技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬領(lǐng)域是用于免疫目的的自我復(fù)制RNA的非病毒遞送。
背景技術(shù)：
：通過遞送核酸對動物實現(xiàn)免疫是多年來的目標。曾經(jīng)試驗了各種途徑，包括應(yīng)用DNA或RNA、病毒或非病毒遞送載體(或者甚至不用遞送載體的“裸”疫苗)、復(fù)制型或非復(fù)制型載體，或者是病毒或非病毒載體?，F(xiàn)對于進一步且改進的核酸疫苗仍存在需求，特別是核酸疫苗的改良遞送方式。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，核酸免疫是通過將自我復(fù)制型RNA包封于和/或吸附于一種小顆粒進行傳輸來實現(xiàn)的。所述RNA編碼感興趣的免疫原，所述顆粒則模擬天然病毒的傳輸功能來遞送該RNA。因而本發(fā)明提供了在體內(nèi)向脊椎動物細胞遞送RNA的非病毒顆粒，其中的顆粒由遞送材料包裹著編碼免疫原的自我復(fù)制RNA分子構(gòu)成。本發(fā)明還提供在體內(nèi)向脊椎動物細胞遞送RNA的非病毒顆粒，其中的顆粒由遞送材料上吸附有編碼免疫原的自我復(fù)制RNA分子組成。這些顆粒在針對各種疾病對動物個體實施免疫的藥物組合物中是有用的組成部分。結(jié)合運用一種非病毒顆粒來遞送自我復(fù)制型RNA，提供了在僅遞送少量RNA的情況下就能誘導出針對免疫原的強效和特異性的免疫應(yīng)答的一種方法。此外，這些顆粒容易實現(xiàn)商業(yè)規(guī)模的制造。顆粒本發(fā)明中的顆粒是非病毒顆粒，即它們不是病毒。因而顆粒不含有衣殼蛋白。因規(guī)避了制備衣殼顆粒的需要，本發(fā)明無需細胞包裝流程，故使得商業(yè)化生產(chǎn)放大變得容易，且最大程度減少了不經(jīng)意間產(chǎn)生危險的感染性病毒的風險。本發(fā)明的顆粒由遞送材料構(gòu)成，而不是將RNA包裹在病毒粒子中。多種材料適合于生產(chǎn)可在體內(nèi)向脊椎動物細胞遞送RNA的顆粒。特別令人感興趣的兩種遞送材料是：(i)可形成脂質(zhì)體的兩親性脂肪，以及(ii)可形成微粒的無毒且可生物降解的高分子聚合物。通過脂質(zhì)體傳輸時，必須將RNA包裹于其中；如通過多聚物微粒傳輸，RNA可以是包封或吸附的形式。第三種感興趣的遞送材料是多聚物、交聯(lián)劑、RNA以及帶電荷的單體的微粒反應(yīng)產(chǎn)物。本發(fā)明一個實施方式中的顆粒包含了包封編碼免疫原的自我復(fù)制RNA分子的脂質(zhì)體，另一個實施方式中包含了包封編碼免疫原的自我復(fù)制RNA分子的多聚物微粒，還有一個實施方式中包含了吸附編碼免疫原的自我復(fù)制RNA分子的多聚物微粒。在所有三種情況下顆粒都基本上以球形為宜。第四個實施方式中本發(fā)明的顆粒包含了多聚物、交聯(lián)劑、編碼免疫原的自我復(fù)制RNA分子以及帶電荷的單體的微粒反應(yīng)產(chǎn)物。這些顆粒在模具中成型因而可制作成任何形狀，其中包括但不僅限于球形。RNA可以被包封在顆粒中(尤其是當顆粒是脂質(zhì)體時)。這意味著顆粒內(nèi)的RNA(如同在天然病毒內(nèi)的那樣)被遞送材料隔離于外界基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)包封體可以保護RNA免于RNA酶降解?？梢圆扇「鞣N形式進行包封。例如在某些實施方式中(如像在單層脂質(zhì)體中)遞送材料圍繞含有RNA的水性內(nèi)核外形成外層，在另一些實施方式中(如模具成型顆粒)遞送材料形成內(nèi)含RNA的基質(zhì)。所述顆?？砂ㄒ恍┩庠诘腞NA(例如，在顆粒外表面)，但至少一半的RNA(最理想是全部)被包封在內(nèi)部。包封于脂質(zhì)體內(nèi)部明顯區(qū)別于參考資料1中披露的脂質(zhì)/RNA復(fù)合物。RNA可以吸附于顆粒上(尤其是當顆粒是一種多聚物微粒時)。這意味著遞送材料未將RNA與外界基質(zhì)相隔離，不像病毒中的RNA基因組那樣。顆粒可以包括一些被包封的RNA(如，包封在顆粒核心內(nèi))，但至少一半的RNA(最理想是全部)被吸附。脂質(zhì)體各種兩親性脂肪可在水性環(huán)境內(nèi)形成雙層以包裹含有RNA的水性內(nèi)核，成為脂質(zhì)體。這些脂肪可具有陰性的、陽性的或兩性離子的疏水性末端基團。由陰性磷脂生成脂質(zhì)體可追朔到十九世紀六十年代，生成陽性脂質(zhì)體的脂類則自從十九世紀九十年代一直在研究。一些磷脂是陰離子的，其他有兩性的，還有陽離子的。適合的磷脂類型包括，但不僅限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油，一些有用的磷脂類列于表1。有用的陽性脂類包括，但不僅限于：二油酰氧基三甲胺丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亞油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。兩性離子脂質(zhì)類包括，但不僅限于：兩性脂肪酰和兩性脂肪醚。有用的兩性脂類的例子有DPPC、DOPC和十二基磷基膽堿。脂質(zhì)類可以是飽和的或不飽和的。以運用至少一種不飽和脂制備脂質(zhì)體為宜。如果一種不飽和脂有兩個尾部，可以是兩端均為不飽和，或是一個飽和另一個不飽和。本發(fā)明的脂質(zhì)體顆?？捎蓡蝹€的脂或混合的脂生成?；旌现珊?i)陰離子脂質(zhì)的混合物，(ii)陽離子脂質(zhì)混合物，(iii)兩性離子脂質(zhì)混合物，(iv)陰離子脂質(zhì)與陽離子脂質(zhì)的混合物，(v)陰離子脂質(zhì)與兩性離子脂質(zhì)的混合物，(vi)兩性離子脂質(zhì)與陽離子脂質(zhì)的混合物，或(vii)陰離子脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、兩性離子脂質(zhì)的混合物。類似地，一種混合物可同時含有飽和與非飽和脂。例如，混合物含有DSPC(兩性離子，飽和)、DlinDMA(陽離子,不飽和)、和/或DMG(陰離子，飽和)。當采用混合脂時，并非所有脂質(zhì)成分都需要是兩親性的，如：一種或多種兩親性脂可與膽固醇混合。脂質(zhì)的疏水部分可PEG化(即：通過與聚乙二醇共價結(jié)合進行修飾)。這種修飾可增加穩(wěn)定性并防止脂質(zhì)體的非特異性吸附。例如，可運用參考文獻2和3中所披露的技術(shù)將脂質(zhì)與PEG結(jié)合?？捎酶鞣N長度的PEG，如0.5-8kDa。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和膽固醇的混合物用于實施例。脂質(zhì)體顆粒通常被分為三組：多層脂質(zhì)體(MLV)、小單層脂質(zhì)體(SUV)，以及大單層脂質(zhì)體(LUV)。MLV的每個囊泡中有多個雙層，形成多個獨立的水性腔體。SUV和LUV具有包封水性內(nèi)核的單個雙層；SUV的典型直徑是≤50nm，LUV直徑>50nm。本發(fā)明脂質(zhì)體顆粒的LUV理想直徑在50-220nm范圍。含有許多不同直徑的LUV的組合物是：(i)至少80％數(shù)量的直徑在20-220nm，(ii)群體的理想平均直徑(Zav，按強度計)在40-200nm，和/或(iii)直徑的多分散指數(shù)<0.2。參考資料1的脂質(zhì)體/RNA復(fù)合體的直徑可望在600-800nm，呈高分散性。制備合適的脂質(zhì)體的技術(shù)為本領(lǐng)域所共知，如參見參考資料4-6。資料7描述了一種有用的方法，涉及到將以下要素混合：(i)脂質(zhì)的乙醇溶液(ii)核酸的水溶液(iii)緩沖液，然后混勻、平衡、稀釋和純化。本發(fā)明中偏好的脂質(zhì)體是通過此混合過程得到的。多聚微粒根據(jù)本發(fā)明各種高分子聚合物可形成微粒來包裹或吸附RNA。運用基本無毒的多聚物意味著受體可安全地接受其顆粒；運用可生物降解的多聚物意味著顆粒在完成遞送后可以被代謝，避免長期滯留。有用的多聚物還要是可滅菌的，以便制成藥用級配方。合適的無毒和可生物降解多聚物包括，但不僅限于：聚(α-羥基酸)、聚羥基丁酸、聚內(nèi)酯(包括聚己內(nèi)酯)、聚二氧環(huán)己酮、聚戊內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸衍生的聚碳酸酯，或聚酯酰胺，以及它們的組合。在一些實施方式中，微粒由以下形成：聚(α-羥基酸)如聚乳酸(“PLA”)、乳酸與羥基乙酸共聚物如聚(D,L-乳酸-共-羥基乙酸)共聚物(“PLG”)、以及D,L-乳酸與聚己內(nèi)酯的共聚物。有用的PLG多聚物包括那些乳酸/羥基乙酸摩爾比在以下范圍的，如從20:80到80:20，如25:75、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、75:25。有用的PLG多聚物包括那些分子量在以下范圍的，如5,000-200,000Da，如10,000-100,000、20,000-70,000、30,000-40,000、40,000-50,000Da。微粒的理想直徑在0.02μm到8μm范圍。含有許多不同直徑的微粒的組合中，至少80％數(shù)量的直徑在0.03-7μm范圍。制備合適的微粒的技術(shù)為本領(lǐng)域所共知，如參見參考資料6、8(特別是第7章)和9。為便于RNA吸附，微粒可含有一種陽離子的表面活性劑和/或脂，如參考資料10和11中所披露。本發(fā)明微粒的ζ電位可在40-100mV。微粒優(yōu)于脂質(zhì)體的一個方面是它們很容易進行凍干以穩(wěn)定保存。模制顆粒第三種感興趣的遞送材料是多聚物、交聯(lián)劑、編碼免疫原的自我復(fù)制型RNA以及帶電荷的單體的微粒反應(yīng)產(chǎn)物。這四種成分可混合成液體，置于模具中(如含有全氟聚醚)，然后固化，根據(jù)模具形狀和尺寸形成顆粒。合適的生產(chǎn)方法在參考資料12中有詳述。這些方法提供可生物降解的交聯(lián)寡聚高聚合納米粒子。顆粒理想的最大直徑跨度是≤5μm。它們可能總體帶正電荷。合適的多聚物包括，但不僅限于：聚(丙烯酸)、聚(磺化苯乙烯)、羧甲基纖維素(CMC)、聚(乙烯醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(乙烯吡咯烷酮)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯/乙烯醇共聚物。偏好的多聚物是聚(乙烯吡咯烷酮)。生成顆粒的多聚物量可以是2-75wt％，例如10-60wt％、20-60wt％。適合的交聯(lián)劑可包括二硫化物和/或縮酮。例如，交聯(lián)劑可包括：聚(ε-己內(nèi)酯)-b-四甘醇-b-聚(ε-己內(nèi)酯)二甲基丙烯酸酯、聚(ε-己內(nèi)酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(ε-己內(nèi)酯)二甲基丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-四甘醇-b-聚(乳酸)二甲基丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)二甲基丙烯酸酯、聚(乙醇酸)-b-四甘醇-b-聚(乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、聚(乙醇酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、聚(ε-己內(nèi)酯)-b-四甘醇-b-聚(ε-己內(nèi)酯)二丙烯酸酯、聚(ε-己內(nèi)酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(ε-己內(nèi)酯)二丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-四甘醇-b-聚(乳酸)二丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)二丙烯酸酯、聚(乙醇酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乙醇酸)二丙烯酸酯、硅烷、含硅的甲基丙烯酸酯，或二甲基二(甲基丙烯酰氧基-l-乙氧基)硅烷。生成顆粒的交聯(lián)劑量可以是10-25wt％，例如10-60wt％、20-60wt％。帶電荷的單體可以是陽離子型的或陰離子型的。這些包括，但不僅限于：[2-(丙烯酰氧)乙基]三甲基氯化銨(AETMAC)和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽(AEM-HCl)。生成顆粒的帶電荷單體量可以是2-75wt％。生成顆粒的RNA量可以是0.25-20wt％。在模具內(nèi)預(yù)固化混合物可含有引發(fā)劑。例如，模具內(nèi)可含有≤1wt％的引發(fā)劑、≤0.5wt％的引發(fā)劑、或者<0.1wt％的引發(fā)劑。有用的引發(fā)劑范圍是0.1-0.5％。諸如DEAP和DPT之類的光引發(fā)劑運用于紫外固化中是有用的。