本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)骨移植工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種具有再生性能和理想力學(xué)強(qiáng)度的生物相容性骨移植物及其制備方法。
背景技術(shù):
骨骼的自身修復(fù)能力極其有限,用組織工程技術(shù)構(gòu)建工程化骨骼為修復(fù)骨骼缺損提供了一種具有良好應(yīng)用前景的方法。骨骼移植的研究內(nèi)容涉及材料、制劑、移植醫(yī)學(xué)多方面學(xué)科技術(shù),其中構(gòu)建理想的具有再生性能和理想力學(xué)強(qiáng)度的生物相容性骨移植物是成功的關(guān)鍵。
目前用于骨骼移植工程的支架材料包括天然材料和人工合成材料兩種,人工合成的材料主要有聚乙交酯、聚丙交酯以及兩者的共聚物等。人工合成材料的缺點(diǎn)是疏水性,不利于細(xì)胞的粘附,并且降解產(chǎn)物呈酸性,在體內(nèi)容易引起炎癥反應(yīng)。而天然材料來源于動物或人體,其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、成分、生物力學(xué)環(huán)境適合種子細(xì)胞的生長、發(fā)育及新陳代謝,材料可降解,因此越來越受到研究者的重視。
目前常用的天然骨移植材料有膠原和透明質(zhì)烷為原料的天然軟骨的仿生支架。天然材料研制的基本原則是仿生,即模擬天然骨細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物化學(xué)成分,為成骨細(xì)胞生長提供適宜環(huán)境。但是成骨細(xì)胞外基質(zhì)生化成分與結(jié)構(gòu)復(fù)雜,仿生材料難于真正模仿骨組織的復(fù)雜的天然結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)和生物學(xué)特性,很少進(jìn)入臨床應(yīng)用,尚無理想的骨移植物支架。
脫細(xì)胞基質(zhì)由于去除了細(xì)胞和可溶性蛋白等引起免疫反應(yīng)的物質(zhì),并且保留了原先的天然結(jié)構(gòu),已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。目前,異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)已經(jīng)商品化。國外有人用酒精脫水、凍干和液氮循環(huán)凍融等方法對兔鼻間隔軟骨進(jìn)行滅活,作為細(xì)胞生長的支架,但是此種方法會使細(xì)胞殘片殘留,抗原性去除不徹底,并且滅活的大塊軟骨無多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)以及代謝廢物排出困難。國內(nèi)有將軟骨整塊進(jìn)行脫細(xì)胞處理的研究報道,但形成的脫細(xì)胞軟骨不具備組織工程支架要求得多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),營養(yǎng)物質(zhì)的傳送以及代謝物的派出困難;另外國內(nèi)有將軟骨進(jìn)行粉碎后脫細(xì)胞的研究報道,韓雪峰等人將軟骨粉碎成100~154μm微粒,與軟骨細(xì)胞混合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程骨,其缺點(diǎn)是微粒較大、與軟骨細(xì)胞混合不均勻,并且不具備一定具體的形狀,細(xì)胞-微粒復(fù)合體生物力學(xué)強(qiáng)度低,手術(shù)植入不易操作,移植后易出現(xiàn)變形等問題。
絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白,含量約占蠶絲的70%~80%,富含18種氨基酸,具有優(yōu)良的物理特性和化學(xué)特性,可以通過不同處理得到纖維、粉末、膜、凝膠等不同性狀的材料。近年來隨著組織工程化器官和細(xì)胞支架研究的興起以及各種生物技術(shù)的發(fā)展,絲素蛋白的應(yīng)用越來越廣泛,已成功應(yīng)用于手術(shù)縫合線等多種醫(yī)用材料中,但是絲素蛋白本身不具有促進(jìn)軟骨再生能力。此外,體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn),表面涂有絲素蛋白的培養(yǎng)皿中,細(xì)胞不易黏附,生長緩慢。因此,盡管絲素蛋白具有較好的彈性強(qiáng)度、耐磨性能等力學(xué)特性,但缺乏促進(jìn)細(xì)胞黏附和再生能力,因此很難應(yīng)用于骨移植物中。
理想的用于骨移植的材料應(yīng)符合以下基本要求:①具有良好的彈性強(qiáng)度、耐磨性能等力學(xué)特性,能與組織植入部位的力學(xué)要求相匹配。②具有適合細(xì)胞粘附、增生和分化的表面化學(xué)特性,有利于成骨細(xì)胞附著。③為成骨細(xì)胞生長提供了最接近的細(xì)胞外微環(huán)境,良好的生物相容性和生物可吸收性。④制備流程簡單易行,制備出的骨移植物產(chǎn)品容易長期保存。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,本發(fā)明的目的在于提供一種具有再生性能和彈性強(qiáng)度的生物相容性骨移植物,能夠結(jié)合移植手術(shù)用于臨床上骨骼的缺損修復(fù)。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述生物相容性骨移植物的制備方法。
