本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測定二肽基肽酶IV的特異性熒光探針底物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV,EC 3.4.14.5)是以二聚體形式存在的跨膜絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于哺乳動物的腎、肝、胃腸、胰腺上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，也能以溶解形式存在于血漿和腦脊液中。DPP-IV能特異性地催化多肽鏈N末端第2位的氨基酸殘基脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)肽鍵水解斷裂，即水解掉兩個氨基酸殘基Xa-Pro和Xa-Ala(Xa為除脯氨酸外的任何氨基酸)，從而參與體內(nèi)多種生物活性多肽的激活，以及使體內(nèi)多種活性多肽部分或完全失活，如腸促胰島素(incretin)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y)、胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)、生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)等。

基于腸促胰島素的新型DPP-IV抑制劑可以提高體內(nèi)胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)的濃度、延長其作用時(shí)間，改善α-及β-細(xì)胞功能障礙，同時(shí)還具有增加胰島素敏感性的作用，并且具有低血糖發(fā)生率低，不影響胃排空等特點(diǎn)。因此，DPP-IV已經(jīng)成為了治療2型糖尿病新的靶點(diǎn)。有研究推測DPP-IV抑制劑可能是通過抑制泡沫細(xì)胞生成進(jìn)而可以抑制動脈粥樣硬化發(fā)展，也可通過抑制基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF1-1α)和基質(zhì)P的退化來保證胰島素濃度提供潛在的心臟保護(hù)功能(Diabetologia,2012,55,2267-2275)。除此之外，DPP-IV在黑色素瘤、肺癌、前列腺癌中低表達(dá)，在口腔癌和直腸癌 血清中低表達(dá)，隨著子宮內(nèi)膜惡性腺瘤的惡化DPP-IV的表達(dá)量逐漸降低；然而，研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、食道惡性腺瘤中卻呈現(xiàn)出相反的結(jié)果(Biotecnología Aplicada 2014,31,102-110)。因此，開發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)的DPP-IV探針底物，不僅可以更好地探究DPP-IV在相關(guān)疾病中的所發(fā)揮的重要作用，還可以為DPP-IV靶向藥物的篩選及定量測定生物體系內(nèi)DPP-IV的活性提供有力的技術(shù)支撐。

目前，測量DPP-IV活性的方法主要包括對硝基苯胺衍生物底物顯色法和4-甲基-7-氨基香豆素衍生物熒光探針法。已知的熒光底物均屬于off-on型探針，單酶選擇性并不高且易受生物基質(zhì)的干擾，定量誤差較大，應(yīng)用時(shí)(如DPP-IV抑制劑的篩選)容易得到假陽性或假陰性的結(jié)果。而比率型探針發(fā)射光譜的藍(lán)移/紅移則可用于比率檢測，通過熒光比率法進(jìn)行酶活檢測，由于基于酶底物和產(chǎn)物兩個不同波長處的熒光強(qiáng)度，以其比值作為信號參量，此時(shí)探針分子原型可作為內(nèi)部校準(zhǔn)來減小光照強(qiáng)度、探針濃度、樣品不均勻、儀器參數(shù)等對定量分析的影響，與傳統(tǒng)的熒光探針相比，此種比率型熒光探針具有更好的選擇性、靈敏度和動態(tài)響應(yīng)范圍。因此，開發(fā)高選擇性的DPP-IV比率型熒光探針反應(yīng)及其配套的高通量檢測方法具有重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種測定二肽基肽酶IV(DPP-IV)的特異性熒光探針底物及其應(yīng)用，該比率型熒光探針底物和去二肽基化產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長具有明顯差異，且產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率更高更易檢測。利用該探針反應(yīng)可對多種生物體系中DPP-IV的分布和功能進(jìn)行定量評價(jià)。

本發(fā)明提供了一種二肽基肽酶IV(DPP-IV)的特異性熒光探針底物，該探 針底物可被DPP-IV特異性催化生成具有不同熒光屬性的產(chǎn)物并生成相應(yīng)的4-氨基萘酰亞胺，該底物結(jié)構(gòu)式如下：

其中，R選自C₂-C₁₀烷基、-(C₁-C₈亞烷基)-羧基、-(C₁-C₈亞烷基)-酯基、-(C₁-C₈亞烷基)-氨基、-(C₁-C₈亞烷基)-氰基、-(C₁-C₈亞烷基)-硝基、-(C₁-C₃亞烷基)-O-(C₁-C₃烷基)、碳環(huán)基、-(C₁-C₃亞烷基)-碳環(huán)基、芳基、-(C₁-C₃亞烷基)-芳基、雜芳基、-(C₁-C₃亞烷基)-雜芳基、雜環(huán)基或-(C₁-C₃亞烷基)-雜環(huán)基。

