本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及總酚酸及其低聚果糖為主要活性成分的牛蒡根提取物在制備抗帕金森藥物或保健食品中的用途。
背景技術(shù)：
牛蒡(Arctium Lappa L .)系菊科2年生草本植物，又名白肌人參、蒡翁菜。原產(chǎn)我國,公元940 年前后傳入日本, 被培育出多個優(yōu)良品種, 成為日本人喜食的蔬菜。近年來,我國從日本引進了牛蒡的新品種，并迅速在北京、上海、江蘇、山東等地種植, 成為這些地區(qū)重要的出口農(nóng)產(chǎn)品。目前，牛蒡在國內(nèi)已大面積栽培,主要在山東蒼山和江蘇徐州等地，以牛蒡根作為蔬菜生產(chǎn)為主，出口韓國和日本，并且近幾年在我國的食用銷量也大幅增加。
牛蒡是我國傳統(tǒng)中藥, 早在南北朝的《名醫(yī)別錄》中就有關(guān)于牛蒡入藥的記載, 其主要的藥用部分是牛蒡子(牛蒡的瘦果)。牛蒡子中主要有效成分為牛蒡苷，其發(fā)揮作用的形式是牛蒡苷在體內(nèi)代謝成牛蒡苷元而發(fā)揮其藥理作用。有報道牛蒡苷元具有較好的抗帕金森作用（申請?zhí)?01210402024.0，牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應(yīng)用）。目前牛蒡根化學成分研究較少，我國民間將其作為抗衰老、降血糖和補腎壯陽的特種保健蔬菜；牛蒡根在《名醫(yī)別錄》、《藥性論》、《本草拾遺》等典籍中多有記載, 但沒有形成中草藥類的商品,《中國藥典》也未收入。研究表明，牛蒡根中主要含有酚酸類（如咖啡酸、綠原酸等）、菊糖等成分，其具有調(diào)節(jié)胃腸道、抗菌、抗癌及抗病毒作用（牛蒡根的藥用研究進展，中醫(yī)藥學報，2006，34（1）：24-25）。我們和文獻報道都表明牛蒡根中未發(fā)現(xiàn)牛蒡苷和苷元等木脂素類成分。
帕金森?。≒D），是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進性死亡為病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前，對帕金森病藥物治療，以西藥為主，但只能改善癥狀，不能控制病癥的進程，長期應(yīng)用療效減弱且毒性增大；而中藥治療具有毒副作用小、協(xié)同作用強等優(yōu)勢而更具有開發(fā)治療藥物的前景。因此，亟需研究開發(fā)一種針對性強，副作用低，并且適用于制備抗帕金森病藥物的中藥提取物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明提供了一種牛蒡根提取物，該提取物可以用于制備抗帕金森病藥物，該藥物對帕金森疾病具有顯著的治療效果。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的牛蒡根提取物用于制備抗帕金森藥物和保健食品。
所述的牛蒡根提取物中總酚酸的含量為8-15%，低聚果糖含量為20-35%。
所述的牛蒡根提取物可與藥學或食品方面可接受的載體或賦形劑制成顆粒劑、膠囊和片劑等劑型。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供所述牛蒡根提取物的制備方法，包括以下步驟。
步驟1、牛蒡根預處理：精選生鮮牛蒡根置于冷庫三個月以上后，取出清洗、切片，切片厚度3-4mm，備用。
步驟2、牛蒡根提取物的提?。簩⒉襟E1中的牛蒡根切片放入提取罐中， 100℃條件下，加水提取2次，每次處理4小時，紗布濾過，合并兩次提取液，減壓濃縮，得濃縮液；將濃縮液干燥處理，即得牛蒡根提取物。
所述步驟2中每次水提取中水的用量為牛蒡根切片重量的3-5倍。
所述步驟2中干燥的處理方式為減壓干燥、噴霧干燥或凍干。
本發(fā)明的有益效果。
本發(fā)明中，對抗帕金森病中藥有效成分篩選過程中，發(fā)現(xiàn)牛蒡根提取物具有較好的抗帕金森病的藥理作用；牛蒡子中具有抗帕金森作用的化合物為牛蒡苷元，牛蒡苷元為單體化合物，制備成本較高，而且其生物利用度不高（Fan He, De-Qiang Dou, Qiang Hou, Yu Sun & Ting-Guo Kang.Pharmacokinetic study of arctigenin in rat plasma and organ tissue by RP-HPLC method Natural Product Research 2013，27(10)：903-906.），服用量大，成本高，毒副作用較大。在對牛蒡根的成分分析過程中，未發(fā)現(xiàn)有牛蒡苷及苷元等木脂素類成分，因此其抗帕金森作用與牛蒡子中抗帕金森作用的成分和機制不同。