通過大量實驗,本發(fā)明將良好的生物相容性和優(yōu)良力學(xué)性能的絲素蛋白作為基質(zhì)材料,結(jié)合具有良好黏附性的聚乙烯醇、提供骨細(xì)胞生長環(huán)境的鈣鹽、促進(jìn)骨組織再生的兩棲動物軟骨去細(xì)胞支架和成骨誘導(dǎo)因子,制備形成一種符合理想要求的生物相容性骨移植物。
本發(fā)明的一種生物相容性骨移植物的主要組分包括:絲素蛋白、聚乙烯醇、鈣鹽、兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架成分和成骨誘導(dǎo)因子,可以通過改變組分配比,控制骨移植物的力學(xué)強(qiáng)度和降解速度。
上述的生物相容性骨移植物中絲素蛋白的質(zhì)量百分含量為10%-30%、聚乙烯醇的質(zhì)量百分含量為1%-5%、鈣鹽的質(zhì)量百分含量為20%-50%、兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架成分的質(zhì)量百分含量為20%-50%、成骨誘導(dǎo)因子的質(zhì)量百分含量為0.1%-10%。
上述的鈣鹽包括羥基磷灰石、硫酸鈣、檸檬酸鈣、磷酸鈣、海洋生物的骨殼及其提取物。
上述的鈣鹽結(jié)構(gòu)中可以含有不同數(shù)量的結(jié)晶水。
上述的成骨誘導(dǎo)因子包括硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、膠原、促進(jìn)骨組織生長的生物活性因子一種或幾種。
一種上述的生物相容性骨移植物的制備方法,將兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架粉碎,與鈣鹽、絲素蛋白和成骨誘導(dǎo)因子混勻,加入聚乙烯醇乙醇溶液,混勻,形成均勻半固體,置于金屬模具中干燥成型,形成含中空孔道的三維管狀骨移植物,γ-射線輻照滅菌。
另一種上述的生物相容性骨移植物的制備方法,將所述的兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架粉碎,與鈣鹽和絲素蛋白混勻,加入聚乙烯醇乙醇溶液,混勻,形成均勻半固體,置于金屬模具中干燥成型,形成含中空孔道的三維管狀骨移植物,通過浸泡或涂布方式將含有成骨誘導(dǎo)因子的溶液分布于三維管狀骨移植物的內(nèi)腔和表面,晾干后形成有利于軟骨細(xì)胞黏附和再生的成骨誘導(dǎo)因子涂層,γ-射線輻照滅菌。
上述的生物相容性骨移植物的制備過程中進(jìn)一步加入用于藥學(xué)常用的pH緩沖液、抗氧劑、表面活性劑。
上述的生物相容性骨移植物用于骨組織缺損的替換移植物。
本發(fā)明的生物相容性骨移植物具備以下優(yōu)點(diǎn):①應(yīng)用兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架成分制備生物相容性骨移植物,不僅來源廣泛,而且生物相容性好,并有促進(jìn)骨組織再生的能力。②應(yīng)用絲素蛋白和聚乙烯醇,去除因絲膠蛋白引起的免疫反應(yīng),保持骨移植物具有良好的彈性強(qiáng)度、耐磨性能等力學(xué)特性,能與骨組織植入部位的力學(xué)要求相匹配。③成骨誘導(dǎo)因子、鈣鹽和兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架成分合用,為骨組織生長提供了最接近的細(xì)胞外微環(huán)境,具有促進(jìn)細(xì)胞粘附、增生和分化的特性,有利于骨細(xì)胞附著再生。④骨移植物具有良好的生物相容性和生物可吸收性。⑤制備流程簡單易行,制備出的生物相容性骨移植物無菌,容易長期保存;表面成親水性,分布細(xì)密的孔洞,有利于骨細(xì)胞的黏附。⑥生物相容性骨移植物制備過程不經(jīng)加熱,不使用任何化學(xué)或酶交聯(lián)劑,不會產(chǎn)生因交聯(lián)劑殘留導(dǎo)致的毒副反應(yīng),也保存了各組分的活性。
具體實施方式
下文將詳細(xì)描述本發(fā)明具體實施例。應(yīng)當(dāng)注意的是,下述實施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的,它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。
實施例1具有再生性能和彈性強(qiáng)度的生物相容性骨移植物的制備
制備方法1:按照表1的生物相容性骨移植物各實驗組和對照組的組成,秤取各組分,將兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架粉碎,與鈣鹽、絲素蛋白和成骨誘導(dǎo)因子混勻,加入聚乙烯醇乙醇溶液,混勻,形成均勻半固體,置于金屬模具中干燥成型,形成含中空孔道的三維管狀骨移植物,γ-射線輻照滅菌。