本發(fā)明還提供一種測定二肽基肽酶IV(DPP-IV)的特異性熒光探針底物的應(yīng)用，采用該二肽基肽酶IV(DPP-IV)特異性底物，與含二肽基肽酶IV(DPP-IV)的生物樣品混合后進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過定量檢測單位時(shí)間內(nèi)的底物消除率或其去二肽基化產(chǎn)物的生成率來定量測定不同生物體系中DPP-IV的活性，具體測定方法及條件如下：

A.體系中以GPAN作為比率型探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；

B.在PBS緩沖液中，反應(yīng)溫度為20～60℃之間；孵育體系pH介于5.5～10.5之間；

C.反應(yīng)時(shí)間為5～120分鐘，確保以上底物相應(yīng)的N-去二肽基化產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物轉(zhuǎn)化率不超過20％時(shí)終止反應(yīng)；

D.測定單位時(shí)間內(nèi)底物減少量或N-去二肽基化產(chǎn)物生成量作為DPP-IV活性的評價(jià)指標(biāo)。

具體測定方法及條件中，單點(diǎn)測定時(shí)底物濃度優(yōu)選K_m。

具體測定方法及條件中，反應(yīng)溫度優(yōu)選37℃，孵育體系pH優(yōu)選pH7.4。

所述的生物體系為重組表達(dá)DPP-IV單酶、人或動物組織制備液或各類哺乳動物組織細(xì)胞及其制備物中的任意一種。

該探針底物及其去二肽基化產(chǎn)物的熒光信號需采用不同檢測波長去檢測，去二肽基化產(chǎn)物及底物的熒光檢測條件分別為：激發(fā)波長430，360nm，最大發(fā)射波長分別為535，455nm。

該探針底物還可用于DPP-IV抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價(jià)。

該探針底物也可作為實(shí)驗(yàn)動物在體及整體DPP-IV的探針底物，評估代謝酶DPP-IV的個體及種屬差異。

本發(fā)明提供的DPP-IV的比率型熒光探針反應(yīng)的應(yīng)用，該探針底物及其N-去二肽基化產(chǎn)物均具有熒光屬性，且兩者具有不同的光學(xué)屬性，可采用熒光檢測器同時(shí)實(shí)現(xiàn)底物及產(chǎn)物的快速、靈敏檢測；N-去二肽基化產(chǎn)物及底物熒光檢測條件分別為：激發(fā)波長430，360nm，最大發(fā)射波長分別為535，455nm。

該特異性探針底物為比率型熒光探針，其在DPP-IV活性檢測過程不易受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各種重組DPP-IV、人及動物組織制備液及各類組織細(xì)胞中DPP-IV酶活的定量測定；同時(shí)也可作為在體及動物整體DPP-IV的探針底物，評估代謝酶DPP-IV的個體及種屬差異。該探針底物及N-去二肽基化代謝產(chǎn)物的熒光檢測方法還可用于DPP-IV抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價(jià)。

作為高特異性的DPP-IV單酶的熒光探針底物，該化合物可以用來檢測DPP-IV的活性，尤其適合用于對細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞以及酵母菌克隆表達(dá)體系生產(chǎn)的DPP-IV的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、S-9等制備物中DPP-IV的活性標(biāo)定。

選用本發(fā)明所述DPP-IV單酶的比率型熒光探針反應(yīng)檢測DPP-IV單酶體外 活性具有以下突出優(yōu)勢：

(1)高特異性：GPAN可被DPP-IV高特異性地代謝成一個代謝產(chǎn)物，即N-去二肽化產(chǎn)物。

(2)廉價(jià)易得：GPAN可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡單易行。

(3)易高通量檢測：可在實(shí)驗(yàn)室常見各類熒光酶標(biāo)儀及臨床大生化儀上測定，可利用96或386微孔板進(jìn)行批量檢測。

(4)高靈敏度：具有1,8-萘酰亞胺母核結(jié)構(gòu)的化合物均具有良好的熒光發(fā)射光譜特性(450～700nm)，且該底物及其N-去二肽化代謝產(chǎn)物具有不同的熒光發(fā)射光譜特征，能較好的進(jìn)行區(qū)分檢測，同時(shí)可通過比率型標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立進(jìn)行DPP-IV的定量測定，檢測下限為10ng/mL。