并且通過藥理試驗證明，該牛蒡根提取物具有較強的抗帕金森活性，可單獨或與其它藥物組合作為原料藥應(yīng)用于抗帕金森藥物的制劑中。本發(fā)明提供的方法制備的牛蒡根提取物制備方法簡便實用，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的牛蒡根提取物中總酚酸和低聚果糖含量測定參照下列文獻：1.魏旭，冉小庫，李德偉，竇德強，董鋒. 亞貢葉提取物中總酚酸的含量測定方法研究. 遼寧中醫(yī)雜志2015,42(4):811-8；2.柴元武.間苯二酚分光光度法測定果葡糖漿中的果糖[J].河南城建高等專科學校學報, 2001,(10)1:54-56。我們研究發(fā)現(xiàn)牛蒡根中具有菊糖水解酶，在一定溫度下放置三個月以上，牛蒡根中菊糖（多糖）轉(zhuǎn)化為低聚果糖（2-18聚糖），因此本發(fā)明所采用的牛蒡根需要在低溫下儲藏三個月以上。
附圖說明
圖1 牛蒡根提取物中低聚果糖分析色譜圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細的說明。
實施例1
牛蒡根提取物的制備方法如下：精選生鮮牛蒡根20kg，置于冷庫（溫度為4℃）儲存三個月；然后取出牛蒡根，用毛刷處理根部表面，并用水清洗干凈；用切片機（YQC-600/1000型）將牛蒡根切成片狀，厚度3mm；取牛蒡根切片10kg，放入提取罐中，加入水30kg，100℃條件下提取4小時，紗布濾過，收集提取液，將沉淀物重復提取操作一次，合并兩次提取液；將合并后的提取液進行減壓濃縮，得到濃縮液5升，在溫度為130 ℃(進口溫度)/65 ℃(出口溫度)噴霧干燥4h，得到牛蒡根提取物0.29kg，收率為2.9%，其中總酚酸的含量為9.2%，低聚果糖含量為28.9%。
1.牛蒡根中具有菊糖水解酶，在一定溫度下放置三個月以上，牛蒡根中菊糖（多糖）轉(zhuǎn)化為低聚果糖（2-18聚糖），其色譜分析條件如下：Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，檢測器為Waters 2424蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）；色譜柱為華譜XAmide（4.6×250 mm，10m）；以乙腈（B）-水（C）為流動相梯度洗脫，0-100 min（35%C-50%C），100-120 min（50%C-60%C）；流速0.5mL/min；柱溫30℃；進樣量10 μL；蒸發(fā)光檢測條件：霧化溫度80℃，壓力30psi（2.0685 bar），gain值為10，增益值為1，結(jié)果見圖1。
2.低聚果糖的測定方法，具體操作過程如下。
（1）顯色劑的制備:精密稱取間苯二酚0.500g，溶于100mL蒸餾水中，過濾；取上述溶液20mL，加蒸餾水50mL、濃HCl 50mL，混勻即可。
（2）果糖對照品的制備:精密稱取55℃真空條件下干燥至恒重的果糖1.000g，溶于10mL蒸餾水后，加6mol/L的HCl 2mL，轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中定容，使用時再稀釋成0.5 mg/mL即可。
（3）果糖標準曲線：在6支10mL具塞比色管中，依次加入0.500mg/mL果糖溶液0mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL，再分別加入1.0mL，0.2 mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL的蒸餾水，然后均加入顯色劑9.0mL，置于水浴鍋中，水浴加熱至100℃并恒溫8min；取出后，將具塞比色管通過自來水流水冷卻10min，用1cm比色皿，以試劑空白為參比，在473nm處測其吸光度A，標準曲線回歸方程為：Y=13.949X+0.0552，r = 0.998，其中Y為吸光度，X為果糖對照品溶液濃度（單位為mg/mL）。結(jié)果表明：果糖在0.015 - 0.040mg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
（4）供試品低聚果糖含量測定: 稱取牛蒡根提取物10mg，置于25mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，混勻靜置15min后，精密吸取該溶液1mL于10mL容量瓶中，蒸餾水定容，混勻后靜置15min后，于具塞比色管中，加入顯色劑9mL。置于水浴鍋中，水浴加熱至100℃并恒溫8 min；取出后，將具塞比色管通過自來水流水冷卻10 min，用1cm比色皿，以試劑空白為參比，在473nm處測其吸光度，根據(jù)果糖標準曲線：Y=13.949X+0.0552，r = 0.998，其中Y為吸光度，X為果糖對照品溶液濃度（單位為mg/mL）。計算提取物有低聚果糖含量。