本發(fā)明可使用表1中或參考資料12中實施例1-15中所列的任何材料，除了其中的siRNA成分被本文的自我復(fù)制型RNA取代。RNA本發(fā)明的顆粒包括編碼免疫原的(不像siRNA的)自我復(fù)制型RNA分子。該顆粒在體內(nèi)給藥后，RNA被從顆粒中釋放出來并在細胞內(nèi)翻譯，從而在原位提供免疫原。和參考資料13不同，本發(fā)明顆粒里的RNA是自我復(fù)制型的。自我復(fù)制型的RNA分子(復(fù)制子)在被遞送到脊椎動物細胞時即使沒有任何蛋白存在，也可以通過自身轉(zhuǎn)錄來生成多重的后代RNA(通過其自身產(chǎn)生的反義拷貝)。自身復(fù)制型RNA分子是典型的正鏈分子，它可以在被送達細胞后直接翻譯，這種翻譯提供了RNA-依賴型RNA聚合酶，繼而生成該遞送RNA的反義和正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。于是被遞送的RNA引起多重后代RNA產(chǎn)生。這些后代RNA，還有共線亞基因組轉(zhuǎn)錄子，可將其自身進行翻譯而提供所編碼免疫原的原位表達，或者可被轉(zhuǎn)錄以提供所遞送RNA同一鏈的其他轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄本，其可被翻譯以提供所述免疫原的原位表達。這種順序的轉(zhuǎn)錄過程的最終結(jié)果是引入的RNA復(fù)制子數(shù)量的巨量增加，從而使編碼的免疫原成為細胞中主要的多肽產(chǎn)物。實現(xiàn)這種方式自我復(fù)制的合適系統(tǒng)是采用基于α病毒的復(fù)制子。這些復(fù)制子是正鏈RNA，可在送達細胞后導致復(fù)制酶(或復(fù)制酶－轉(zhuǎn)錄酶)的翻譯。復(fù)制酶被翻譯為多聚蛋白，繼而自身裂解產(chǎn)生復(fù)制復(fù)合體，生成被遞送RNA正鏈的基因組負鏈拷貝。這些負鏈轉(zhuǎn)錄子可進行自身轉(zhuǎn)錄來提供母本正鏈RNA的更多拷貝，也可以提供編碼免疫原的亞基因組轉(zhuǎn)錄子。亞基因組轉(zhuǎn)錄子的翻譯帶來了感染細胞中免疫原的原位表達。合適的α病毒屬復(fù)制子可采用來自辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、東方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)等的復(fù)制酶?？捎猛蛔冃突蛞吧筒《局?，如，復(fù)制子使用了VEEV的減毒突變株TC83[14]。偏好的自我復(fù)制型RNA分子可以編碼(i)RNA-依賴型RNA聚合酶，它可以從自身復(fù)制型RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA，以及(ii)免疫原。聚合酶可以是α病毒復(fù)制酶，如含有或多種α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。然而天然α病毒基因組在編碼非結(jié)構(gòu)復(fù)制酶多聚蛋白以外，還編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，希望本發(fā)明的自我復(fù)制型RNA分子最好不編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。這樣較好的自我復(fù)制型RNA可在細胞里生成其自身的基因組RNA拷貝，但不會生成含有RNA的病毒體。沒有生成這些病毒體的能力意味著，不像野生型α病毒那樣，自我復(fù)制型RNA分子不能使自己傳承感染性。本發(fā)明的自我復(fù)制型RNA中，不存在野生型病毒傳承所必須的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，它們被編碼感興趣的免疫原的基因所取代，如此，亞基因組轉(zhuǎn)錄子就編碼了免疫原，而不是α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此對本發(fā)明有用的自我復(fù)制型RNA分子可具有兩個開放閱讀框。第一個(5')開放閱讀框編碼復(fù)制酶；第二個(3')開放閱讀框編碼免疫原。在一些實施方式中RNA可具有額外的(如下游)開放閱讀框，如用以編碼其他免疫原(見下面)，或編碼輔助多肽。較好的自我復(fù)制型RNA分子具有5'端帽子(如，7-甲基鳥苷)。這個帽子可加強體內(nèi)的RNA翻譯。在一些實施方式中，自我復(fù)制型RNA分子的5'端序列必須經(jīng)過選擇以保證與所編碼的復(fù)制酶相容。自我復(fù)制型RNA分子可具有3'poly-A尾端。它也可以在其3'末端附近包含poly-A聚合酶識別序列(如AAUAAA)。自我復(fù)制型RNA分子可具有各種長度，但它們典型的長度是5000-25000個核苷酸，如8000-15000個核苷酸，或9000-12000個核苷酸。因而RNA比siRNA遞送中所見的要長。自我復(fù)制型RNA分子通常為單鏈。單鏈RNA通?？赏ㄟ^與TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR結(jié)合而發(fā)生佐劑效應(yīng)。以雙鏈形式(dsRNA)遞送的RNA能結(jié)合TLR3，這個受體也可被在單鏈RNA復(fù)制過程中形成的、或在單鏈RNA二級結(jié)構(gòu)內(nèi)形成的dsRNA所觸發(fā)。自我復(fù)制型RNA可以很方便地通過體外轉(zhuǎn)錄(IVT)來制備。IVT可運用(cDNA)模板，它是以細菌內(nèi)質(zhì)粒的形式構(gòu)建和擴增的，或者是用合成方法創(chuàng)建的(如通過基因合成和/或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)工程的手段)。例如，DNA-依賴型RNA聚合酶(如噬菌體T7、T3或SP6RNA聚合酶)可以用來從DNA模板轉(zhuǎn)錄自我復(fù)制型RNA。可以按需采用適當?shù)募用焙图觩oly-A反應(yīng)(盡管復(fù)制子的poly-A通常在DNA模板內(nèi)編碼)。這些RNA聚合酶對轉(zhuǎn)錄的5'端核苷酸有著嚴格的要求，在一些實施方式中這些要求必須與所編碼的復(fù)制酶的要求相匹配，以保證IVT轉(zhuǎn)錄的RNA可作為其自身編碼的復(fù)制酶的底物有效發(fā)揮作用。如同參考資料15中所討論，自我復(fù)制型RNA可包括(除5'端帽子結(jié)構(gòu)以外)帶有修飾的核酸堿基的一個或多個核苷酸。因而RNA可含有m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫尿核苷)、Um(2'-O-甲基尿苷)、m1A(l-甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)；Am(2'-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-異戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷)、io6A(N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)、g6A(N6-苷氨酰氨甲酰腺苷)、t6A(N6-蘇氨酰氨甲酰腺苷)、ms2t6A(2-甲硫基-N6-蘇氨酰氨甲酰腺苷)、m6t6A(N6-甲基-N6-蘇氨酰氨甲酰腺苷)、hn6A(N6-羥基纈氨酰氨甲酰腺苷)、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羥基纈氨酰氨甲酰腺苷)、Ar(p)(2'-O-核糖腺苷(磷酸酯))、I(肌苷)、m11(1-甲基肌苷)、m'Im(1,2'-O-二甲基肌苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-O-甲基胞苷)、s2C(2-硫代胞苷)、ac4C(N4-乙酰胞苷)、f5C(5-甲酰基胞苷)、m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)、ac4Cm(N4乙酰2TO甲基胞苷)、k2C(賴西丁)、m1G(1-甲基鳥苷)、m2G(N2-甲基鳥苷)、m7G(7-甲基鳥苷)、Gm(2'-O-甲基鳥苷)、m22G(N2,N2-二甲基鳥苷)、m2Gm(N2,2'-O-二甲基鳥苷)、m22Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鳥苷)、Gr(p)(2'-O-核糖鳥苷(磷酸酯))、yW(懷丁苷)、o2yW(過氧懷丁苷)、OHyW(羥基懷丁苷)、OHyW*(未修飾的羥基懷丁苷)、imG(丫苷)、mimG(甲基鳥苷)、Q(q核苷)、oQ(環(huán)氧q核苷)、galQ(半乳糖基q核苷)、manQ(甘露糖基q核苷)、preQo(7-氰基-7-去氮鳥苷)、preQi(7-氨基甲基-7-去氮鳥苷)、G(古嘌苷)、D(二氫尿苷)、m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)、s4U(4-硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)、s2Um(2-硫-2'-O-甲基尿苷)、acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)、ho5U(5-羥基尿苷)、mo5U(5-甲基尿苷)、cmo5U(尿苷5-氧乙酸)、mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)、chm5U(5-(羧羥甲基)尿苷))、mchm5U(5-羧羥甲基)尿苷甲酯)、mcm5U(5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um(S-甲氧羰基甲基-2-O-甲基尿苷)、mcm5s2U(5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷)、nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)、mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷)、ncm5U(5-氨甲酰甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨甲酰甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2-L-O甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)、m62A(N6,N6-二甲基腺苷)、Tm(2'-O-甲基肌苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)、hm5C(5-羥甲基胞苷)、m3U(3-甲基尿苷)、cm5U(5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6,T-O-二甲基腺苷)、rn62Am(N6,N6,O-2-三甲基腺苷)、m2'7G(N2,7-二甲基鳥苷)、m2'2'7G(N2,N2,7-三甲基鳥苷)、m3Um(3,2T-O-二甲基尿苷)、m5D(5-甲基二氫尿苷)、f5Cm(5-甲酰-2'-O-甲基胞苷)、m1Gm(1,2'-O-二甲基鳥苷)、m'Am(1,2-O-二甲基腺苷)丙因甲基尿苷(irinomethyluridine))、tm5s2U(S-氨基乙磺酸甲基(taurinomethyl)-2-硫代尿苷))、imG-14(4-去甲鳥苷)、imG2(異鳥苷)、或ac6A(N6-乙酰腺苷)、次黃嘌呤、肌苷、8-氧-腺嘌呤,其7位取代衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤、7-去氮-7-取代鳥嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-去氮-8-取代鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、8-氧鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮嘌呤、取代的7-去氮嘌呤、7-去氮-7-取代嘌呤、7-去氮-8-取代嘌呤、或者脫堿基核苷酸。例如，自我復(fù)制型RNA可包括一個或多個修飾的嘧啶核酸堿基，如假尿嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶殘基。但在一些實施方式中，RNA包括了未修飾的核酸堿基，以及可能包括未修飾的核苷酸，即，所有RNA中的核苷酸是標準的A、C、G和U核苷酸(除了任何5'端帽子結(jié)構(gòu)中可能含有7'-甲基鳥苷)。另一些實施方式中，RNA可包括由7'-甲基鳥苷組成的5'端帽子，而且第1、第2或第3個5'端核苷酸可能在核糖2'位被甲基化。本發(fā)明所用的理想的RNA在核苷酸直接只含有磷酸二酯鍵連接，但在一些實施方式中它可包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、和/或甲基磷酸酯的連接。