本發(fā)明涉及一種RGD三肽的制備方法。
背景技術(shù)：
RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-ASP)序列的短肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，是整合素(Integrin)與其配體蛋白相互作用的識(shí)別位點(diǎn)。自Pierschbacher等于1984年首次報(bào)道纖維蛋白原中所含的RGD序列為細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)以來(lái)，RGD肽及其衍生物就成為眾多學(xué)者關(guān)注與研究的熱點(diǎn)。人體中最常見(jiàn)的含RGD序列的基質(zhì)蛋白主要有纖維黏連蛋白，層黏蛋白、玻璃黏連蛋白、膠原、凝血栓蛋白等(Temming K,Schiffelers R.M,Molema G,et al.Kok RJ.RGD-based strategies for selective delivery of therapeutics and imaging agents to the tumor vasculature[J].Drug Resist Updat,2005,8(6):381-402)。
細(xì)胞黏附在細(xì)胞黏附性疾病(癌轉(zhuǎn)移、血栓形成、化學(xué)致炎和骨質(zhì)疏松)的發(fā)展過(guò)程中期關(guān)鍵作用。調(diào)節(jié)性糖蛋白例如RGD肽與整合素受體有很強(qiáng)的結(jié)合能力，可參與細(xì)胞黏附過(guò)程。例如RGD肽與血小板、腫瘤細(xì)胞及骨基表面的GP IIb/IIIa受體特異性結(jié)合可干預(yù)血栓、癌轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松的發(fā)展過(guò)程。RGD肽的這種作用賦予了含RGD序列的化合物一種重要性質(zhì)，即含RGD序列的化合物可以向血栓、癌轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松的患病部位富集。正是由于RGD具有廣泛的應(yīng)用前景，所以已經(jīng)成為極具研究?jī)r(jià)值的生物活性肽之一，而高效、快捷的合成RGD為其深入研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
目前RGD的合成方法主要有酶催化合成法和化學(xué)合成法。酶催化合成法中溶劑體系、含水量、溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間及底物摩爾比等均會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響，因此該方法反應(yīng)條件要求比較嚴(yán)格，不易控制。化學(xué)合成法可以分為固相法和液相法。到目前為止，各種各樣固相合成技術(shù)使得人們可以合成各種肽及衍生物，但由于其所用試劑和設(shè)備費(fèi)用較高，固相合成反在很大程度上被局限于10克之內(nèi)的規(guī)模(黃惟德，陳常慶，《多肽合成》，科學(xué)出版社，第一版，1985)。而液相合成法則適于大規(guī)模合成相對(duì)較短的肽以及實(shí)現(xiàn)肽片段的縮合，但通過(guò)目前的液相合成方法得到的RGD三肽純度較低，約為80％左右，并含有殘留溶劑(如冰醋酸等)。本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)RGD三肽的合成工藝研究，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，快速、高效的合成高純度RGD三肽。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
具體路線如下：
(1)以甘氨酸為起始原料，在堿的作用下，經(jīng)叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)，得到Boc-甘氨酸(中間體1)。
(2)Boc-甘氨酸與天冬氨酸雙芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽(原料2)在縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/4-二甲氨基吡啶(DMAP)以及有機(jī)堿的作用下縮合，得到Boc-甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體3)。
(3)Boc-甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體3)在三氟醋酸(TFA)作用下脫去Boc，得到甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體4)。
(4)甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽與N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)在縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺DCC/4-二甲氨基吡啶DMAP以及有機(jī)堿的作用下縮合得到精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體6)。
(5)精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體6)在TFA作用下脫掉Boc得到精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體10)。
(6)精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽常溫、常壓下經(jīng)催化氫化脫掉所有保護(hù)基得到精氨酰甘氨酰天冬氨酸三肽(RGD)。