制備方法2:按照表1的生物相容性骨移植物各實驗組和對照組的組成,秤取各組分,將兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架粉碎,與鈣鹽和絲素蛋白混勻,加入聚乙烯醇乙醇溶液,混勻,形成均勻半固體,置于金屬模具中干燥成型,形成含中空孔道的三維管狀骨移植物,通過浸泡或涂布方式將含有成骨誘導(dǎo)因子的溶液分布于三維管狀骨移植物的內(nèi)腔和表面,晾干后形成有利于軟骨細(xì)胞黏附和再生的成骨誘導(dǎo)因子涂層,γ-射線輻照滅菌。
表1生物相容性骨移植物各實驗組的組成
注:“/”代表此項組分為0;“軟骨去細(xì)胞支架成分”項下數(shù)字后的括號內(nèi)的動物是指軟骨去細(xì)胞支架成分的來源動物。
實施例2生物相容性骨移植物的性能檢測和應(yīng)用效果
(1)各組骨移植物的性能檢測
表面孔徑觀察:光鏡和掃描電鏡觀察下各組的生物相容性骨移植物表面的孔隙率和孔徑大小,是否均勻一致。
吸水性測定:稱量生物相容性骨移植物質(zhì)量Wo值,然后置于盛有去離子水的稱量瓶中,充分溶脹,用濾紙吸干表面水分,稱質(zhì)量得Wn值。樣品吸水率根據(jù)下列公式計算:吸水率(%)=[(Wn-Wo)/Wo]×100
硬度測定:利用萬能試驗機(jī),測定生物相容性骨移植物的壓縮模量和拉伸模量。
(2)各組骨移植物的生物相容性
采用MTT法檢測生物相容性骨移植物浸提液對體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞的毒性;采用裸鼠實驗,將生物相容性骨移植物植入到裸鼠背部皮袋,4周后取組織觀察結(jié)果,判斷支架的體內(nèi)相容性。
(3)各組骨移植物對缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨的移植修復(fù)效果
將生物相容性骨移植物植入修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損,6個月后觀察兔膝關(guān)節(jié)的活動行為,取修復(fù)部位的軟骨組織進(jìn)行組織學(xué)觀察,綜合評價各組的生物相容性骨移植物對于缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨的移植修復(fù)后的應(yīng)用效果。本項指標(biāo)作為軟骨組織的替換移植物的最關(guān)鍵評價指標(biāo)。
實驗結(jié)果:以上各組的生物相容性骨移植物實驗結(jié)果見表2。
從表2數(shù)據(jù)可見,各個實驗組在孔隙率、孔徑大小、吸水性、壓縮模量和拉伸模量等性能指標(biāo)上相差不明顯,各項性能指標(biāo)優(yōu)異,且體內(nèi)外相容性良好,兔膝關(guān)節(jié)的活動行為和組織學(xué)評價等指標(biāo)良好,驗證了實驗組對于缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨具有良好移植修復(fù)效果。
對照組中,對照2的壓縮模量和拉伸模量的指標(biāo)很差,其余對照組的性能指標(biāo)與實驗組接近,但對照組對于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)效果差,移植后關(guān)節(jié)出現(xiàn)變形。即使是對照組4,選用高等動物小鼠的軟骨去細(xì)胞支架成分,替代兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架成分,但對于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)效果仍然較差,并且需要較長的修復(fù)時間才能達(dá)到接近實驗組的修復(fù)效果。
由上可知,實驗組對于對缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨的移植修復(fù)效果良好,可以作為骨組織的替換移植物。而缺失本發(fā)明的生物相容性骨移植物主要組分的對照組不能作為關(guān)節(jié)軟骨缺損的移植替代物應(yīng)用,即使替換高等動物小鼠的軟骨去細(xì)胞支架成分代替本發(fā)明的兩棲動物的軟骨去細(xì)胞支架成分,也不能取得良好的骨修復(fù)效果。
表2生物相容性骨移植物各實驗組的性能結(jié)果和應(yīng)用效果
上述詳細(xì)說明是針對發(fā)明的可行實施例的具體說明,該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍,凡未脫離本發(fā)明的等效實施或變更,均應(yīng)當(dāng)包含于本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
另外,本領(lǐng)域技術(shù)人員還可在本發(fā)明權(quán)利要求公開的范圍和精神內(nèi)做其它形式和細(xì)節(jié)上的各種修改、添加和替換。當(dāng)然,這些依據(jù)本發(fā)明精神所做的各種修改、添加和替換等變化,都應(yīng)包含在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。