每個顆粒的RNA量是可變的，每個顆粒中單個自我復(fù)制型RNA分子的數(shù)量可取決于所用顆粒的性質(zhì)。通常，顆?？砂?-500個RNA分子。對于脂質(zhì)體而言，典型的RNA分子數(shù)量是每個脂質(zhì)體≤50個，如<20、<10、<5、或1-4個。對于多聚微粒，RNA分子的數(shù)量取決于顆粒直徑，但一般是≤50個(如<20、<10、<5、或1-4個)，或者每顆粒50-200個。理想狀態(tài)是，顆粒包含少于10種不同RNA，如5、4、3、或2種不同RNA；最佳的是顆粒包含單個種類的RNA，即：顆粒中所有RNA分子具有相同序列和相同長度。免疫原本發(fā)明所采用的自我復(fù)制型RNA分子編碼多肽免疫原。在顆粒給藥后免疫原在受體體內(nèi)被翻譯并誘導免疫應(yīng)答。免疫原可誘導針對細菌、病毒、真菌或寄生蟲(或者在一些實施方式中，針對過敏原，在另一些例子中針對腫瘤抗原)的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可包含抗體反應(yīng)(通常包括IgG)和/或細胞介導的免疫應(yīng)答。多肽免疫原誘導典型的免疫應(yīng)答，后者識別相應(yīng)的細菌、病毒、真菌或寄生蟲(或過敏原或腫瘤)多肽，但在一些實施方式中多肽可能作為模擬表位誘導免疫應(yīng)答，其識別的是細菌、病毒、真菌或寄生蟲的糖。典型的免疫原是表面多肽，如：粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、刺突糖蛋白，等等。自我復(fù)制型RNA分子可編碼單個種類的多肽免疫原或多個多肽。多重免疫原可以以單個多肽免疫原(融合多肽)的形式存在，或者是各自獨立的多肽。如果免疫原被作為獨立的多肽表達，它們當中的一個或多個可以由上游IRES或額外的病毒啟動元素來提供。另外，多重免疫原可以來自多聚蛋白的表達，這種多聚蛋白編碼與短的自裂解蛋白酶(如口蹄疫病毒2A蛋白)相融合的單個免疫原；或者作為內(nèi)含肽表達。與參考資料1和16中不同，RNA編碼免疫原。為避免疑惑，本發(fā)明不涉及編碼螢火蟲熒光素酶、或編碼大腸桿菌(E.coli)β-半乳糖苷酶融合蛋白、或編碼綠色熒光蛋白(GFP)的RNA。RNA也不是指小鼠胸腺總RNA。在一些實施方式中，免疫原誘導的免疫應(yīng)答針對下列細菌之一：腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)：有用的免疫原包括，但不僅限于：膜蛋白如粘附素、自轉(zhuǎn)運蛋白、毒素、獲鐵蛋白，以及H-因子結(jié)合蛋白。參考資料17中披露了三種有用多肽的組合。肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)：有用的多肽免疫原在參考資料18中有描述。這些包括，但不僅限于：RrgB菌毛亞基、β-N-乙酰-氨基己糖苷酶前體(spr0057)、spr0096、普通脅迫蛋白GSP-781(spr2021、SP2216)、絲氨酸/蘇氨酸激酶StkP(SP1732)，以及肺炎球菌表面粘附素PsaA。化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)：有用的免疫原包括，但不僅限于參考資料19和20中所描述的多肽?？ㄋ?Moraxellacatarrhalis)。百日咳桿菌(Bordetellapertussis)：有用的免疫原包括但不僅限于：百日咳毒素或類毒素(PT)、絲狀血凝素(FHA)、百日咳桿菌粘附素、凝集原2和3。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：有用的免疫原包括但不僅限于：參考資料21中所披露的多肽，如溶血素、esxA、esxB、鐵色素結(jié)合蛋白(sta006)，和/或sta011脂蛋白。破傷風梭菌(Clostridiumtetani)：典型的免疫原是破傷風類毒素。白喉桿菌(Cornynebacteriumdiphtheriae)：典型的免疫原是白喉類毒素。流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)：有用的免疫原包括但不僅限于參考資料22和23中所描述的多肽。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)：有用的免疫原包括但不僅限于參考資料19中所描述的多肽。沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)：有用的免疫原包括但不僅限于：PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH樣、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrA和MurG(如參考資料24中描述。LcrE[25]和HtrA[26]是兩個較為偏好的免疫原。肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)：有用的免疫原包括但不僅限于參考資料27中所描述的多肽。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)：有用的免疫原包括但不僅限于：CagA、VacA、NAP、和/或脲酶[28]。大腸桿菌(Escherichiacoli)：有用的免疫原包括但不僅限于：源自大腸桿菌腸毒素(ETEC)、腸凝集性大腸桿菌(EAggEC)、彌散粘附型大腸桿菌(DAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)、和/或腸出血性大腸桿菌(EHEC)的免疫原。ExPEC株包括尿路致病性大腸桿菌(UPEC)和腦膜炎/敗血癥相關(guān)大腸桿菌(MNEC)。誘導UPEC多肽免疫原在參考資料29和30中有描述。有用的MNEC免疫原在參考資料31中有描述。有用的針對多種大腸桿菌類型的免疫原是AcfD[32]。炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)鼠疫桿菌(Yersiniapestis)：有用的免疫原包括但不僅限于參考資料33和34中所描述的多肽。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis)產(chǎn)氣莢膜桿菌或肉毒梭菌(ClostridiumperfringensorClostridiumbotulinums)嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)布魯氏菌屬(Brucella)，如牛布魯氏菌(B.abortus)、犬布魯氏菌(B.canis)、羊布魯氏菌(B.melitensis)、沙林鼠布魯氏菌(B.neotomae)、綿羊布魯氏菌(B.ovis)、豬布魯氏菌(B.suis)、鰭種布魯氏菌(B.pinnipediae)。弗朗西斯菌屬(Francisella)，如新兇手弗氏菌(F.novicida)、蜃樓弗氏菌(F.philomiragia)、土拉弗氏菌(F.tularensis)。淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)梅毒螺旋體(Treponemapallidum)杜克雷嗜血桿菌(Haemophilusducreyi)糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)或屎腸球菌(Enterococcusfaecium)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)立克次體(Rickettsia)單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)霍亂弧菌(Vibriocholerae)傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)克雷伯菌屬(Klebsiella)一些實施方式中免疫原誘導針對以下這些病毒的免疫應(yīng)答：正粘病毒科(Orthomyxovirus)：有用的免疫原可來自A、B、C型流感病毒，如血凝素、神經(jīng)氨酸苷酶、或M2基質(zhì)蛋白。當免疫原是A型流感病毒血凝素是，它可以是來自任何亞型的，如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。副黏液病毒科(Paramyxoviridae)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自肺病毒(如呼吸道合胞病毒，RSV)、腮腺炎病毒(如腮腺炎病毒)、副黏液病毒(如副流感病毒)、偏肺病毒和麻疹病毒(如麻疹)。痘病毒科(Poxviridae)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自正粘病毒(Orthopoxvirus)如天花病毒(Variolavera)，其中包括但不僅限于大天花(Variolamajor)和小天花(Variolaminor)。細小核糖核酸病毒科(Picornavirus)：免疫原包括但不僅限于源自細小核糖核酸毒科的那些，如腸病毒屬、鼻病毒屬、肝病毒屬、心病毒屬和鵝口瘡病毒屬。在一個實施方式中，腸病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒，如1型、2型和/或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。另一實施方式中，腸病毒是EV71腸病毒。另一實施方式中，腸病毒是柯薩奇病毒A或B型。布尼亞病毒科(Bunyavirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自正布尼亞病毒屬如加利福尼亞腦炎病毒、白蛉熱病毒屬如裂谷熱病毒、或內(nèi)羅病毒屬如克里米亞-剛果出血熱病毒。嗜肝RNA病毒科(Heparnavirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自嗜肝RNA病毒屬如甲型肝炎病毒(HAV)。絲狀病毒科(Filovirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自絲狀病毒屬如埃博拉病毒(包括扎伊爾、象牙海岸、雷斯頓埃博拉病毒)或者馬爾堡病毒。披膜病毒科(Togavirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自披膜病毒如風疹病毒屬、α病毒屬或動脈炎病毒屬。其中包括風疹病毒。黃病毒(Flavivirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自黃病毒屬如蜱傳腦炎(TBE)病毒、登革熱(1、2、3、4型)病毒、黃熱病病毒、日本腦炎病毒、科薩努爾森林病毒、西尼羅河腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、俄羅斯春夏腦炎病毒、玻瓦桑腦炎病毒。瘟病毒(Pestivirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自瘟病毒如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬瘟(CSFV)或邊界病病毒(BDV)。嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自嗜肝DNA病毒如乙肝病毒。組合物可以包含乙肝表面抗原(HBsAg)。其他肝病毒：組合物可包含來自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。彈狀病毒(Rhabdovirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自彈狀病毒如狂犬病毒屬(如狂犬病病毒)和水泡病毒屬。杯狀病毒科(Caliciviridae)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自杯狀病毒科如諾瓦克病毒(諾如病毒)，以及諾瓦克樣病毒如夏威夷病毒和雪山病毒。冠狀病毒(Coronavirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自SARS冠狀病毒、禽類傳染性支氣管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)，以及豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)。冠狀病毒免疫原可以是刺突多肽。反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自腫瘤病毒、慢病毒(如HIV-1或HIV-2)，或者泡沫病毒。呼腸弧病毒(Reovirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自正呼腸弧病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病毒或Colti病毒。細小病毒(Parvovirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自細小病毒B19。