì)胞，并按如下公式計(jì)算細(xì)胞濃度和細(xì)胞存活率。

細(xì)胞濃度＝4大方格內(nèi)活細(xì)胞數(shù)/4×10⁴×稀釋倍數(shù)＝細(xì)胞數(shù)/mL

細(xì)胞存活率＝活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100％

將存活率大于90％的瘤液用勻漿法制備成2.0×10⁷個/mL的細(xì)胞懸液，于鼠腋皮下接種，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。腫瘤接種24h后，治療組小鼠每日腹腔注射化合物5a，5b，劑量為100nmol/kg和20nmol/kg?？瞻捉M小鼠每日腹腔注射0.2mL含吐溫80的生理鹽水。陽性對照組小鼠每日腹腔注射阿霉素，劑量為2μmol/kg。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第10天，稱小鼠體重，乙醚麻醉，脫頸椎處死小鼠，然后用鑷子固定小鼠右腋腫瘤生長部位，剪開皮膚，暴露腫瘤，鈍性剝離，稱重，按如下公式計(jì)算抑瘤率：抑瘤率％＝(陰性對照組平均瘤重-化合物組平均瘤重)/陰性對照組平均瘤重×100％。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)和方差分析，瘤重以表示。結(jié)果見表2。由表2可以看出，在100nmol/kg的劑量下，化合物5a-n治療的腫瘤小鼠的瘤重明顯小于含吐溫80的生理鹽水治療小鼠的瘤重，說明化合物5a-n的有效劑量低達(dá)100nmol/kg。這個有效劑量比發(fā)明人曾經(jīng)公開的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表色氨基酸或其它L-氨基酸殘基除脯氨酸)的有效劑量1μmol/kg低10倍。體現(xiàn)了明確的技術(shù)優(yōu)勢。

表2化合物對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

n＝10；生理鹽水是含吐溫80的生理鹽水；a)與生理鹽水組比p＜0.05，b)與生理鹽水組比p＜0.01.

由表3可以看出，在20nmol/kg和1nmol/kg的劑量下，化合物5a-c，e治療的腫瘤小鼠的瘤重明顯小于含吐溫80的生理鹽水治療小鼠的瘤重，說明化合物5a-c，e的有效劑量低達(dá)1nmol/kg。這個有效劑量比發(fā)明人曾經(jīng)公開的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表色氨基酸或其它L-氨基酸殘基)的有效劑量1μmol/kg低1000倍。

表3不同劑量5a-c，e對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

N≥10；生理鹽水是含吐溫80的生理鹽水；a)與生理鹽水組比p＜0.05，b)與生理鹽水組比p＜0.01.

實(shí)驗(yàn)例3評價化合物的抗炎活性

1)實(shí)驗(yàn)方法

18-22g ICR雄性小鼠隨機(jī)分為空白對照組，阿司匹林陽性藥組，化合物5a-c給藥組，小鼠使用前靜息1天，操作間保持室內(nèi)溫度22℃，每組小鼠10只。一次性給藥30分鐘后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL)，2小時后將小鼠用乙醚麻醉之后頸椎脫臼處死。將小鼠的左，右耳剪下，用直徑7mm的打孔器在兩耳的相同位置，取圓形耳片，分別稱重，求出兩圓耳片的重量差作為腫脹度。腫脹度＝左耳圓片重量-右耳圓片重量。

2)給藥方法和劑量

給藥方式為灌胃給藥?？瞻讓φ眨汉聹?0的生理鹽水，給藥劑量為0.2mL/20g；陽性對照：阿司匹林，給藥劑量為1.11mmol/kg；化合物的給藥劑量為100nmol/kg.

3)統(tǒng)計(jì)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用t檢驗(yàn)和方差分析，腫脹度以表示。

4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果列入表4。

結(jié)果表明，化合物5a-c在100nmol/kg劑量下化合物治療小鼠的耳腫脹度明顯低于含吐溫80的生理鹽水治療小鼠的耳腫脹度。說明化合物在發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤作用的劑量下，還具有抗炎作用。

表4化合物5a-c的體內(nèi)抗炎活性評價

n＝10；生理鹽水為含吐溫80的生理鹽水；a)與含吐溫80的生理鹽水組比p＜0.01，b)與含吐溫80的生理鹽水組比p＜0.05。