3.采用比色法對牛蒡根提取物中的總酚酸進行含量測定（石玉媛，何凡，李瑩瑩，竇德強，康廷國，董鋒.不同產(chǎn)地亞貢葉中總酚酸的含量測定.中華中醫(yī)藥學刊，2010，28（7）：1475-1477），具體操作過程如下。
精密稱取牛蒡根提取物30毫克于10毫升容量瓶中，加50%甲醇超聲溶解，50%甲醇定容，制備供試品溶液；精密量取1ml供試品溶液，置于25ml量瓶中，先加甲醇5ml，再加0.3%十二烷基硫酸鈉2ml后，然后加0.6% FeCl3.6H2O和0.9%K3[Fe(CN)6](體積比1：1)混合溶液2ml；在暗處放置5min，加0.1mol/l HCl溶液至刻度，在暗處放置20min；以顯色劑為空白，以綠原酸為對照品，在746nm處測定吸光度，根據(jù)綠原酸的標準曲線方程Y=143.7X+0.0403(r=0.9997，線性范圍0.002 -0.005 mg/mL。其中Y為吸光度,X為對照品溶液濃度(mg/mL ))，進行定量分析。
4.牛蒡根提取物的抗帕金森作用研究。
4.1實驗材料。
C57BL/6小鼠購自購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。試驗中采用實施例1制備的牛蒡根提取物。
4.2動物分組。
將50只C57BL/6小鼠隨機分為5組：空白組、模型組、陽性藥組（多巴絲肼片（美多芭），上海羅氏制藥有限公司）和牛蒡根提取物高、低劑量組，每組10只。
4.3造模及給藥方法。
模型組和高、低劑量組皮下注射MPTP（購于Sigma公司）25 mg/kg，每天一次，連續(xù)3天，第四天開始，繼續(xù)皮下注射MPTP，同時高、低劑量組灌胃給予牛蒡根提取物，其高、低劑量組分別給藥60mg/kg、30mg/kg，每天給藥一次，連續(xù)給藥9天；空白組以腹腔注射等量生理鹽水代替MPTP，每天一次；陽性藥組每天給予50的多巴絲肼片。每天進行動物行為學實驗考查。
4.4行為學考查。
4.4.1懸掛實驗（Traction test）。
實驗目的是檢測C57BL/6小鼠肢體運動協(xié)調(diào)情況。將受試小鼠懸掛于一水平電線上，電線直徑約為0.2mm；從小鼠雙前爪抓住電線開始計時，小鼠掉落則計時結(jié)束：25秒以上的記6分；20-25秒記5分；15-20秒記4分；10-15秒記3分；5-10s記2分；0-5s記1分。最后計算得分情況，并作統(tǒng)計學分析，分值越高，小鼠抓住電線越牢固，說明小鼠肢體運動協(xié)調(diào)情況越好；反之，則說明小鼠震顫、肌強直等情況嚴重。懸掛實驗結(jié)果，見表1。
表1懸掛實驗得分結(jié)果（±s）。
注：△與空白組比較，有差異（p<0.05）；△△與空白組比較，差異顯著（p<0.01）；▲與模型組比較，有差異（p<0.05），▲▲與模型組比較，有顯著差異（p<0.01）。
4.4.2 爬桿實驗（Pole test）。
實驗目的是檢測C57BL/6小鼠肢體運動協(xié)調(diào)情況。將一直徑為2.5 cm的軟木球固定于一根長50 cm，直徑1 cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，然后將被測小鼠放到小球上，并記錄小鼠爬完桿子所需要的時間；然后按以下標準記分：0-3 秒內(nèi)完成上述動作，記6分；3-6 秒內(nèi)完成上述動作，記5分；6-9秒內(nèi)完成上述動作，記4分；9-12秒內(nèi)上述動作，記3分；12-15秒內(nèi)上述動作，記2分；15秒以上完成上述動作，記1分。最后計算得分情況，并作統(tǒng)計學分析，分值越高，小鼠爬完桿子的全程所用的時間越少，說明小鼠肢體運動協(xié)調(diào)情況越好，也說明小鼠對爬桿實驗越來越熟練，結(jié)果見表2。
表2 爬桿實驗得分結(jié)果 （±s）。
注：△與空白組比較，有差異（p<0.05）；△△與空白組比較，差異顯著（p<0.01）；▲與模型組比較，有差異（p<0.05）。
5.牛蒡根提取物的抗帕金森的血清藥理學試驗。
5.1實驗材料。
采用SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。所用牛蒡根提取物為采用實施例1制備，稱取提取物適量，配制成5 mg/mL的水溶液，待用。
5.2實驗方法。
5.2.1 藥物血清的制備。
大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，自由飲水進食。隨機分為空白組和牛蒡根提取物高、低劑量組，每組6只；高、低劑量組分別給牛蒡根提取物60mg/kg、30mg/kg，每天灌胃給藥2次，連續(xù)給藥7天；空白組給予等量生理鹽水。于末次給藥后0.5 h各組動物摘眼球取血，靜置0.5 h后，3000 rpm/min離心10 min，分離得血清，在56℃條件下滅活處理30 min，以除去可能存在的生物活性物質(zhì)，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，密封后置于-20℃冰箱保存，備用。