皰疹病毒(Herpesvirus)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自人皰疹病毒，如，僅作舉例，單純皰疹病毒(HSV)(如1型和2型)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)、人類皰疹病毒6(HHV6)、人類皰疹病毒7(HHV7)和人類皰疹病毒8(HHV8).乳多泡病毒(Papovaviruses)：病毒免疫原包括但不僅限于：源自乳頭瘤病毒和多瘤病毒。(人類)乳頭瘤病毒的血清型可以是1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65型的，如6、11、16和/或18型其中的或多種。腺病毒(Adenovirus)：病毒免疫原包括但不僅限于源自腺病毒血清型36型(Ad-36)。在一些實施方式中，免疫原誘導針對感染魚的病毒的免疫應(yīng)答，如傳染性鮭魚貧血癥病毒(ISAV)、鮭魚胰腺病病毒(SPDV)、傳染性胰臟壞死病病毒(IPNV)、斑點叉尾鮰病毒(CCV)、魚淋巴囊腫病毒(FLDV)、傳染性造血組織壞死病病毒(IHNV)、錦鯉皰疹病毒、鮭魚小RNA病毒(也被稱為大西洋鮭小RNA病毒)、淡水鮭病毒(LSV)、大西洋鮭輪狀病毒(ASR)、鱒魚草莓病病毒(TSD)、銀鮭腫瘤病毒(CSTV)，或病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)。真菌抗原可衍生自皮膚真菌，包括絮狀表皮霉菌(Epidermophytonfloccusum)，奧杜安氏小孢子菌(Microsporumaudouini)，犬小孢子菌(Microsporumcanis)，扭曲小孢子菌(Microsporumdistortum)，馬小孢子菌(Microsporumequinum)，石膏樣小孢子菌(Microsporumgypsum)，矮小小孢子菌(Microsporumnanum)，同心性毛癬菌(Trichophytonconcentricum)，馬毛癬菌(Trichophytonequinum)，雞毛癬菌(Trichophytongallinae)，石膏樣毛癬菌(Trichophytongypseum)，麥格毛癬菌(Trichophytonmegnini)，須癬毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)，小鼠毛癬菌(Trichophytonquinckeanum)，紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)，許蘭毛癬菌(Trichophytonschoenleini)，斷發(fā)毛癬菌(Trichophytontonsurans)，疣狀毛癬菌(Trichophytonverrucosum)，疣狀毛癬菌(T.verrucosum)白色(album)變種、盤形(discoides)變種、赭色(ochraceum)變種，紫色毛癬菌(Trichophytonviolaceum)和/或蜜塊狀毛癬菌(Trichophytonfaviforme)；衍生自煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus)、聚多曲霉(Aspergillussydowi)、黃曲菌(Aspergillusflavatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、頭狀芽裂殖菌(Blastoschizomycescapitatus)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假絲酵母(Candidaenolase)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、克柔假絲酵母(Candidakrusei)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、類星形假絲酵母(Candidastellatoidea)、克魯斯假絲酵母(Candidakusei)、帕拉克斯假絲酵母(Candidaparakwsei)、葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)、偽熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)、季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatidis)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、棒地霉(Geotrichumclavatum)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、微孢子蟲(Microsporidia)、腦炎微孢子蟲屬(Encephalitozoonspp)、表層角結(jié)膜炎微孢子蟲(Septataintestinalis)和腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)；較不常見的短粒蟲屬(Brachiolaspp.)、微胞子蟲屬(Microsporidiumspp.)、微孢子蟲屬(Nosemaspp.)、皮里蟲屬(Pleistophoraspp)、氣管普孢蟲屬(Trachipleistophoraspp.)、條孢蟲屬(Vittaformaspp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystiscarinii)、苜蓿腐酶(Pythiumninsidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporumovale)、釀酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomycesboulardii)、粟酒酵母(Saccharomycespombe)、尖端賽多孢子菌(Scedosporiumapiosperum)、申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii)、白吉利絲孢酵母(Trichosporonbeigelii)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)、馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)、馬拉色菌屬(Malasseziaspp.)、著色真菌屬(Fonsecaeaspp.)、王氏霉菌屬(Wangiellaspp.)、孢子絲菌屬(Sporothrixspp.)、蛙糞霉屬(Basidiobolusspp.)、耳霉屬(Conidiobolusspp.)、根霉屬(Rhizopusspp.)、毛霉屬(Mucorspp.)、犁頭霉屬(Absidiaspp.)、被孢霉屬(Mortierellaspp.)、小克銀漢霉屬(Cunninghamellaspp.)、瓶霉屬(Saksenaeaspp.)、鏈格孢菌屬(Alternariaspp.)、彎孢菌屬(Curvulariaspp.)、長蠕孢菌屬(Helminthosporiumspp.)、鐮胞菌屬(Fusariumspp.)、曲霉屬(Aspergillusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、鏈核盤菌屬(Monoliniaspp.)、絲核菌屬(Rhizoctoniaspp.)、擬青霉屬(Paecilomycesspp.)、皮司霉屬(Pithomycesspp.)和枝孢霉屬(Cladosporiumspp.)。在一些實施方式中，免疫原誘導的免疫應(yīng)答是針對瘧原蟲(Plasmodium)屬的寄生蟲，如惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)或蛋形瘧原蟲(P.ovale)。因而本發(fā)明可被應(yīng)用于針對瘧疾的免疫。在一些實施方式中，免疫原誘導的免疫應(yīng)答是針對魚虱(Caligidae)科的寄生蟲，尤其是那些出自瘡痂魚虱屬(Lepeophtheirus)和魚虱屬(Caligus)的，比如像鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirussalmonis)或智利魚虱(Caligusrogercresseyi)魚虱之類的海虱。在一些實施方式中，免疫原誘導的免疫應(yīng)答針對：花粉過敏原(樹木、草本、雜草以及花粉過敏原)；昆蟲或蜘蛛類過敏原(吸入、唾液和毒液過敏原，如螨蟲過敏原、蟑螂和蠓過敏原、膜翅類毒液過敏原)；動物毛發(fā)和皮屑過敏原(如狗、貓、馬、大鼠、小鼠，等等)；還有食物過敏原(如麥角蛋白)。來自樹木、草坪和草本的重要的花粉過敏原是那些源自分類學上的殼斗目、木犀目、松杉目和懸鈴木科，包括但不僅限于：樺樹(樺木屬)、榿木(榿木屬)、榛木(榛屬)、角樹(鵝耳櫪屬)和橄欖樹(木犀欖屬)，雪松(柳杉屬和刺柏屬)、法國梧桐樹(懸鈴木)；禾本目草類包括黑麥草屬、梯牧草屬、早熟禾屬、狗牙根屬、鴨茅屬、絨毛草屬、虉草屬、黑麥屬和高粱屬；菊目和蕁麻目草本包括豚草屬、蒿屬和墻草屬。另一些重要的吸入性過敏原是來自塵螨屬和嗜霉螨屬的屋內(nèi)塵螨；倉儲螨如嗜鱗螨屬、甜食螨屬和食酪螨屬；來自蟑螂、蠓和跳蚤，如小蠊屬、大蠊屬、搖蚊屬和頭梳蚤屬，以及來自哺乳動物如貓、狗和馬；毒液過敏原包括如源于昆蟲叮咬的，如來自來分類學上膜翅目的包括蜜蜂(蜜蜂科(Apidae))、胡蜂(胡蜂科(Vespidea))和螞蟻(蟻科(Formicoidae))。在一些實施方式中，免疫原是選自以下的腫瘤抗原：(a)腫瘤-睪丸抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1，還有RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，例如，GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(與黑色素瘤、肺癌、頭頸部腫瘤、非小細胞癌(NSCLC)、乳腺癌、胃腸道腫瘤和膀胱癌相關(guān))；(b)突變的抗體，如p53(與各種實體瘤相關(guān)，如結(jié)腸直腸癌、肺癌和頭頸部腫瘤)、p21/Ras(與黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)腸直腸癌相關(guān))、CDK4(與黑色素瘤相關(guān))、MUM1(與黑色素瘤相關(guān))、caspase-8(與頭頸部腫瘤相關(guān))、CIA0205(與膀胱癌相關(guān))、HLA-A2-R1701、β-聯(lián)蛋白(β-catenin)(與黑色素瘤相關(guān))、TCR(與T-細胞非霍奇金淋巴瘤相關(guān))、BCR-abl(與慢性粒細胞白血病相關(guān))、磷酸甘油醛異構(gòu)酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT；(c)過表達抗原，如Galectin4(與結(jié)腸直腸癌相關(guān))、Galectin9(與霍奇金病相關(guān))、蛋白酶3(與慢性粒細胞白血病相關(guān))、WT1(與各種白血病相關(guān))、碳酸酐酶(與腎癌相關(guān))、醛縮酶A(與肺癌相關(guān))、PRAME(與黑色素瘤相關(guān))、HER-2/neu(與乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌相關(guān))、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白(與肝癌相關(guān))、KSA(與結(jié)腸直腸癌相關(guān))、胃泌素(與胰腺癌和胃癌相關(guān))、端粒酶催化蛋白、MUC-1(與乳腺癌和卵巢癌相關(guān))、G-250(與腎細胞癌相關(guān))、p53(與乳腺癌、結(jié)腸癌相關(guān))，以及癌胚抗原(與乳腺癌、肺癌和消化道癌如結(jié)腸直腸癌相關(guān))；(d)共享抗原，例如：黑素瘤-黑素細胞分化抗原，如MART-1/MelanA、gp100、MC1R、促黑激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/TRP1以及酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2/TRP2(與黑色素瘤相關(guān))；(e)前列腺相關(guān)抗原，如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，與前列腺癌相關(guān)；(f)免疫球蛋白個體基因型(與黑色素瘤和B細胞淋巴瘤相關(guān))。在某些實施方式中，腫瘤免疫原包括，但不僅限于：p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原包括E6和E7、乙型和丙型肝炎病毒抗原、人類嗜T淋巴細胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結(jié)合蛋白/親環(huán)蛋白(cyclophilin)C-相關(guān)蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS，等等。