附圖說明

圖1. 4-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-1,8-萘酰亞胺類化合物的結(jié)構(gòu)通式；

圖2.N-丁基-4-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-1,8-萘酰亞胺(GPAN)的合成路線；

圖3.N-丁基-4-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-1,8-萘酰亞胺(GPAN)的¹H-NMR譜圖；

圖4.N-丁基-4-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-1,8-萘酰亞胺(GPAN)的選擇性；

圖5.DPP-IV催化GPAN水解的線性反應(yīng)時(shí)間；

圖6.DPP-IV的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7.DPP-IV催化GPAN水解的酶促動力學(xué)；

圖8.人組織微粒體中DPP-IV的活性定量評估；

圖9.DPP-IV抑制劑篩選；

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

本發(fā)明所采用的設(shè)備及其型號為：熒光發(fā)射/激發(fā)光譜是由SynergyH1全功能微孔板檢測儀檢測完成；¹H-NMR譜圖是由核磁共振波譜儀(Avance II 400MHz)檢測完成。

4-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-1,8-萘酰亞胺類化合物的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。

實(shí)施例1

N-丁基-4-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-1,8-萘酰亞胺(GPAN)的合成

N-丁基-4-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-1,8-萘酰亞胺(GPAN)的合成路線如圖2所示。(1)化合物1的合成

室溫，將正丁胺(1.10g,15mmol)加入4-硝基-1,8-萘酐(2.43g,10mmol)的乙酸(50mL)溶液中，100-110℃反應(yīng)過夜后，趁熱過濾，用乙酸洗滌濾餅，真空干燥得化合物1，米黃色固體，產(chǎn)率45-55％。

(2)化合物2的合成

室溫，依次將N-丁基-4-硝基-1,8-萘酰亞胺(1.49g,5mmol)、二水二氯化錫(6.77g,30mmol)加入乙醇(50mL)溶液中，攪拌均勻后慢慢滴加濃鹽酸(10mL)，加完室溫反應(yīng)30min。10％碳酸鈉溶液淬滅反應(yīng)(40mL)，過濾，用水洗滌濾餅，真空干燥得化合物2，橘黃色固體，產(chǎn)率70-80％,ESI-MS m/z 269.1[M+H]⁺。

(3)化合物3的合成

室溫，將N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亞胺(100mg,0.37mmol)、Boc-Gly-Pro-OH(304.5mg,1.12mmol)、N-羥基苯并三氮唑(151.3mg,1.12mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(214.7mg,1.12mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(281.4mg,1.12mmol)依次加入到N,N-二甲 基甲酰胺(5mL)溶液中反應(yīng)，薄板層析(TLC)監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)36h后，反應(yīng)體系冷卻到0-5℃，加水(25mL)，乙酸乙酯萃取三次(30mL×3)，合并有機(jī)相水洗三次(15mL×3)，5％碳酸氫鈉溶液洗(20mL×1)，水洗(15mL×1)、飽和氯化鈉溶液洗(20mL×1)，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(二氯甲烷/甲醇＝8/1)得化合物3，黃色油狀物，產(chǎn)率65-75％,ESI-MS m/z 521.1[M-H]^-。

(4)化合物4的合成

室溫，將化合物1(128mg,0.23mmol)加入到二氯甲烷(8mL)與三氟乙酸(2mL)混合溶液中反應(yīng)，薄板層析(TLC)監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)6h后，蒸除反應(yīng)溶劑，粗產(chǎn)物加入水中(15mL)，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH＝7-8，二氯甲烷萃取三次(25mL×3)，合并有機(jī)相水洗(15mL×1)，飽和氯化鈉溶液洗(20mL×1)，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析(二氯甲烷/甲醇/水＝20/5/0.5)得化合物4，其¹H-NMR譜圖如圖3所示，該產(chǎn)物為淡黃色固體，產(chǎn)率55-65％。

制備的產(chǎn)物的核磁共振波譜具體如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.74(s,1H),8.71(d,J＝8.5Hz,1H),8.54(d,J＝7.1Hz,1H),8.50(d,J＝8.1Hz,1H),8.21(brs,2H),8.17(d,J＝8.1Hz,2H),7.91(t,J＝7.9Hz,1H),4.99-4.71(m,1H),4.05(t,J＝7.3Hz,2H),3.90(s,2H),3.70-3.57(m,2H),2.36-2.36(m,1H),2.17-1.87(m,3H),1.70-1.53(m,2H),1.42-1.28(m,2H),0.93(t,J＝7.3Hz,3H)；ESI-MS m/z 423.1[M+H]⁺.