步驟1反應(yīng)溫度為-5～40℃，優(yōu)選0～30℃；反應(yīng)時(shí)間為12～48小時(shí)，優(yōu)選24小時(shí)；所用溶劑為水、有機(jī)溶劑或其組合，有機(jī)溶劑可選用四氫呋喃、二氧六環(huán)等，優(yōu)選水。
步驟1中的堿可列舉氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鋰、三乙胺、二乙基異丙胺、N-甲基嗎啡啉等，優(yōu)選氫氧化鈉和氫氧化鉀；甘氨酸與Boc2O摩爾比為1:1～2，優(yōu)選1:1.5。
步驟2反應(yīng)溫度為0～30℃，反應(yīng)時(shí)間為4～12小時(shí)，優(yōu)選6～8小時(shí)；溶劑可列舉二氯甲烷、氯仿等；有機(jī)堿可列舉N-甲基嗎啡啉(NMM)、三乙胺、二異丙基乙胺等，天冬氨酸雙芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽：Boc-甘氨酸：DCC:DMAP:有機(jī)堿摩爾比為1:1～3:1～2:0.5～1.5:1～3，優(yōu)選1:1.2～2.5:1～1.5:0.5～1:1.5～2。該條件下，可以接近定量的收率得到Boc-甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體3)，且產(chǎn)物純度≥99％。
步驟3反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為0.5～4小時(shí)，溶劑優(yōu)選二氯甲烷，二氯甲烷：三氟醋酸體積比為1:0.3～1.5，優(yōu)選1:1。通過(guò)該方法可以快速、完全的脫除Boc保護(hù)基，反應(yīng)收率可以達(dá)到100％。
步驟4反應(yīng)溫度為0～30℃，反應(yīng)時(shí)間為6～24小時(shí)，優(yōu)選10～14小時(shí)；溶劑可列舉二氯甲烷、氯仿等；有機(jī)堿可列舉N-甲基嗎啡啉、三乙胺、二異丙基乙胺等；N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸:甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽:DCC:DMAP:NMM摩爾比為1:1～3:1～2:0.5～1.5:1～3，優(yōu)選1:1.2～2.5:1～1.5:0.5～1:1.5～2。
步驟5反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為2～4小時(shí)，溶劑優(yōu)選二氯甲烷，二氯甲烷：三氟醋酸體積比為1:0.3～1.5，優(yōu)選1:1。
步驟6反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為6～24小時(shí)，Pd/C用量為精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體10)質(zhì)量的5～30％，優(yōu)選10％；溶劑可列舉水、甲醇、乙醇、四氫呋喃、冰醋酸、甲酸、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺等，優(yōu)選水、甲醇、乙醇和四氫呋喃。反應(yīng)收率可達(dá)90％以上，純度≥99％。
步驟2和步驟4中的縮合劑也可以選擇1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽EDCI/1-羥基苯并三唑HOBt。
步驟3和步驟5也可以用飽和鹽酸四氫呋喃溶液、飽和鹽酸二氧六環(huán)溶液或飽和鹽酸乙酸乙酯溶液脫除Boc。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些記載的任何限定
實(shí)施例1 Boc-甘氨酸(中間體1)的制備
取甘氨酸(100g,1.3mol)溶于2000mL水，冰浴下加入NaOH(80g,2mol)，攪拌下加入Boc2O(350g,1.6mol)，自然升至室溫反應(yīng)24小時(shí)，結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)液用乙醚萃取2次，水層用1M鹽酸酸化至pH3～4，乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯，殘留物用乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶得白色固體215.2g，收率92％。
實(shí)施例2 Boc-甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體3)的制備
取Boc-甘氨酸(42g,240mmol)溶于二氯甲烷(600mL)，冰浴下依次加入DCC(49.5g,240mmol)DMAP(24.4g,200mmol)，NMM(33ml,300mmol)，天冬氨酸雙芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽(原料2)(97g,200mmol)，室溫5小時(shí)反應(yīng)完全，蒸干溶劑，殘留物用乙酸乙酯溶劑，分別用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化，得油狀物93.2g，收率99％，純度99.9％。
實(shí)施例3甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體4)的制備
取Boc-甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體3)(47g,100mmol)溶于二氯甲烷(100mL)，攪拌下滴加三氟醋酸(TFA)(100mL)，室溫反應(yīng)1小時(shí)，結(jié)束反應(yīng)，蒸干溶劑，乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶，得白色固體45.1g，收率96％。
實(shí)施例4精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體6)的制備