藥物組合物本發(fā)明的顆粒是作為藥物組合物的組成部分，用來針對各種疾病對個體實施免疫。這些組合物在所指顆粒以外還包括典型的藥學可接受的載體。參考資料35中對藥學可接受載體作了充分討論。本發(fā)明藥物組合物可包括一種或多種小分子免疫增強劑。例如，組合物可包括TLR2激動劑(如Pam3CSK4)、TLR4激動劑(如像E6020這樣的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯)、TLR7激動劑(如咪喹莫特)、TLR8激動劑(如雷西莫特)和/或TLR9激動劑(如IC31)。任何這類激動劑的理想分子量是<2000Da。當有RNA被包封時，在一些實施方式中這樣的激動劑也與RNA同樣被包封起來，但在另一些實施方式中它們未被包封起來。當RNA被吸附于顆粒時，在一些實施方式中這樣的激動劑也與RNA同樣被吸附，但在另一些實施方式中它們沒有被吸附。本發(fā)明的藥物組合物可將顆粒置于普通水(如注射用水)當中，或者是緩沖液當中，如磷酸緩沖液、Tris緩沖液、硼酸緩沖液、琥珀酸緩沖液、組氨酸緩沖液或檸檬酸緩沖液。緩沖鹽的典型濃度在5-20mM。本發(fā)明的藥物組合物的pH在5.0到9.5之間，在6.0到8.0之間。本發(fā)明的藥物組合物可包含鈉鹽(如氯化鈉)來賦予滲透壓。典型的NaCl濃度是10±2mg/ml，如約9mg/ml。本發(fā)明的藥物組合物可含有金屬離子螯合劑。它可以通過去除可使磷酸二酯鍵水解的離子，來延長RNA的穩(wěn)定性。因而組合物可含有以下的或多種：EDTA、EGTA、BAPTA、噴替酸，等等。這樣的螯合劑的典型含量是10-500μM，如0.1mM。檸檬酸鹽如檸檬酸鈉也可以作為螯合劑，它具有同時還可提供緩沖能力的優(yōu)勢。本發(fā)明的藥物組合物的滲透壓在200mOsm/kg到400mOsm/kg之間，如240-360mOsm/kg，或290-310mOsm/kg。本發(fā)明的藥物組合物可含有一種或多種防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。優(yōu)選無汞的組合物，可以制備無防腐劑的疫苗。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無菌。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無熱原，如每劑量含<1EU(標準的內(nèi)毒素單位)，優(yōu)選<0.1EU。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明的藥物組合物可制成單位劑量的形式。一些實施方式中，單位劑量的裝量在0.1-1.0ml，如約0.5ml。組合物可制成可注射的溶液或懸液。組合物可制成肺部給藥形式的，如利用精細噴霧的吸入器。組合物可制成鼻腔、耳道或眼部給藥形式，如噴劑或滴劑。典型的是肌內(nèi)注射給藥。組合物含有免疫學有效量的顆粒，以及任何其他需要的成分。“免疫學有效量”是指，給予個體的給藥量，不管是單次的還是作為系列中的一部分，對于治療或預(yù)防是有效的。這個量的變化取決于治療對象的健康和身體狀況、年齡、被治療個體的所屬物種(如，非人靈長類、靈長類，等等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所期望達到的保護程度、疫苗的配方、醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估，以及其他相關(guān)因素。希望這個量可以落在較寬的范圍內(nèi)，這個范圍可以通過常規(guī)試驗來確定。本發(fā)明組合物的顆粒和RNA含量籠統(tǒng)以每個劑量所含的RNA來表示。較佳劑量是≤100μgRNA(如10-100μg，比方10μg、25μg、50μg、75μg或100μg)，但所見標示值要低得多，如≤1μg/劑、≤100ng/劑、≤10ng/劑、≤1ng/劑，等等。本發(fā)明還提供了裝有本發(fā)明藥物組合物的遞送裝置(如注射器、霧化器、噴霧器、吸入器、皮貼等)。這種裝置可用來對脊椎動物個體進行組合物給藥。本發(fā)明的顆粒不包括核糖體。治療方法和醫(yī)療用途相對于參考資料16中披露的顆粒，本發(fā)明的顆粒和藥物組合物是用于在體內(nèi)針對感興趣的免疫原誘導免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供在脊椎動物體內(nèi)提升免疫應(yīng)答的方法，包含用有效量的本發(fā)明顆?；蛩幬锝M合物進行給藥的步驟。免疫應(yīng)答優(yōu)選保護性的，優(yōu)選涉及抗體和/或細胞介導的免疫。該方法可促進加強應(yīng)答。本發(fā)明還提供了顆?；蛩幬锝M合物應(yīng)用于引起脊椎動物免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明還提供本發(fā)明的顆粒在制造引起脊椎動物免疫應(yīng)答的藥物方面的應(yīng)用。通過這些應(yīng)用和方法引起脊椎動物免疫應(yīng)答，脊椎動物可以獲得針對各種疾病和/或感染的保護，如像以上所討論的針對細菌性和/或病毒性的疾病。顆粒和組合物是免疫原型的，更優(yōu)選疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明，疫苗可以是預(yù)防性的(即預(yù)防感染)或者是治療性的(即治療感染)，但主要是預(yù)防性的。脊椎動物以哺乳動物為好，如人類或大型哺乳類脊椎動物(如馬、牛、鹿、山羊、豬)。當疫苗用于預(yù)防目的時，人類主要指兒童(如，幼兒或嬰兒)或青少年；當疫苗用于治療目的時，人類主要是指青少年或成年人。供兒童使用的疫苗也可用于對成年人給藥，如用來評價安全性、劑量、免疫原性等。根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗可同時用來治療兒童和成年人。病人年齡可以是小于1歲，小于5歲，1-5歲，5-15歲，15-55歲，或55歲以上。接受疫苗病人的較適年齡段是年長者(如≥50歲，≥60歲，更好為≥65歲)、年幼者(如≤5歲)、住院病人、醫(yī)護工作者、武裝服務(wù)和軍隊人員、孕婦、慢性病患者，或免疫缺陷病人。但該疫苗并非只適用于這些群體，它可在更廣泛的人群中應(yīng)用。本發(fā)明的組合物通?？芍苯訉Σ∪私o藥。直接給藥可通過腸外注射(如皮下、腹腔、靜脈肌肉、皮內(nèi)，或是組織間隙；不同于參考資料1，本發(fā)明不采用舌內(nèi)注射的方式)。其他可選的給藥途徑包括直腸給藥、口服(如片劑、噴霧)給藥、口腔黏膜給藥、舌下給藥、陰道給藥、局部給藥、經(jīng)皮給藥、鼻腔給藥、眼部給藥、耳道給藥、肺部給藥，或其他黏膜給藥。皮內(nèi)或肌肉給藥是兩個較好的途徑。注射可通過針頭(如皮下注射針頭)，但也可選擇無針頭注射方式。典型的肌肉注射量是0.5ml。本發(fā)明可用于誘導系統(tǒng)免疫和/或黏膜免疫，優(yōu)選用于誘導增強的系統(tǒng)免疫和/或黏膜免疫。用藥劑量可以是一次性給藥方案或多次給藥方案。多次給藥可用于初級免疫方案和/或加強免疫方案。在多次給藥方案中可用相同或不同給藥途徑進行各次給藥，如初級接種用腸外給藥、加強接種用黏膜給藥，初級接種用黏膜給藥、加強接種用腸外給藥，等等。多次給藥方案中各次給藥一般隔開至少1周(如約2周，約3周，約4周，約6周，約8周，約10周，約12周，約16周，等等)。在一個實施方式中多次給藥可在出生后大約6周、10周和14周進行，即在6周齡、10周齡和14周齡的時候，如世界衛(wèi)生組織發(fā)布的“擴大免疫規(guī)劃”(EPI)中所采用。在另一實施方式中，兩個初級給藥之間相隔大約2個月，如間隔7、8或9個星期，然后是在第二次初級給藥后的6個月到1年之間進行一次或多次的加強接種，如在第二次初級給藥后的6、8、10或12個月。在另一實施方式中，3次初級給藥之間相隔大約2個月，如間隔7、8或9個星期，然后是在第三次初級給藥后的6個月到1年之間進行一次或多次的加強接種，如在第三次初級給藥后的6、8、10或12個月。實施方式總則本發(fā)明的一些實施方式中，RNA包括未修飾的核苷酸(見前面)。另一些實施方式中，如果還需要一種或多種以下特征(前面已描述)，則RNA可任選包含至少一種修飾的核苷酸：A.RNA通過脂質(zhì)體遞送，該脂質(zhì)體含有DSDMA、DODMA、DLinDMA和/或DLenDMA。B.RNA包封在脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體疏水部分的脂經(jīng)PEG化。C.RNA包封在脂質(zhì)體中，至少80％數(shù)量的脂質(zhì)體直徑在20-220nm范圍。D.RNA通過微粒遞送，微粒是無毒且可生物降解的多聚微粒。E.RNA通過微粒遞送，微粒的直徑在0.02μm-8μm范圍。F.RNA通過微粒遞送，至少80％數(shù)量的微粒直徑在0.03-7μm范圍。G.RNA通過微粒遞送，組合物是凍干的。H.RNA的3'端具有poly-A尾，免疫原可在體內(nèi)誘導針對細菌、病毒、真菌或寄生蟲的免疫應(yīng)答。I.RNA與金屬離子螯合劑結(jié)合遞送，使用選自以下的遞送系統(tǒng)：(i)脂質(zhì)體；(ii)無毒的可生物降解的多聚物顆粒。通用除非另有注明，本發(fā)明的顆粒采用采用的是本領(lǐng)域傳統(tǒng)的化學、生物化學、分子生物學、免疫學和藥理學技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有全面解釋，參見參考資料36-42等。術(shù)語“含有”代表“包括”和“由…組成”，如“含有”X的組合物可只有X，或者可另有其他，如X+Y。術(shù)語“大約”與數(shù)值x相關(guān)時，例如可表示x±10％。術(shù)語“基本上”不排除“完全地”，如組合物“基本上不含”Y可以是完全不含Y的。必要時“基本上”這個詞在本發(fā)明中可省略。電荷、陽離子、陰離子、兩性離子等對應(yīng)于pH7的條件。TLR3是指Toll樣受體3。它是獨立的跨膜受體，對天然免疫系統(tǒng)起著關(guān)鍵作用。已知的TLR3激動劑包括poly(I:C)。“TLR3”是編碼這個受體的基因獲批準的HGNC名稱，其獨有的HGNC代碼是HGNC:11849。人類TLR3基因的RefSeq序列是GI:2459625。TLR7是指Toll樣受體7。它是獨立的跨膜受體，對天然免疫系統(tǒng)起著關(guān)鍵作用。已知的TLR3激動劑包括咪喹莫特?！癟LR7”是編碼這個受體的基因獲批準的HGNC名稱，其獨有的HGNC代碼是HGNC:15631。人類TLR7基因的RefSeq序列是GI:67944638。TLR8是指Toll樣受體8。它是獨立的跨膜受體，對天然免疫系統(tǒng)起著關(guān)鍵作用。已知的TLR8激動劑包括雷西莫特?！癟LR8”是編碼這個受體的基因獲批準的HGNC名稱，其獨有的HGNC代碼是HGNC:15632。人類TLR7基因的RefSeq序列是GI:20302165。RIG-I-樣受體(“RLR”)家族包括在天然免疫系統(tǒng)中有著關(guān)鍵作用的各種RNA解旋酶[43]。RLR-1(也被稱作RIG-I或維甲酸誘導基因I)在其N末端附近有兩個胱冬酶募集結(jié)構(gòu)域。批準的編碼RLR-1解旋酶基因的HGNC名稱是“DDX58”(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽58)，其獨有的HGNC代碼是HGNC:19102。人類RLR-1基因的RefSeq序列是GI:77732514。RLR-2(也被稱作MDA5或黑素瘤分化相關(guān)基因5)在其N末端附近也有兩個胱冬酶募集結(jié)構(gòu)域。批準的編碼RLR-2解旋酶基因的HGNC名稱是“IFIH1”(解旋酶C結(jié)構(gòu)域1誘導干擾素)，其獨有的HGNC代碼是HGNC:18873。人類RLR-2基因的RefSeq序列是GI:27886567。RLR-3(也被稱作LGP2或遺傳學和生理學的實驗室)沒有胱冬酶募集結(jié)構(gòu)域。批準的編碼RLR-3解旋酶基因的HGNC名稱是“DHX58”(意為DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽58)，其獨有的HGNC代碼是HGNC:29517。人類RLR-3基因的RefSeq序列是GI:149408121。PKR是依賴于雙鏈RNA的蛋白激酶。它在天然免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用?！癊IF2AK2”(真核翻譯起始因子2-α激酶2)是編碼該蛋白基因的獲批準的HGNC名稱，其獨有的HGNC代碼是HGNC:9437。人類PKR基因的RefSeq序列是GI:208431825。附圖的說明圖1顯示帶有顯色RNA的凝膠。泳道說明：(1)分子量標記(2)裸復(fù)制子(3)RNA酶處理后的復(fù)制子(4)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(5)RNA酶處理后的脂質(zhì)體(6)用RNA酶處理然后經(jīng)過苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體圖2是脂質(zhì)體的電鏡顯微照片。