實(shí)施例2.

體外測定人重組DPP-IV單酶的選擇性

(1)預(yù)先準(zhǔn)備198μL DPP-IV代謝反應(yīng)體系，包括pH 7.4的PBS緩沖液(50 mM)、重組人DPP-IV單酶(1μg/mL)，碳酸酐酶(CA，10μg/mL)，胰蛋白酶(trypsin，10μg/mL)，胃蛋白酶(pepsin，10μg/mL)，丁酰膽堿酯酶(BChE，10μg/mL)，乙酰膽堿酯酶(AChE，10μg/mL)，羧酸酯酶(hCE1，hCE2，10μg/mL)，牛血清白蛋白(BSA，10μg/mL)，人血清白蛋白(HAS，10μg/mL)于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入2μL濃度為10mM的GPAN起始反應(yīng)；

(3)30分鐘后，加入200μL冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；

(4)用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測(Ex＝400nm，Em＝535nm)；重組人DPP-IV酶的選擇性最高約是其它單酶的50倍左右(圖4)。

實(shí)施例3.

DPP-IV時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，GPAN 100μM，DPP-IV單酶0.1μg，pH 7.4的PBS緩沖液50mM，總體積為200μL，37℃下孵育30min，每隔5分鐘酶標(biāo)儀分析，產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度比底物的熒光強(qiáng)度的比值與孵育時(shí)間做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²＞0.99，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬廣，可準(zhǔn)確定量DPP-IV的含量(圖5)。

實(shí)施例4.

體外測定DPP-IV的檢測下限測定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，GPAN 100μM，DPP-IV單酶0.5μg/mL～1.2μg/mL，pH 7.4的PBS緩沖液50mM，總體積為200μL，37℃下孵育1h后通過酶標(biāo)儀分析，每組的平均值與不加DPP-IV的對照組比較，結(jié)果表明300ng/mL的DPP-IV具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，因此確定DPP-IV的檢測 下限為10ng/mL(圖6)。

實(shí)施例5.

DPP-IV酶促動力學(xué)測定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，底物1-500μM，DPP-IV單酶0.25mg/mL或腸微粒體2.5mg/mL，pH 7.4的PBS緩沖液100mM，總體積200μL，37℃下孵育通過酶標(biāo)儀分析1h，每1分鐘測一次。檢測條件：激發(fā)波長430nm，最大發(fā)射波長為535nm。將所獲熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后分別得到DPP-IV單酶和人腸微粒體(HIM)對GPAN的Vmax和Km(圖7)。

實(shí)施例6.

人肝微粒體和人腸微粒體中DPP-IV的活性定量評估

(1)選取人肝微粒體(HLM)和人腸微粒體(HIM)稀釋至2mg/mL，準(zhǔn)備DPP-IV代謝反應(yīng)體系，包括pH 7.4的PBS緩沖液(50mM)、人肝微粒體(0.2mg/mL)和人腸微粒體(0.2mg/mL)，于37℃條件下震蕩預(yù)孵3分鐘；

(2)向反應(yīng)體系中加入2μL濃度為10mM的GPAN起始反應(yīng)；

(3)30分鐘后，加入200μL冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；

(4)用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測(Ex＝400nm，Em＝535nm)，將所獲熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到人肝微粒體(HLM)和人腸微粒體(HIM)對GPAN的代謝速率(圖8)。

實(shí)施例7.

DPP-IV抑制劑篩選

以GPAN的水解代謝為探針反應(yīng)，借助人腸微粒體體外孵育體系，測定五環(huán)三萜化合物甘草次酸、11-羰基-β-乳香酸、熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸、白樺 脂醇對DPP-IV抑制的IC₅₀：

a.200微升體外代謝反應(yīng)體系中，含有pH為7.4的磷酸緩沖液，人腸微粒體蛋白濃度為10μg/ml，抑制劑終濃度范圍為0.01μM-100μM，于37℃條件下震蕩預(yù)孵10分鐘；

b.向反應(yīng)體系中加入底物(終濃度100μM)，起始反應(yīng)；于37℃條件下反應(yīng)30分鐘后，加入200μl乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；

c.采用高速冷凍離心機(jī)，在20,000×g的條件下，高速離心上述體系5分鐘后，取上清，進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測分析；對代謝水解產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。

從所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，白樺脂酸、白樺脂醇對DPP-IV具有一定的抑制活性。

表1五環(huán)三萜化合物對DPP-IV抑制的IC₅₀