本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒及其在植入劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

注射微整形技術(shù)在美容外科的應(yīng)用迅猛發(fā)展，在頜面部軟組織缺陷的修復(fù)治療、隆鼻和隆下巴中也逐漸顯示出其創(chuàng)傷小、恢復(fù)快的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。無(wú)無(wú)論單獨(dú)使用還是作為正頜、正畸修復(fù)手術(shù)的補(bǔ)充，微創(chuàng)注射技術(shù)在創(chuàng)傷重建，頜面部軟組織缺陷修復(fù)、隆鼻和隆下巴中具有廣闊的應(yīng)用前景。

牛膠原蛋白作為注射填充材料相關(guān)產(chǎn)品已獲FDA 批準(zhǔn)。ZydermⅠ含 3.5%牛膠原蛋白，適用于眶周、口周等淺表皺紋的淺層填充；ZydermⅡ含 6.5%牛膠原蛋白，適合眉間皺紋、鼻唇溝、痤瘡瘢痕等中度至深度皺紋的凹陷填充，因其膠原含量較高，注射后可能會(huì)出現(xiàn)暫時(shí)的隆起；Zyplast含 3.5%的牛膠原蛋白，但經(jīng)過(guò)戊二醛交聯(lián)處理后韌性更強(qiáng)，更適合深度皺紋的填充。在注射后的維持時(shí)間上，ZydermⅠ/Ⅱ僅為 2~4 個(gè)月，因此注射時(shí)矯枉過(guò)正的手段是必要的（一般實(shí)際用量為需要量的1.5~2.0倍）；而化學(xué)交聯(lián)則使Zyplast的保持時(shí)間也才4~6 個(gè)月。但由于人體內(nèi)膠原酶持續(xù)的降解作用，需要定期注射以達(dá)到良好的治療效果。另外，首款HA填充材料含5.5 mg/mL的交聯(lián)透明質(zhì)酸，于2004年獲FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚皺紋及凹陷性瘢痕，其Ⅲ期臨床試驗(yàn)顯示該產(chǎn)品極少出現(xiàn)并發(fā)癥，包括過(guò)敏反應(yīng)，但維持時(shí)間才5個(gè)月左右。

中國(guó)專利CN200510044005.5公開(kāi)了一種可注射軟組織生物填充材料的制備方法；該方法采用豬皮經(jīng)脫脂、脫細(xì)胞、戊二醛交聯(lián)等工序，物理加工制的微粒。該專利制備微粒的方法只是將交聯(lián)后材料通過(guò)物理方法切制為邊長(zhǎng)為300~500 u m的微粒，然而其微粒粒徑過(guò)大，無(wú)法采用直徑較小的針頭注射；從而限制其在注射整形領(lǐng)域的實(shí)用價(jià)值。

中國(guó)專利CN02156797.2公開(kāi)了一種注射性膠原蛋白的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，該方法采用動(dòng)物組織中的膠原蛋白纖維來(lái)制備注射性膠原蛋白，然而在制備過(guò)程中會(huì)破壞動(dòng)物組織原有結(jié)構(gòu)及其他成分，也損失了組織中具有生物活性或生物功能的活性成分，只能起到單純的膠原蛋白填充作用。

如上所述，目前已上市的一些美容整形植入材料及國(guó)內(nèi)同類專利公開(kāi)的美容整形植入材料制備方法均存在一定的缺點(diǎn)，尤其膠原和透明質(zhì)酸植入劑產(chǎn)品，并未包含生物活性因子，因此其作用僅僅是填充，該類植入劑產(chǎn)品的美容效果是暫時(shí)性，當(dāng)這些填充材料被機(jī)體逐漸分解吸收，美容修復(fù)效果就會(huì)減弱或消失。目前尚無(wú)采用脫細(xì)胞軟骨為原料制備可注射充填材料的產(chǎn)品，亦無(wú)專利及文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒，由軟骨按以下步驟制備而成：

1）取動(dòng)物軟骨，去除其他肌肉及肌腱組織，漂洗，消毒，漂洗，反復(fù)凍融；

2）將軟骨切成薄片，然后置于0.5-3mM氯化鉀溶液中浸泡3-6h；

3）將所得軟骨薄片置于含0.1~1MEDTA的0.001~0.1M氫氧化鈉溶液中浸泡12~18h，漂洗，再置于含0.1~1MHCl的0.1~1M氯化鈉溶液中浸泡5~10h，漂洗；