圖3顯示在RNA分別以病毒樣包裝復(fù)制子(正方形)、裸RNA(三角形)或微粒(圓圈)的形式遞送后，于第1天、第3天、第6天時的蛋白表達(以相對光單位表示，RLU)。圖4顯示帶有顯色RNA的凝膠。泳道說明：(1)分子量標記(2)裸復(fù)制子(3)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(4)經(jīng)RNA酶處理后再用酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖5顯示RNA分別以病毒樣包裝復(fù)制子(方塊)、裸RNA(鉆石形)或脂質(zhì)體(+＝0.1μg,x＝1μg)的形式遞送后，于第1天、第3天、第6天時的蛋白表達。圖6顯示用四種不同劑量的脂質(zhì)體包封RNA遞送后，于第1天、第3天、第6天時的蛋白表達。圖7顯示動物在接受病毒樣包裝復(fù)制子(VRP或VSRP)、1μg裸RNA以及1μg脂質(zhì)體包封RNA給藥后，其體內(nèi)抗-FIgG效價。圖8顯示動物在接受VRP、1μg裸RNA以及0.1g或1μg脂質(zhì)體包封RNA給藥后，其體內(nèi)抗-FIgG效價。圖9顯示動物在接受VRP、或0.1g或1μg脂質(zhì)體包封RNA給藥后，其體內(nèi)中和抗體效價。圖10顯示復(fù)制子分別以裸RNA(圓圈)、脂質(zhì)體包封RNA(三角形和正方形)或脂質(zhì)復(fù)合體(倒三角形)形式給藥后的表達水平。圖11顯示復(fù)制子分別以裸RNA(0.01-1μg)、脂質(zhì)體包封RNA(0.01-10μg)或病毒樣包裝(VRP,106感染單位，IU)的形式給藥后，其F-特異性IgG的效價(第二次給藥2星期后)。圖12顯示復(fù)制子分別以裸RNA(1μg)、脂質(zhì)體包封RNA(0.1或1μg)或病毒樣包裝(VRP,106IU)的形式給藥后，其F-特異性IgG的效價(圓圈)和PRNT效價(正方形)。同時顯示了未經(jīng)免疫處理小鼠體內(nèi)的效價。實線表示幾何平均數(shù)。圖13顯示在第2次給藥4周后，用代表F蛋白主要表位的合成肽進行再刺激后細胞內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生。Y軸表示CD8+CD4-占細胞因子+的百分數(shù)。圖14顯示小牛在免疫接種后63天(圖14A)、210天(圖14B)的F-特異性IgG效價(log10效價的平均值±標準差)。在63天時三條線很容易區(qū)分，從下至上：PBS陰性對照；脂質(zhì)體遞送RNA；“Triangle4”產(chǎn)物。圖15顯示作為對裸RNA(“RNA”)或脂質(zhì)體包封RNA(“LNP”)，或者通過電穿透肌肉遞送DNA的應(yīng)答的抗-HIV血清IgG效價。圖16顯示13組小鼠中IgG效價。每個圓圈代表一只小鼠，實線表示幾何平均數(shù)。水平的虛線是分析的檢測限。13組中從左到右是A到M，如下面所述。圖17顯示pDC釋放的(A)IL-6(B)IFNα(pg/ml)。有4對柱狀線，從左到右：對照、經(jīng)RNA+DOTAP免疫、經(jīng)RNA+脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(lipofectamine)免疫、經(jīng)脂質(zhì)體包封RNA免疫。每對柱狀線中黑色是野生型小鼠，灰色是rsq1突變體。具體實施方式RNA復(fù)制子以下采用多種復(fù)制子?？傮w上它們是基于α病毒屬基因組與委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)非結(jié)構(gòu)蛋白、與辛德畢斯病毒的包裝信號、與辛德畢斯病毒或VEEV突變株的3'UTR之間的雜合體。復(fù)制子長度約10kb，有poly-A尾部。編碼α病毒屬復(fù)制子的質(zhì)粒DNA(稱為pT7-mVEEV-FL.RSVF或A317；pT7-mVEEV-SEAP或A306；pSP6-VCR-GFP或A50)被用作體外復(fù)制RNA的模板。復(fù)制子含有RNA復(fù)制所要求的α病毒屬的遺傳元素，但沒有那些負責編碼顆粒組裝產(chǎn)物的基因；結(jié)構(gòu)蛋白被感興趣的蛋白所取代(例如：報告基因產(chǎn)物，如SEAP或GFP，或者是免疫原，如全長度的RSVF蛋白)，于是復(fù)制子就不能誘導產(chǎn)生感染性顆粒。α病毒屬cDNA上游的噬菌體(T7或SP6)啟動子促進了復(fù)制子RNA在體外的合成，緊靠著poly(A)尾部的下游位置丁型肝炎病毒(HDV)核酶通過自身裂解行為生成正確的3'末端。在HDV核酶通過適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶作用使下游位置質(zhì)粒DNA線性化以后，用源自T7或SP6噬菌體的DNA依賴性RNA聚合酶進行體外合成失控轉(zhuǎn)錄子。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)每種核苷三磷酸酯(ATP、CTP、GTP和UTP)用量為7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)，在37℃反應(yīng)2小時，具體參照生產(chǎn)商(安碧公司(Ambion))的提供的說明。轉(zhuǎn)錄后模板DNA用TURBODNA酶(安碧公司)消化。用LiCl沉淀復(fù)制子RNA并在無核酸酶水中重溶。無帽RNA在轉(zhuǎn)錄后以牛痘病毒加帽酶(VCE)采用ScriptCapm7G加帽系統(tǒng)(EpicentreBiotechnologies)進行加帽，按照使用手冊進行操作；以這種方式加帽的復(fù)制子名稱前加上前綴“v”，如vA317是指通過VCE加帽的A317復(fù)制子。后轉(zhuǎn)錄加帽的RNA用LiCl沉淀并在無核酸酶水中重溶。通過測定OD260nm確定RNA樣品的濃度。用變性瓊脂糖凝膠電泳確認體外轉(zhuǎn)錄子的完整性。PLG吸附微粒用500mgPLGRG503(乳酸/羥基乙酸摩爾比50:50，MW約30kDa)和20mgDOTAP，通過OmniMacro均質(zhì)儀來制作。顆粒懸液在150rpm轉(zhuǎn)速振蕩過夜，然后過40μm的無菌濾器，2-8℃保存。將自我復(fù)制型RNA吸附到顆粒上。制備1mL的PLG/RNA懸液，將所需體積的PLG顆粒懸液加到小瓶內(nèi)，加入無核酸酶的水至總體積900μL。向PLG懸液中逐滴加入100μLRNA(10μg/mL)，同時不斷振蕩。PLG/RNA室溫孵育30分鐘。重配好的lmL懸液中，加入45mg甘露醇、15mg蔗糖和250-500μgPVA。瓶子在-80℃冷凍并進行冷凍干燥。為評價RNA吸附情況，將100μL顆粒懸液在10,000rpm離心5分鐘，收集上清液。用1mL無核酸酶的水重溶PLG/RNA。100μL顆粒懸液中(1μgRNA)加入1mg硫酸肝素?；旌衔镄郎u振蕩后在室溫放置30分鐘進行RNA解吸。離心顆粒懸液并收集上清液。為確定RNA酶穩(wěn)定性，將100μL顆粒懸液與6.4mAU的RNA酶A一同在室溫下孵育30分鐘。用0.126mAU的蛋白酶K，55℃處理10分鐘以滅活RNA酶。加入1mg硫酸肝素解吸RNA，然后離心。含RNA的上清液樣品與甲醛加樣染料混合，65℃加熱10分鐘，用1％變性凝膠分析(每道加樣460ngRNA)。為評價表達，在0天時，用1μgRNA、總注射體積100μL(每條腿50μL)對Balb/c小鼠作肌肉注射免疫。分別于第1、3、6天取血清。用化學發(fā)光分析法確定蛋白的表達。如圖3所示，與沒有任何遞送顆粒時(圓圈)相比，當RNA用PLG給藥時(三角形)表達水平較高。脂質(zhì)體包封用按照參考資料7和44的方法制備的脂質(zhì)體進行RNA包封。脂質(zhì)體由10％DSPC(兩性離子型)、40％DlinDMA(陽離子型)、48％膽固醇以及2％PEG結(jié)合的DMG(2kDaPEG)制成。這些比例是指所占總脂質(zhì)體的摩爾百分比。DlinDMA(1,2-二亞油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷)采用參考資料2的流程合成。DSPC(二硬脂?；蚜字?購自基酶公司(Genzyme)。膽固醇購自西格瑪-艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)。PEG結(jié)合的DMG(1,2-十四?；字Ｒ掖及?N-[甲氧基(聚乙二醇)]，銨鹽)、DOTAP(二油酰氧基三甲胺丙烷，鹽酸鹽)以及DC-chol(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰]膽固醇鹽酸鹽)來自阿凡提極性脂質(zhì)公司(AvantiPolarLipids)。簡言之，將脂質(zhì)溶于乙醇(2ml)，RNA復(fù)制子溶于緩沖液(2ml，100mM檸檬酸鈉，pH6)，將以上與2ml緩沖液混合，平衡1小時。用6ml緩沖液稀釋混合物并過濾。所得的產(chǎn)物含有脂質(zhì)體，包封率在～95％。例如，在一個特定方法中，在乙醇中制備新鮮的脂質(zhì)儲液。稱量37mg的DlinDMA、11.8mg的DSPC、27.8mg的膽固醇和8.07mg的PEG-DMG，溶于7.55mL乙醇。新制備的脂質(zhì)儲液在37℃輕搖15分鐘，形成均勻的混合物。然后755μL的儲液加到1.245mL乙醇中制成2mL的脂質(zhì)工作儲液。這個量的脂質(zhì)用來與250μgRNA形成脂質(zhì)體。同樣從含約1μg/μLRNA的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)儲液，制備2mL的RNA工作溶液。取三只20mL的玻璃小瓶(帶有攪拌子)，為了在使用前去除瓶子的RNA酶污染，用RNaseAway溶液(分子生物制品公司(MolecularBioProducts))淋洗，再用足量的MilliQ水充分清洗。其中一只小瓶用于RNA工作溶液，其他用于收集脂質(zhì)和RNA的混合物(如后面所描述)。脂質(zhì)和RNA工作溶液在裝入3cc的luer-lok注射器之前，于37℃加熱10分鐘。將2mL檸檬酸緩沖液(pH6)裝入另一個3cc的魯爾接口(luer-lok)注射器。裝有RNA和脂質(zhì)的注射器用FEP(氟化乙烯丙烯，所有使用的FEP管內(nèi)外徑分別是2mm和3mm，獲自藝達思健康科學公司(IdexHealthScience))管子連接到一臺T混合器上(PEEKTM500μmID結(jié)合(junction)，藝達思健康科學公司)。T混合器的出料口也是FEP管。第三個含有檸檬酸緩沖液的注射器單接一根管子。用注射泵以7mL/min的流速推動所有注射器。定位出料口管子將混合物收集在20mL玻璃瓶里(同時攪拌)。取出攪拌子，讓乙醇/水溶液在室溫下平衡1小時。將4ml混合物裝入連接著FEP管子的5cc注射器，在另一個連有同樣長度FEP管的5cc的注射器中加入等量的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)。用注射泵以7mL/min的流速推動兩個注射器，將最終的混合物收集在20mL玻璃瓶里(同時攪拌)。接下來，從第二次混合收集來的混合物(脂質(zhì)體)通過MustangQ膜(陰離子交換載體，可結(jié)合并除去帶陰離子的分子，來自波樂公司(PallCorporation))。在這個膜用于處理脂質(zhì)體之前，依次用4mL的1MNaOH、4mL的1MNaCl和10mL的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)通過膜。脂質(zhì)體在通過膜之前先在37℃溫熱10分鐘。然后，將脂質(zhì)體濃縮至2mL，在10-15倍體積的1xPBS里以切向流過濾(TFF)透析，收集最終產(chǎn)物。TFF系統(tǒng)和中空纖維濾膜購自斯派實驗室(SpectrumLabs)(多明格斯牧場(RanchoDominguez))，并按照制造商的指南使用。使用的聚砜中空纖維濾膜是100kD截留孔徑和8cm2表面積。為進行體外體內(nèi)試驗，將RNA用1xPBS稀釋至所需濃度。另外的脂質(zhì)體制備方法將在下面描述。圖2顯示了用這些方法制備的脂質(zhì)體的電鏡顯微照片實例。這些脂質(zhì)體內(nèi)包裹著編碼全長度的RSVF抗原。一批的動態(tài)光散射測試顯示其平均直徑為141nm(按強度計)或78nm(按數(shù)量計)。被包封的RNA百分比及RNA濃度用Quant-iTRiboGreenRNA試劑盒(Invitrogen)來確定，按生產(chǎn)商的說明進行操作。用試劑盒中提供的核糖體RNA標準品制作標準曲線。脂質(zhì)體在加入染料前先用1XTE緩沖液(試劑盒中提供)稀釋10倍或100倍。加入染料前，另行將脂質(zhì)體用含有0.5％TritonX的1XTE緩沖液稀釋10倍或100倍(以破碎脂質(zhì)體，分析總RNA量)。此后每份溶液中加入等量的染料，加好染料的溶液每份取約180μL上到一塊96孔組織培養(yǎng)板中，每個樣做兩個平行孔。