5.2.2細胞分組與處理。
人母神經(jīng)細胞瘤系細胞（SH-SY5Y細胞，購于中科院上海細胞庫），用含10％滅活胎牛血清、青霉素100U·mL-1、鏈霉素100 μg·mL-1的 DMEM F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至單層細胞約80%匯合時，傳代培養(yǎng)，用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。調(diào)整細胞密度為1×105接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16 h待細胞貼壁。將細胞隨機分為3組：模型組、實驗組和空白血清對照組，每組設(shè)3個復孔。牛蒡根提取物高、低劑量組只加入含體積分數(shù)5%、10%和20%相應(yīng)的含藥血清完全培養(yǎng)基，模型組和空白血清對照組只加相應(yīng)體積分數(shù)的空白血清。各組于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實驗組和模型組同時加入1mM的MPP+（購于sigma公司），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。3組細胞每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加DMSO 100 μL，待結(jié)晶充分溶解，酶標儀檢測 492 nm處各孔的吸收值（OD值）（參考波長620 nm），計算細胞存活率。
細胞存活率％=實驗組OD值／空白血清對照組OD值×100％。
統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計學處理。
5.2.3. 實驗結(jié)果。
與空白血清組相比，模型組細胞存活率顯著降低；加入高、低劑量的牛蒡根提取物含藥血清組的存活率顯著增加，與模型組有顯著統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表3，結(jié)果表明，一定體積分數(shù)的牛蒡根提取物含藥血清對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞有明顯的保護作用。
表3 不同體積分數(shù)的含藥血清對抗MPP+細胞毒性后的SH-SY5Y細胞存活率(±s)。
注：*與模型組比較，有差異（p<0.05）；**與模型組比較，有顯著差異（p<0.01），***與模型組比較，有極顯著差異（p<0.001）。
6．牛蒡根提取物制劑的研究。
6.1 儀器和試劑：儀器有TDP-5T單沖壓片機（上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司）；FA-1004型電子天平（上海精科天平廠）；水浴鍋（鞏義市予化儀器有限責任公司）；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱。試驗中所用試劑均為分析純，購于禹王試劑公司。
6.1.1片劑制備：取實施例1所得牛蒡根提取物10 g，可壓淀粉30g，用7mL 80%乙醇制成軟材，以捏之成團，搓之即散做為成型標準成型，將制好的顆粒于60℃烘干處理12 h，過10目篩，篩選出顆粒，備用；將制好的顆粒稱重，按照顆粒重量0.5%的量加入硬脂酸鎂，以不同規(guī)格的壓片機壓片，分別制備片重為400毫克/片、200毫克/片和100毫克/片的片劑，壓力在16-18kg/片；片劑中每400毫克含牛蒡根提取物100毫克。結(jié)合患者具體癥狀給藥，建議每次3片（400毫克/片），每日2次。
6.1.2膠囊劑的制備：以上述5.1.1制備好的顆粒，采用膠囊機裝膠囊，制備400毫克/囊的膠囊劑。結(jié)合患者具體癥狀給藥，建議服用劑量為每次3粒，每日2次。
6.1.3口服液的制備：取實施例1所得的牛蒡根提取物20克，加水 300毫升溶解，加橙皮苷4毫升，加單糖漿至1000毫升得糖漿劑。結(jié)合患者具體癥狀給藥，建議服用劑量每次15 毫升，每日2 次。
上述僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進行非實質(zhì)性的改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護范圍的行為。