4）重復(fù)步驟3），再將軟骨薄片置于緩沖液中浸泡后，置于除垢劑中振蕩萃取20~30h，漂洗；

5）將軟骨薄片置于緩沖液中浸泡，冷凍干燥，低溫研磨，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

優(yōu)選的，所述消毒采用體積濃度為50~90%的乙醇水溶液和/或體積濃度為0.2~2%的過(guò)氧乙酸水溶液進(jìn)行消毒。

優(yōu)選的，所述除垢劑為質(zhì)量濃度為1~4％的曲拉通溶液。

優(yōu)選的，步驟2）氯化鉀溶液的濃度為0.5-3mM。優(yōu)選的，于氯化鉀溶液中浸泡3-6h。

優(yōu)選的，所述反復(fù)凍融的方法：將軟骨置于-80℃冰箱中冷凍0.5~3h，然后取出于37℃下解凍0.1~1h；反復(fù)凍融的次數(shù)：2~5次。

優(yōu)選的，優(yōu)選的，低溫研磨后，選粒徑為20~200um的微粒，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。由于所得脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒直徑為20~200um，可使用25~27g小針頭注射。

優(yōu)選的，所述漂洗采用緩沖液進(jìn)行漂洗。

優(yōu)選的，所述緩沖液為PBS溶液。

優(yōu)選的，所述軟骨為哺乳動(dòng)物的軟骨。優(yōu)選的，所述軟骨取自屠宰兩小時(shí)內(nèi)哺乳動(dòng)物的軟骨。

優(yōu)選的，所述步驟2）中將軟骨切成厚度不大于2mm的薄片。

優(yōu)選的，步驟2）水中浸泡時(shí)間8~12h。

優(yōu)選的，步驟5）緩沖液中浸泡時(shí)間10~16h。

優(yōu)選的，步驟3）中每次浸泡時(shí)，軟骨薄片與溶液的體積比為1：20~1:100。

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑，含有上述的可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒、植入輔料，其中，所述可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒、植入輔料的質(zhì)量體積比(m/v) g：mL為1:1~1:10。

優(yōu)選的，植入輔料包括磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、自體富血小板血漿、聚電解質(zhì)溶液中的至少一種。

優(yōu)選的，所述聚電解質(zhì)溶液中的聚電解質(zhì)為氧化纖維素、羧甲基甲殼素、羧甲基殼聚糖、羧甲基纖維素鈉、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、海藻酸鈉、聚谷氨酸中的至少一種，其中，聚電解質(zhì)溶液的濃度為0.5~40g/L，自體富血小板血漿以制備的濃度為準(zhǔn)。

優(yōu)選的，植入輔料還包括細(xì)胞生長(zhǎng)因子、利多卡因中的至少一種，其中，細(xì)胞生長(zhǎng)因子終濃度為0.1~100mg/L，利多卡因終濃度為0.1~10g/L。

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑可將組分混勻后滅菌灌裝，使用時(shí)再混勻，也可將可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒、植入輔料分別滅菌灌裝，使用時(shí)再混勻。

本發(fā)明的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒含有生物及細(xì)胞活性的細(xì)胞外基質(zhì)成分，主要成分為脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)中的二型膠原蛋白，其中還包含透明質(zhì)酸及氨基多糖等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒含有生物及細(xì)胞活性的細(xì)胞外基質(zhì)成分，具備生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)構(gòu)成分為細(xì)胞自身的細(xì)胞外基質(zhì)，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、表型和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)具備生理作用。

本發(fā)明的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑作為微創(chuàng)注射整形植入材料，一方面，可作為在創(chuàng)傷、疾病或先天性畸形和美容的后續(xù)重建的組織替代或填充物，另一方面，保留了軟骨的天然三維立體結(jié)構(gòu)以及大量的天然活性成分，降低了美容注射產(chǎn)品在臨床使用后因原料來(lái)源而引起的免疫排斥反應(yīng)，適用于注射至皮下真皮層深層至皮下淺層以修復(fù)中度至重度皺紋、褶皺，填充，具有良好的美容修復(fù)效果。