在微孔讀板器上讀取熒光(Ex485nm,Em528nm)。所有脂質(zhì)體配方根據(jù)RNA的包封量進行體內(nèi)給藥。脂質(zhì)體包封顯示能保護RNA免受RNA酶降解。實驗采用每微克RNA對應(yīng)3.8mAU的RNA酶，室溫孵育30分鐘。RNA酶用蛋白酶K55℃處理10分鐘來滅活。將樣品以1:1v/v的比例與25:24:1v/v/v的苯酚:氯仿:異戊醇相混合，以將RNA從脂質(zhì)體中抽提到水相里。樣品漩渦混合數(shù)秒后在12kRPM轉(zhuǎn)速離心15分鐘。取出水相(含有RNA)分析RNA。在加樣之前(400ngRNA/孔)所有樣品與甲醛上樣染料一同孵育，65℃變性10分鐘，冷卻到室溫。用安碧Millennium標記物來大致估算RNA分子量。凝膠電泳在90V進行。按照生產(chǎn)商提供的說明，凝膠用0.1％SYBRGold水溶液染色，室溫振蕩1小時。圖1顯示在未被包封的情況下RNA被RNA酶完全降解(泳道3)。RNA被包封后檢測不到(泳道4)，如用RNA酶處理這些脂質(zhì)體則看不出變化(泳道4)。RNA酶處理過的脂質(zhì)體在用苯酚提取后，可看到未降解的RNA(泳道6)。即使在4℃放置1周后，仍能看到RNA未出現(xiàn)任何降解片段(圖4，箭頭)。4℃放置6周且經(jīng)過一輪凍融后，體內(nèi)蛋白表達未發(fā)生變化。因此脂質(zhì)體包封的RNA是穩(wěn)定的。為評價RNA在體內(nèi)的表達，在轉(zhuǎn)錄子內(nèi)編碼報告酶(SEAP；分泌性堿性磷酸酶)，而不是編碼免疫原。在用1XPhospha-Light稀釋緩沖液稀釋4倍的血清里用化學發(fā)光的堿性磷酸酶底物測定表達水平。8-10周齡的BALB/c小鼠(每組5只)在0天時肌肉注射0.1μg或1μg的RNA劑量，每條腿50μl。同樣的受體還用沒有脂質(zhì)體的1μgRNA(溶在不含RNA酶的1XPBS里)給藥。還測試了病毒樣包裝的復(fù)制子。此處所用的病毒樣包裝復(fù)制子(用“VRPs”表示)按參考資料45的方法獲得，其中的α病毒屬復(fù)制子源自VEEV突變株，或來自VEEV基因組的嵌合體，后者是經(jīng)基因操作使其包含辛德畢斯病毒的3'UTR以及辛德畢斯病毒包裝信號(PS)，用共電轉(zhuǎn)將它們與編碼辛德畢斯病毒衣殼和糖蛋白基因的缺陷輔助RNA包裝入BHK細胞里。如圖5所示，在1μg劑量下，包封將SEAP水平提高了1/2log值，在0.1μg包封劑量下6天的表達量與1μg的未包封劑量下的相當。到第3天表達量超過了VRPs(正方形)所達到的水平。因此，相比裸RNA對照，當RNA制成脂質(zhì)體時其表達增加，即使其劑量小了10倍。表達也強于VRP對照，但表達的動力學過程很不一樣(見圖5)。相對于裸RNA對照，用電穿透方法遞送RNA使表達增加，但其水平低于脂質(zhì)體。進一步的SEAP實驗顯示了體內(nèi)明確的量效關(guān)系，給藥少至1ngRNA的量也可見到表達(圖6)。比較包封復(fù)制子和裸露復(fù)制子的進一步實驗表明，0.01μg的包封RNA相當于1μg的裸RNA。在0.5μg的RNA劑量下，經(jīng)包封的材料在第6天給出12倍的高表達；在0.1μg的劑量下，第6天達到24倍。除了關(guān)注組內(nèi)的平均水平，對動物個體也進行了研究。在好幾只動物對裸復(fù)制子無應(yīng)答的同時，包封組沒有發(fā)生無應(yīng)答的情況。進一步的實驗用DOTAP替代了DlinDMA。與裸復(fù)制子相比盡管DOTAP脂質(zhì)體獲得了較好的表達，它們要次于DlinDMA脂質(zhì)體(第1天有2-3倍的差異)。為評價體內(nèi)免疫原性，構(gòu)建了復(fù)制子來表達來自呼吸道合胞病毒(RSV)的全長度F蛋白。在0天和21天時，將其以裸露(1μg)、脂質(zhì)體包封(0.1或1μg)、或病毒樣包裝(106IU；“VRP”)的形式遞送。圖7顯示了第二次給藥后2周時的抗-FIgG效價，脂質(zhì)體顯著增強了免疫原性。圖8顯示兩周后的效價，在此時間點上0.1μg劑量的包封RNA與1μg劑量的包封RNA或VRP組之間無顯著差別。第二次給藥2周后三組的中和效價(測定60％空斑減少，“PRNT60”)無顯著差異(圖9)。圖12顯示第二次給藥4周后IgG和PRNT兩者的效價。圖13確認了RNA誘導了強烈的CD8T細胞應(yīng)答。進一步的實驗比較了小鼠接受VRP、0.1μg脂質(zhì)體包封RNA或1μg脂質(zhì)體包封RNA后的F-特異性IgG效價。第二次給藥后不同時間點的效價之比(VRP:脂質(zhì)體)如下：2周4周8周0.1μg2.91.01.11μg2.30.90.9因此脂質(zhì)體包封RNA基本上誘導了與病毒樣遞送系統(tǒng)相同水平的免疫應(yīng)答。進一步實驗顯示10μg劑量下F-特異性IgG的高度應(yīng)答，1μg與0.1μg劑量的應(yīng)答強度相當，以及0.01μg下的較低程度應(yīng)答。圖11顯示小鼠接受三個不同劑量裸復(fù)制子、4個不同劑量脂質(zhì)體包封物或者VRP(106IU)時的IgG效價。與VRP組相比1μg脂質(zhì)體包封RNA組的應(yīng)答無統(tǒng)計學意義(ANOVA)，但與這兩組相比10μg脂質(zhì)體包封RNA組中所見的較強應(yīng)答有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。進一步研究確認，0.1μg的脂質(zhì)體包封RNA比0.1μgDNA給藥給出的抗-FIgG應(yīng)答強得多(第二次給藥15天后)，甚至比采用電穿透(ElgenTMDNA遞送系統(tǒng)，因諾公司(Inovio))給藥的20μg編碼F抗原的質(zhì)粒DNA免疫原性更強。小鼠接受脂質(zhì)體包封RNA復(fù)制子后幾乎未見衰退跡象(體重降低等)，盡管在第二次10μgRNA給藥后觀察到暫時性的3-4％體重減輕。與之相對應(yīng)，10μg的脂質(zhì)體包封DNA導致8-10％的體重損失。作用機制骨髓源樹突狀細胞(pDC)來自野生型小鼠或“Resq”(rsq1)突變體。突變體在其TLR7受體的氨基末端帶有點突變，它去除了TLR7信號功能，但同時不影響配體結(jié)合[46]。復(fù)制子RNA與DOTAP和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑2000制成配方或包封在脂質(zhì)體內(nèi)，用來刺激細胞。如圖17所示，IL-6和INFα在WT細胞內(nèi)被誘導，但該應(yīng)答在突變小鼠中幾乎完全喪失。這些結(jié)果顯示TLR7對于免疫細胞內(nèi)的RNA識別是必需的，脂質(zhì)體包封復(fù)制子可引起免疫細胞分泌高水平的干擾素和促炎細胞因子?？傮w上脂質(zhì)體遞送的RNA轉(zhuǎn)錄子顯示在肌肉注射24小時內(nèi)誘導多種血清細胞因子(IFN-α、IP-10(CXCL-10)、IL-6、KC、IL-5、IL-13、MCP-1和MIP-a)，而裸RNA只誘導MIP-1，單獨的脂質(zhì)體僅誘導IL-6。IFN-α顯示其有利于對脂質(zhì)體包封RSV-F-編碼復(fù)制子的免疫應(yīng)答，因為在兩次疫苗接種后抗-IFNα受體(IFNAR1)抗體使F-特異性血清IgG降低10倍。通?？梢娭|(zhì)體遞送RNA復(fù)制子在小鼠體內(nèi)誘導平衡的IgG1:IgG2a亞型比例，與電穿透DNA或蛋白/MF59免疫(即Th1-型免疫應(yīng)答)相比，有時呈現(xiàn)較高的IgG2a/IgG1比例。脂質(zhì)體制備方法根據(jù)本發(fā)明通常采用8種方法來制備脂質(zhì)體。這些在文本中注明為方法(A)到(H)，它們之間主要區(qū)別在過濾和TFF步驟。詳述如下：(A)在乙醇中制備新鮮的脂質(zhì)儲液。稱量37mg的DlinDMA、11.8mg的DSPC、27.8mg的膽固醇和8.07mg的PEGDMG2000，溶于7.55mL乙醇。新制備的脂質(zhì)儲液在37℃輕搖15分鐘，形成均勻的混合物。然后755μL的儲液加到1.245mL乙醇中制成2mL的脂質(zhì)工作儲液。這個量的脂質(zhì)用來與250μgRNA形成脂質(zhì)體。同樣從含約1μg/μLRNA的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)儲液，制備2mL的RNA工作溶液。取三只20mL的玻璃小瓶(帶有攪拌子)，用RNaseAway溶液(MolecularBioProducts,SanDiego,CA)淋洗，再用足量的MilliQ水充分清洗，以去除瓶子的RNA酶污染。其中一只小瓶用于RNA工作溶液，其他用于收集脂質(zhì)和RNA的混合物(如后面所描述)。脂質(zhì)和RNA工作溶液在裝入3cc的魯爾接口注射器之前，于37℃加熱10分鐘。將2mL檸檬酸緩沖液(pH6)裝入另一個3cc的luer-lok注射器。裝有RNA和脂質(zhì)的注射器用FEP(氟化乙烯丙烯，所有使用的FEP管內(nèi)外徑分別是2mm和3mm，藝達思健康科學公司公司提供)管子連接到一臺T混合器上(PEEKTM500μmID結(jié)合(junction)，藝達思健康科學公司，華盛頓州奧克港)。T混合器的出料口也是FEP管。第三個含有檸檬酸緩沖液的注射器單接一根管子。用注射泵以7mL/min的流速推動所有注射器。定位出料口管子將混合物收集在20mL玻璃瓶里(同時攪拌)。取出攪拌子，讓乙醇/水溶液在室溫下平衡1小時。將4ml混合物裝入連接著FEP管子的5cc注射器，在另一個連有同樣長度FEP管的5cc的注射器中加入等量的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)。用注射泵以7mL/min的流速推動兩個注射器，將最終的混合物收集在20mL玻璃瓶里(同時攪拌)。接下來，從第二次混合收集來的混合物(脂質(zhì)體)通過MustangQ膜(陰離子交換載體，可結(jié)合并除去帶陰離子的分子，美國密歇根州安娜堡的波樂公司)。在這個膜用于處理脂質(zhì)體之前，依次用4mL的1MNaOH、4mL的1MNaCl和10mL的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)通過Mustang膜。脂質(zhì)體在通過膜之前先在37℃溫熱10分鐘。然后，將脂質(zhì)體濃縮至2mL，在10-15倍體積的1xPBS里以切向流過濾(TFF)透析，收集最終產(chǎn)物。TFF系統(tǒng)和中空纖維濾膜購自斯派實驗室(SpectrumLabs)，并按照制造商的指南使用。使用的聚砜中空纖維濾膜(產(chǎn)品代碼：X1AB-100-20P)是100kD截留孔徑和8cm2表面積。為進行體外體內(nèi)試驗，將RNA用1xPBS稀釋至所需濃度。(B)同方法(A)，差別在于：震搖后將226.7μL儲液加到1.773mL乙醇中，成為2mL脂質(zhì)工作儲液，以此調(diào)節(jié)脂質(zhì)與RNA的比例。(C)同方法(B)，差別在于：省略Mustang過濾，故脂質(zhì)體直接從20mL玻璃瓶進入TFF透析步驟。(D)同方法(C)，差別在于：TFF采用的是聚醚砜(PES)中空纖維膜(產(chǎn)品代碼：P-C1-100E-100-01N)，截留孔徑100kD、表面積20cm2。(E)同方法(D)，差別在于：采用方法(A)中的Mustang膜。(F)同方法(A)，差別在于：省略Mustang過濾，故脂質(zhì)體直接從20mL玻璃瓶進入TFF透析步驟。(G)同方法(D)，差別在于：4mL的RNA工作溶液是從含約1μg/μLRNA的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)儲液所制備。然后取四只20mL玻璃小瓶作相同處理。其中兩只小瓶用于RNA工作溶液(每瓶裝2mL)，其他用于收集脂質(zhì)和RNA的混合物，同方法(C)。含RNA和脂質(zhì)的注射器不是接到T混合器上，而是用PTFE(內(nèi)徑0.03英寸，外徑1/16英寸)通過四通道接口(Syrris公司產(chǎn)品)連到Mitos液滴結(jié)合片上(MitosDropletjunctionChip)(來自Syrris公司的微流體玻璃裝置，產(chǎn)品代碼：3000158)。用注射泵驅(qū)動兩條RNA通道和一條脂質(zhì)通道，乙醇與水相的混合在裝置的X界面(100μmx105μm)進行。三條通路的流速控制在1.5mL/min，總體上水相與乙醇的流速比是2:1。定位出料口管子將混合物收集在20mL玻璃瓶里(同時攪拌)。取出攪拌子，讓乙醇/水溶液在室溫下平衡1小時。將混合物裝入連接著另PTFE管子的5cc注射器，在另一個連有同樣長度PTFE管的5cc的注射器中加入等量的100mM檸檬酸緩沖液(pH6)。用注射泵以3mL/min的流速推動兩個注射器，將最終的混合物收集在20mL玻璃瓶里(同時攪拌)。然后，將脂質(zhì)體濃縮至2mL，在10-15倍體積的1xPBS里進行TFF透析，同方法(D)。(H)同方法(A)，差別在于：2mL脂質(zhì)工作儲液通過將120.9μL脂質(zhì)儲液與1.879mL乙醇混合制成。在用T混合器混合后將20mL小瓶中的脂質(zhì)體裝到PierceSlide-A-Lyzer透析組件(賽默飛世爾公司(ThermoScientific)，超強型，容量0.5–3mL)中，在一滅菌的塑料容器內(nèi)用400-500mL體積的1XPBS4℃透析過夜，然后收集最終產(chǎn)物。