取N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)(38g,120mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，冰浴下依次加入DCC(24.8g,120mmol)，DMAP(14.7g,120mmol)，NMM(20mL,180mmol)，甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體4)(67.5g,140mmol)，室溫反應(yīng)12小時(shí)，蒸干溶劑，殘留物用乙酸乙酯溶劑，分別用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化，得淺黃色固體75.4g，收率93％。
實(shí)施例5精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體10)的制備
精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體6)(75g,110mmol)溶于二氯甲烷(150mL)，攪拌下滴加三氟醋酸(150mL)，室溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸干溶劑，乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶，得白色固體70g，收率95％。
實(shí)施例6精氨酰甘氨酰天冬氨酸三肽(RGD)的制備
取精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體10)(20g,30mmol)溶于甲醇(100mL)，加入 Pd/C(2g)，濃鹽酸HCl(0.5mL)，H2置換氣，室溫下通氫氣反應(yīng)20小時(shí)，結(jié)束反應(yīng)，濾除Pd/C，蒸干溶劑，水/甲醇重結(jié)晶的白色固體9.8g，收率94％，純度99.8％。
實(shí)施例7 Boc-甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體3)的制備
取Boc-甘氨酸(17.5g,100mmol)溶于二氯甲烷(250mL)，冰浴下依次加入EDCI(23g,120mmol)HOBt(20.3g,150mmol)，NMM(38.7ml,350mmol)，天冬氨酸雙芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽(原料2)(43.7g,90mmol)，室溫8小時(shí)反應(yīng)完全，蒸干溶劑，殘留物用乙酸乙酯溶劑，分別用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化，得油狀物41.1g，收率97％，純度99.4％。
實(shí)施例8精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體6)的制備
取N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)(38g,120mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，冰浴下依次加入EDCI(27.6g,144mmol)HOBt(24.3g,180mmol)，NMM(39.8mL,360mmol)，甘氨酰天冬氨酸雙芐酯三氟醋酸鹽(中間體4)(67.5g,140mmol)，室溫反應(yīng)12小時(shí)，蒸干溶劑，殘留物用乙酸乙酯溶劑，分別用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化，得淺黃色固體72.5g，收率90％。
實(shí)施例9甘氨酰天冬氨酸雙芐酯鹽酸鹽(中間體11)的制備
取Boc-甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體3)(47g,100mmol)溶于飽和鹽酸乙酸乙酯溶液(200mL)，室溫反應(yīng)2小時(shí)，結(jié)束反應(yīng)，蒸干溶劑，乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶，得白色固體37.4g，收率92％。
實(shí)施例10精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯鹽酸鹽(中間體12)的制備
精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體6)(68g,100mmol)溶于飽和鹽酸乙酸乙酯溶液(300mL)，30℃反應(yīng)2.5小時(shí)，蒸干溶劑，乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶，得白色固體53.6g，收率88％。
實(shí)施例12精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯(中間體6)的制備
取N-Boc-N'-NO2-L-精氨酸(原料5)(31.7g,100mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，冰浴下依次加入DCC(20.7g,100mmol)，DMAP(12.3g,100mmol)，NMM(16.7mL,150mmol)，甘氨酰天冬氨酸雙芐酯鹽酸鹽(中間體11)(44.8g,110mmol)，室溫反應(yīng)10小時(shí)，蒸干溶劑，殘留物用乙酸乙酯溶劑，分別用水、5％HCl溶液、5％NaHCO3溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化，得淺黃色固體57.8g，收率86％。
實(shí)施例12精氨酰甘氨酰天冬氨酸三肽(RGD)的制備
取精氨酰甘氨酰天冬氨酸雙芐酯鹽酸鹽(中間體12)(18.2g,30mmol)溶于甲醇(100mL)，加入Pd/C(2g)，濃鹽酸HCl(0.5mL)，H2置換氣，室溫下通氫氣反應(yīng)20小時(shí)，結(jié)束反應(yīng)，濾除Pd/C，蒸干溶劑，水/甲醇重結(jié)晶的白色固體9.5g，收率91％，純度99.6％。