附圖說(shuō)明

圖1是可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的SEM圖（200 um）；

圖2是可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的SEM圖（50 um）；

圖3是可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的SEM圖（1 um）；

圖4是成纖維細(xì)胞與植入劑復(fù)合培養(yǎng)后的普通光學(xué)顯微鏡下的觀察圖；

圖5是實(shí)驗(yàn)組植入劑植入大鼠皮下兩周后的組織學(xué)切片效果觀察的圖；

圖6是實(shí)驗(yàn)組植入劑植入大鼠皮下四周后的組織學(xué)切片效果觀察的圖；

圖7是對(duì)照組植入劑植入大鼠皮下兩周后的組織學(xué)切片效果觀察的圖；

圖8是對(duì)照組植入劑植入大鼠皮下四周后的組織學(xué)切片效果觀察的圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

實(shí)施例中所述溶液，如無(wú)特別說(shuō)明，均指水溶液。

實(shí)施例1

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的制備方法，包括以下步驟：

1）取牛的軟骨，在PBS溶液中漂洗3次，用體積濃度為75%的乙醇水溶液對(duì)軟骨進(jìn)行消毒處理30分鐘，在PBS溶液中漂洗3次，然后將軟骨置于-80℃冰箱中冷凍2h，在37℃下解凍0.5h，如此反復(fù)凍融3次；

2）將所得軟骨切成薄片，厚度不大于2mm，軟骨薄片在1mM氯化鉀溶液中浸泡3h；

3）將所得軟骨薄片置于含0.5MEDTA的0.01M氫氧化鈉水溶液中浸泡12h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次；然后將軟骨薄片置于含0.5MHCl的1M氯化鈉水溶液中浸泡8h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次；接著將軟骨薄片置于含0.8MEDTA的0.01M氫氧化鈉溶液中浸泡12h，軟骨薄片與溶液的體積比為1:100，用PBS溶液漂洗3次，再將軟骨薄片置于含1MHCl的1M氯化鈉溶液中浸泡8h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：60，用PBS溶液漂洗3次；

4）將所得軟骨薄片置于PBS溶液浸泡12h，然后室溫下在質(zhì)量濃度為1％的曲拉通溶液中振蕩萃取24h，振蕩速率為120轉(zhuǎn)/分鐘，用PBS溶液漂洗3次；

5）將所得軟骨薄片在PBS溶液中浸泡12h，然后冷凍干燥，低溫研磨，選粒度為20微米至200微米的基質(zhì)微粒，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑，包括質(zhì)量體積比為1:4的組分a和組分b，組分a為上述所得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒，組分b為10g/L透明質(zhì)酸溶液。

制備過(guò)程：將組分a和組分b用醫(yī)用三通混勻，得軟骨微粒懸液，軟骨微粒懸液經(jīng)無(wú)菌真空灌裝，再經(jīng)20kGy伽馬射線輻照滅菌，最后使用時(shí)再用醫(yī)用三通混勻，即制得可臨床使用的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑。

實(shí)施例2

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的制備方法，包括以下步驟：

1）取豬的軟骨，在PBS溶液中漂洗4次，用體積濃度為0.5%的過(guò)氧乙酸水溶液對(duì)軟骨進(jìn)行消毒處理30分鐘，在PBS溶液中漂洗3次，將軟骨置于-80℃冰箱中冷凍2h，在37℃下解凍0.8h，如此反復(fù)凍融3次；

2）將所得軟骨切成薄片，厚度不大于2mm，軟骨薄片在2mM氯化鉀溶液中浸泡4h；

3）將所得軟骨薄片置于含1MEDTA的0.01M氫氧化鈉溶液中浸泡14h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：60，用PBS溶液漂洗3次；然后軟骨薄片置于含1MHCl的0.6M氯化鈉溶液中浸泡8h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：60，用PBS溶液中漂洗3次；接著將軟骨薄片置于含1MEDTA的0.01M氫氧化鈉溶液中浸泡12h，軟骨薄片與溶液的體積比為1:100，用PBS溶液漂洗3次，將所得軟骨薄片置于含1MHCl的0.6M氯化鈉溶液中浸泡8h，軟骨薄片與溶液比例為按體積比為1：60，用PBS溶液漂洗3次；

4）將所得軟骨薄片置于PBS溶液浸泡12h，然后室溫下在質(zhì)量濃度為2％的曲拉通溶液中萃取振蕩24h，振蕩速率為120轉(zhuǎn)/分鐘，用PBS溶液漂洗3次；

5）將所得軟骨薄片在PBS溶液中浸泡12h，然后冷凍干燥，低溫研磨，選粒度為20微米至200微米的基質(zhì)微粒，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

可注射的脫細(xì)胞軟骨植入劑，包括質(zhì)量體積比為1:5的組分a和組分b，組分a為上述所得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒，組分b為5g/L羧甲基殼聚糖溶液。

制備過(guò)程：將組分a和組分b分裝到兩個(gè)無(wú)菌真空灌裝，再經(jīng)30kGy伽馬射線輻照滅菌，最后使用時(shí)用醫(yī)用三通混勻，即制得可臨床使用的軟骨基質(zhì)微粒植入劑。

實(shí)施例3

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的制備方法，包括以下步驟：

1）取牛動(dòng)物軟骨，在PBS溶液中漂洗3次，用體積濃度為75%的乙醇水溶液對(duì)軟骨進(jìn)行消毒處理10分鐘，再用體積濃度為0.2%的過(guò)氧乙酸水溶液對(duì)軟骨進(jìn)行消毒處理20分鐘，在PBS溶液中漂洗3次，然后將軟骨置于-80℃冰箱中冷凍1.5h，在37℃下解凍0.5h，如此反復(fù)凍融3次；

2）將所得軟骨切成薄片，厚度不大于2mm，軟骨薄片在1.5 mM氯化鉀溶液中浸泡5h；

3）將所得軟骨薄片置于含1MEDTA的0.01M氫氧化鈉溶液中浸泡12h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次；然后軟骨薄片置于含1MHCl的1M氯化鈉溶液中浸泡6h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次，接著將軟骨薄片置于0.8MEDTA、0.01M氫氧化鈉溶液中浸泡12h，軟骨薄片與溶液的體積比為1:100，用PBS溶液漂洗3次，再將所得軟骨薄片置于含1MHCl的1M氯化鈉溶液中浸泡8h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：60，用PBS溶液漂洗3次；

4）將軟骨薄片置于PBS溶液浸泡12h，然后室溫下在質(zhì)量濃度為3％的曲拉通溶液中萃取24h，振蕩速率為120轉(zhuǎn)/分鐘，用PBS溶液中漂洗3次；

5）將所得軟骨薄片在PBS溶液浸泡12h，然后冷凍干燥，低溫研磨，選粒度為20微米至200微米的基質(zhì)微粒，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

可注射的脫細(xì)胞軟骨植入劑，包括質(zhì)量體積比為1:5的組分a和組分b，組分a為上述所得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒，組分b為生理鹽水。

制備過(guò)程：將組分a、組分b先經(jīng)20kGy伽馬射線輻照滅菌，再將組分a和組分b按比例分裝到兩個(gè)無(wú)菌真空灌裝，最后使用時(shí)用醫(yī)用三通混勻；即制得可臨床使用的軟骨微粒植入劑。

實(shí)施例4

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的制備方法，包括以下步驟：

1）取牛的軟骨，在PBS溶液中漂洗3次，用體積濃度為75%的乙醇水溶液對(duì)軟骨進(jìn)行消毒處理30分鐘，在PBS溶液中漂洗3次，然后將軟骨置于-80℃冰箱中冷凍2h，在37℃下解凍0.5h，如此反復(fù)凍融3次；

2）將所得軟骨切成薄片，厚度不大于2mm，軟骨薄片在1mM氯化鉀溶液中浸泡3h；

3）將所得軟骨薄片置于含0.1M EDTA的0.1M氫氧化鈉水溶液中浸泡15h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次；然后將軟骨薄片置于含0.1MHCl的0.8M氯化鈉水溶液中浸泡5h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次；接著將軟骨薄片置于含0.1M EDTA的0.1M氫氧化鈉溶液中浸泡15h，軟骨薄片與溶液的體積比為1:100，用PBS溶液漂洗3次，再將軟骨薄片置于含0.1MHCl的0.8M氯化鈉溶液中浸泡5h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：60，用PBS溶液漂洗3次；

4）將所得軟骨薄片置于PBS溶液浸泡12h，然后室溫下在質(zhì)量濃度為3％的曲拉通溶液中振蕩萃取30h，振蕩速率為120轉(zhuǎn)/分鐘，用PBS溶液漂洗3次；

5）將所得軟骨薄片在PBS溶液中浸泡12h，然后冷凍干燥，低溫研磨，選粒度為20微米至200微米的基質(zhì)微粒，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑，包括質(zhì)量體積比為1:4的組分a和組分b，組分a為上述所得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒，組分b為20g/L硫酸軟骨素。

制備過(guò)程：將組分a和組分b用醫(yī)用三通混勻，得軟骨微粒懸液，軟骨微粒懸液經(jīng)無(wú)菌真空灌裝，再經(jīng)20kGy伽馬射線輻照滅菌，最后使用時(shí)再用醫(yī)用三通混勻，即制得可臨床使用的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑。

實(shí)施例5

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的制備方法，包括以下步驟：

1）取羊的軟骨，在PBS溶液中漂洗3次，用體積濃度為75%的乙醇水溶液對(duì)軟骨進(jìn)行消毒處理30分鐘，在PBS溶液中漂洗3次，然后將軟骨置于-80℃冰箱中冷凍2h，在37℃下解凍0.5h，如此反復(fù)凍融3次；

2）將所得軟骨切成薄片，厚度不大于2mm，軟骨薄片在1mM氯化鉀溶液中浸泡3h；

3）將所得軟骨薄片置于含0.5M EDTA的0.001M氫氧化鈉水溶液中浸泡18h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次；然后將軟骨薄片置于含0.1M HCl的0.1M氯化鈉水溶液中浸泡10h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：50，用PBS溶液漂洗3次；接著將軟骨薄片置于含0.5M EDTA的0.001M氫氧化鈉溶液中浸泡18h，軟骨薄片與溶液的體積比為1:100，用PBS溶液漂洗3次，再將軟骨薄片置于含0.1M HCl的0.1M氯化鈉溶液中浸泡5h，軟骨薄片與溶液的體積比為1：60，用PBS溶液漂洗3次；

4）將所得軟骨薄片置于PBS溶液浸泡12h，然后室溫下在質(zhì)量濃度為4％的曲拉通溶液中振蕩萃取20h，振蕩速率為120轉(zhuǎn)/分鐘，用PBS溶液漂洗3次；

5）將所得軟骨薄片在PBS溶液中浸泡12h，然后冷凍干燥，低溫研磨，選粒度為20微米至200微米的基質(zhì)微粒，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑，包括質(zhì)量體積比為1:10的組分a和組分b，組分a為上述所得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒，組分b為10g/L海藻酸鈉溶液、利多卡因，其中，利多卡因在植入劑中的終濃度為0.1g/L。

制備過(guò)程：將組分a和組分b用醫(yī)用三通混勻，得軟骨微粒懸液，軟骨微粒懸液經(jīng)無(wú)菌真空灌裝，再經(jīng)20kGy伽馬射線輻照滅菌，最后使用時(shí)再用醫(yī)用三通混勻，即制得可臨床使用的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑。

對(duì)比例1

可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的制備方法，包括以下步驟：

1）步驟同實(shí)施例3步驟1）；

2）步驟同實(shí)施例3步驟2）；

3）將所得軟骨薄片置于0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA中37℃恒溫振蕩消化12h,軟骨薄片與溶液的體積比為1:10；用PBS溶液中漂洗3次；

4）將所得軟骨薄片在PBS溶液浸泡12h，然后冷凍干燥，低溫研磨，選粒度為20微米至200微米的基質(zhì)微粒，得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒。

可注射的脫細(xì)胞軟骨植入劑，包括質(zhì)量體積比為1:5的組分a和組分b，組分a為上述所得可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒，組分b為生理鹽水。制備過(guò)程同實(shí)施例3。

含量測(cè)定：

（1）樣品稀釋

稀釋液的配制：由20× TE Buffer以DEPC水稀釋20倍配制而成。

樣品由稀釋液稀釋，回收率實(shí)驗(yàn)DNA純化樣品和待檢品DNA純化樣品稀釋倍數(shù)均稀釋20倍，測(cè)定熒光強(qiáng)度值。

（2）DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線組樣品

由10μg/ml的DNA標(biāo)準(zhǔn)品配制1μg/ml的DNA,再由配制的1μg/ml的DNA經(jīng)TE稀釋液配成0ng/ml、2.5ng/ml、 5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將稀釋好的DNA標(biāo)準(zhǔn)品100μl加入96孔黑色酶標(biāo)板內(nèi)，每份樣品2個(gè)復(fù)孔。

取回收率實(shí)驗(yàn)DNA純化樣品和待檢品DNA純化樣品各100μl，加入到96孔黑色酶標(biāo)板內(nèi)。

將10mlTE稀釋液加入50μl熒光染料，混勻。每孔100μl加入酶標(biāo)板中，震蕩混勻后室溫避光反應(yīng)5min，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定。測(cè)定條件：以485nm為激發(fā)光波長(zhǎng)，以535nm為發(fā)射熒光檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，所得數(shù)據(jù)作圖分析并求得回歸方程。以1×TE緩沖液測(cè)得的熒光強(qiáng)度為本底，測(cè)定和記錄各測(cè)定孔的熒光值。

DNA含量計(jì)算：

（1）先求標(biāo)準(zhǔn)品OD平均值，并減去標(biāo)準(zhǔn)曲線空白平均值（只有TE，無(wú)DNA）；再求出回收率樣品以及待測(cè)樣品的OD平均值，并減去回收率曲線的空白平均值。

（2）然后利用標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定值（OD值）為橫坐標(biāo)（x）,標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）為縱坐標(biāo)（y），制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程；

（3）將各回收率樣品及待測(cè)樣品所測(cè)得平均讀數(shù)扣回收空白讀數(shù)的OD值代入回歸方程的（x），求得（y），即為DNA濃度的實(shí)測(cè)值（ng/ml）；

（4）將此實(shí)測(cè)值（ng/ml）×測(cè)試時(shí)的稀釋倍數(shù)×回收溶液體積×（消化液總體積/抽提液體積），獲得實(shí)測(cè)(回收)DNA總量（ng）；

（5）用回收的DNA總量對(duì)原始投入的DNA總量作回歸曲線，以實(shí)測(cè)回收的總量為橫坐標(biāo)（x），原始投入的DNA總量為縱坐標(biāo)（y）；

（6）將待測(cè)樣品實(shí)驗(yàn)回收的DNA總量（ng）代入回收率曲線方程的（x），求得樣品的原始DNA總量（y）；

（7）最后用樣品的原始DNA總量除以樣品干重量，即可得到被測(cè)樣品單位重量（mg）的DNA含量。

實(shí)施例1~3及對(duì)比例1的可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒經(jīng)DNA含量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表可得，本發(fā)明制備的生物基質(zhì)材料的料殘留的DNA量小，間接的說(shuō)明了本發(fā)明方法脫細(xì)胞徹底，對(duì)照組的殘留的DNA量較大；而生物源性材料殘留的DNA本身可以引起人體的免疫反應(yīng)，可見(jiàn)材料殘留的DNA越低引起人體的免疫反應(yīng)的可能性越小。

實(shí)施例1的可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微粒的掃描電子顯微鏡圖見(jiàn)圖1～3，可見(jiàn)表面和截面形貌。由圖可得，軟骨微粒呈較疏松的纖維形態(tài)，顯示軟骨微粒仍保留了一定的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)良好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

將實(shí)施例1制備得到的可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑，與人成纖維細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，將2ml可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑加入到0.5ml人成纖維細(xì)胞懸液（密度：10×10⁷個(gè)/mL）中，37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)3天后，經(jīng)DAPI染色后在普通光學(xué)顯微鏡下的觀察（×10）。觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。圖中可見(jiàn)，成纖維細(xì)胞與軟骨微粒植入劑貼附良好，且成纖維細(xì)胞能正常增殖生長(zhǎng)，結(jié)果表明本發(fā)明制備的軟骨微粒植入劑具有良好的細(xì)胞相容性。

取20只雄性SD大鼠，分兩組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各10只；將實(shí)施例3制備的可注射的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)植入劑0.5ml經(jīng)背部左邊注射作為實(shí)驗(yàn)組，將實(shí)施例4制備的軟骨基質(zhì)植入劑0.5ml經(jīng)背部右邊注射作為對(duì)照組，植入劑植入到大鼠皮下后，于不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取植入部位的皮下組織，經(jīng)HE染色后，進(jìn)行組織學(xué)切片效果觀察。圖5和圖7分別是實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組植入大鼠皮下兩周后的組織切片圖，圖6和圖8分別是實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組植入大鼠皮下四周后的組織切片圖。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組微粒注射移植后從外周向中央細(xì)胞化及血管化，有極少量的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，無(wú)異物反應(yīng)；對(duì)照組在材料植入兩周后，材料周圍炎性細(xì)胞較多，未出現(xiàn)中央細(xì)胞化及血管化跡象，對(duì)照組在材料植入四周后，材料周圍炎性細(xì)胞依然較多，且形成了一層纖維細(xì)胞包膜將植入材料與周圍組織隔絕；綜上所述本發(fā)明制備的軟骨微粒植入劑具有良好的組織相容性、良好的長(zhǎng)期填充效果。