BHK表達不同脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體與BHK細胞一同孵育過夜，對蛋白表達強度作出評價。以RV05脂質(zhì)作為基線，在脂質(zhì)體中加入10％的二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)可使表達增加18倍，加入10％18:2(順式)磷脂酰膽堿可增加10倍，代之以RV01則增加900倍?？傊w內(nèi)研究顯示，針對編碼的抗原，不飽和脂質(zhì)尾部傾向于增強IgG效價。RSV免疫原性在0天和21天時，用編碼RSVF蛋白的vA317自我復(fù)制型復(fù)制子，分別以單純復(fù)制子(1μg)、復(fù)制子與DlinDMA制成脂質(zhì)體(“RV01”)、復(fù)制子與DOTAP制成脂質(zhì)體(“RV13”)的形式，對BALB/c小鼠進行給藥，每組4或8只動物，雙側(cè)肌肉接種疫苗(每條腿上50μL)。RV01脂質(zhì)體含有40％DlinDMA、10％DSPC、48％膽固醇和2％PEG-DMG，但所含RNA量不同。RV13脂質(zhì)體40％DOTAP、10％DPE、48％膽固醇和2％PEG-DMG。為進行比較，表達同一RSV-F抗原的裸露質(zhì)粒DNA(20μg)也通過電穿透或作為RV01(10)脂質(zhì)體(0.1μgDNA)形式進行給藥。用四只小鼠作為未經(jīng)免疫處理對照組。脂質(zhì)體用方法(D)或(B)制備。方法(D)制備的一些脂質(zhì)體中采用了雙倍或一半劑量的RNA。脂質(zhì)體的顆粒平均直徑Z值、多分散指數(shù)(pdI)和包封效率數(shù)據(jù)如下：RVZav(nm)pdI包封率％方法RV01(10)158.60.08890.7(A)RV01(08)156.80.14488.6(A)RV01(05)136.50.13699(B)RV01(09)153.20.06776.7(A)RV01(10)134.70.14787.8*(A)RV13(02)128.30.17997(A)*該RV01(10)配方中核酸是DNA，不是RNA。在14天、36天和49天取血清檢測抗體。49天取小鼠脾臟作T細胞分析。F-特異性血清IgG效價(GMT)如下：RV第14天第36天裸DNA質(zhì)粒4396712裸A317RNA782291RV01(10)302026170RV01(08)23269720RV01(05)535254907RV01(09)442851316RV01(10)DNA513RV13(02)6443616細胞因子陽性且對RSVF51-66肽特異性的T細胞份額如下，只顯示了具統(tǒng)計學上顯著大于0的數(shù)據(jù)：根據(jù)F-特異性IgG效價和T細胞數(shù)據(jù)的升高，說明與裸RNA對照組相比，脂質(zhì)體配置顯著增強了免疫原性。用脂質(zhì)體配置質(zhì)粒DNA或以裸露形式電穿透遞送，免疫原性明顯弱于脂質(zhì)體配置的自我復(fù)制型RNA。RV01RNA疫苗比RV13疫苗免疫原性強。RV01在其頭部有叔胺基團，pKa約為5.8，還包括不飽和烷基尾部。RV13有不飽和烷基尾部但其頭部有季胺基團，呈很強的陽性電荷。脂質(zhì)體----包封的要求為評估脂質(zhì)體組中所見效應(yīng)是否僅僅是由于脂質(zhì)體成分本身所引起，或者是與包封本身相關(guān)，復(fù)制子以包封形式(采用兩種不同的純化方案，0.1μgRNA)、或在脂質(zhì)體形成后與之相混合(未經(jīng)包封的“脂質(zhì)復(fù)合體”，0.1μgRNA)、或以裸RNA(1μg)的形式，進行給藥。圖10顯示包封是效價表達之關(guān)鍵。進一步實驗采用了三種不同的RNA：(i)表達RSV-F的‘vA317’復(fù)制子，即RSV表面融合糖蛋白；(ii)表達GFP的‘vA17’；(iii)編碼GFP的復(fù)制缺陷型‘vA336’。RNA以裸露形式或按方法(D)制成的脂質(zhì)體形式進行給藥。用方法(D)制備不含RNA的空脂質(zhì)體。四種脂質(zhì)體配置的性質(zhì)如下：RNA顆粒大小Zav(nm)多分散度RNA包封率vA317155.70.11386.6％vA17148.40.13992％vA336145.10.14392.9％空白147.90.147-BALB/c小鼠，每組5只動物，在0天和21天時雙側(cè)肌肉注射以下疫苗(每條腿50μL)：第1組：裸露的自我復(fù)制型RSV-FRNA(vA317,0.1μg)第2組：脂質(zhì)體包封的自我復(fù)制型RSV-FRNA(vA317,0.1μg)第3組：與空脂質(zhì)體相混合的自我復(fù)制型RSV-FRNA(vA317,0.1μg)第4組：亞單位蛋白(5μg)在14天、35天和51天取血清檢測抗體。測定F-特異性的血清IgG效價(GMT)，如果有單個動物的效價<25(檢測限)，將其歸為效價值5。另外在51天取小鼠脾臟作T細胞分析，以測定細胞因子陽性且對RSVF51-66肽特異(CD4+)或?qū)SVFF85-93肽和F249-258肽特異(CD8+)的細胞。10個組以及未免疫對照組小鼠的IgG效價如下：天數(shù)1234-1422181955535290325339198775514633051118208535第51天時RSV血清中和效價如下：天數(shù)12345135502438在第51天呈現(xiàn)RSVF-特異性CD4+脾臟T細胞的動物如下，其中只給出統(tǒng)計學上顯著大于0的刺激應(yīng)答數(shù)據(jù)(陽性細胞％)：細胞因子1234IFN-γ0.04IL20.020.060.02IL5TNFα0.030.05在第51天呈現(xiàn)RSVF-特異性CD8+脾臟T細胞的動物如下，其中只給出統(tǒng)計上顯著大于0的刺激應(yīng)答數(shù)據(jù)：細胞因子1234IFN-γ0.370.87IL20.110.400.04IL5TNFα0.290.790.06因為簡單地將RNA與脂質(zhì)體混合(第3組)沒有免疫原性(實際上比裸RNA更低)，可見將RNA包封在脂質(zhì)體內(nèi)是獲得高免疫原性所必需的。另一項研究中小鼠接受各種組合給藥：(i)編碼全長RSVF蛋白的自我復(fù)制型RNA復(fù)制子(ii)編碼GFP的自我復(fù)制型RNA復(fù)制子(iii)編碼GFP的RNA復(fù)制子，其nsP4被敲除而失去自我復(fù)制能力(iv)全長RSVF蛋白。全部13組的接受如下：A--B0.1μgof(i),裸露-C0.1μgof(i),包封在脂質(zhì)體內(nèi)-D0.1μgof(i),和分離脂質(zhì)體-E0.1μgof(i),裸露10μgof(ii),裸露F0.1μgof(i),裸露10μgof(iii),裸露G0.1μgof(i),包封在脂質(zhì)體內(nèi)10μgof(ii),裸露H0.1μgof(i),包封在脂質(zhì)體內(nèi)10μgof(iii),裸露I0.1μgof(i),包封在脂質(zhì)體內(nèi)1μgof(ii),包封在脂質(zhì)體內(nèi)J0.1μgof(i),包封在脂質(zhì)體內(nèi)1μgof(iii),包封在脂質(zhì)體內(nèi)K5μgF蛋白-L5μgF蛋白1μgof(ii),包封在脂質(zhì)體內(nèi)M5μgF蛋白1μgof(iii),包封在脂質(zhì)體內(nèi)圖16的結(jié)果顯示F-特異性IgG應(yīng)答需要脂質(zhì)體包封，而不是簡單的共同遞送(比較C和D)。K、L、M之間的比較說明RNA為共同給藥的蛋白提供了佐劑效應(yīng)，這種效應(yīng)在復(fù)制型和非復(fù)制型RNA中都可見到。不同突變小鼠中的RSV免疫原性復(fù)制子“vA142”編碼全長度的野生型RSV表面融合(F)糖蛋白，但去除了融合肽，借助核酶介導的剪切作用形成了3'末端。在三種不同突變小鼠中進行試驗。BALB/c小鼠在0天和22天時雙側(cè)肌肉注射疫苗(每條腿50μL)。動物分為8個試驗組(每組5只動物)和一個未免疫處理組(2只動物)：第1組：給予裸復(fù)制子(1μg)。第2組：給予脂質(zhì)體“RV01(37)”遞送的1μg復(fù)制子，脂質(zhì)體含40％DlinDMA、10％DSPC、48％膽固醇、2％PEG結(jié)合DMG。第3組：給予同第2組，但RNA量為0.1μg。第4組：給予脂質(zhì)體“RV17(10)”(40％RV17(上述)、10％DSPC、49.5％膽固醇、0.5％PEG-DMG)中的1μg復(fù)制子。第5組：給予脂質(zhì)體“RV05(11)”(40％RV07脂、30％18:2PE(DLoPE、28％膽固醇、2％PEG-DMG)中的1μg復(fù)制子。第6組：給予脂質(zhì)體“RV17(10)”中的0.1μg復(fù)制子。第7組：給予5μgRSV-F亞單位蛋白，輔以氫氧化鋁佐劑。第8組：未經(jīng)免疫處理對照(2只動物)。在14天、35天和49天取血清檢測抗體。F-特異性血清IgGGMT如下：天數(shù)12345678148224637892496117112951293535153834181256052357913718888773809535天時F-特異性IgG1和IgG2a效價(GMT)如下：IgG1234567IgG1946238483674258288181778604IgG2a538677064590843374914437176242435天和49天的RSV血清中和抗體效價如下(數(shù)據(jù)是2-5只小鼠的收集池所測得的60％空斑減少中和效價，每組1個收集池)：天數(shù)1234567835<20143201013230111<2049<20139<208341321009<2049天時取小鼠脾臟作T細胞分析。F-特異性T細胞(CD4+或CD8+)平均數(shù)值如下，其中只顯示統(tǒng)計學上顯著大于0的數(shù)據(jù)(CD4+：對RSVF51-66肽、F164-178肽、F309-323肽特異，或CD8+：對F85-93肽和F249-258特異)：C57BL/6以同樣方式免疫接種，但設(shè)第9組接受表達全長度野生型RSV表面融合糖蛋白(去除融合肽)的VRP(1x106IU)。在14天、35天和49天取血清檢測抗體。F-特異性IgG效價(GMT)如下：天數(shù)12345678914114021331026279230451330297551101351721553231843882952524093925151213935天時F-特異性IgG1和IgG2a效價(GMT)如下：35天和49天的RSV血清中和抗體效價如下(數(shù)據(jù)是2-5只小鼠的收集池所測得的60％空斑減少中和效價，每組1個收集池)：49天時取脾臟作T細胞分析。F-特異性細胞因子陽性T細胞(CD8+)平均數(shù)值如下，其中只顯示統(tǒng)計學上顯著大于0的數(shù)據(jù)(對RSVF85-93肽和F249-258特異)：9組C3H/HeN小鼠用相同方式免疫接種。F-特異性IgG效價(GMT)如下：天數(shù)1234567891452049166611022989843519580635152277541900817693342461006229751724935天時F-特異性IgG1和IgG2a效價(GMT)如下：IgG12345678IgG1513231702111363483114189IgG2a3021369417842467385156672708538007272735天和49天的RSV血清中和抗體效價如下：天數(shù)12345678935<205392606510195443<2059549<2045629635821251148<20387因此三種不同脂質(zhì)(RV01、RV05、RV17；pKa5.8、5.85、6.1)在三種不同近交系小鼠株系中進行了測試。所有三種株系中RV01比RV17有效；RV05對于BALB/c和C3H株系的效果不如RV01或RV17，但它對B6株系更有效。在所有情況中脂質(zhì)體比平行測試的兩種陽離子型納米乳液更有效。CMV免疫原性用作為陽離子型脂質(zhì)的DLinDMA制成的RV01脂質(zhì)體，被用來遞送編碼巨細胞病毒(CMV)糖蛋白的RNA復(fù)制子。“vA160”復(fù)制子編碼全長度的糖蛋白H和L(gH/gL)，而“vA322”復(fù)制子則編碼其可溶性的形式(gHsol/gL)。兩種蛋白在一單個復(fù)制子內(nèi)受控于獨立的亞基因組啟動子；兩個獨立的載體，其中一個編碼gH另一個編碼gL，用兩者一同給藥未能獲得好的結(jié)果。BALB/c小鼠，每組10只，在0天、21天和42天時分別用表達gH/gL(1x106IU)的VRP、表達gHsol/gL(1x106IU)的VRP以及作為對照的PBS，進行雙側(cè)肌肉注射(每條腿50μL)。兩個試驗組接受脂質(zhì)體(40％DlinDMA、10％DSPC、48％膽固醇、2％PEG-DMG；用方法(D)制得，但一批的RNA量為150μg)包封配方的1μg的vA160或vA322復(fù)制子。vA160脂質(zhì)體的直徑Zav為168nm，pdI為0.144，包封率為87.4％。vA322脂質(zhì)體的直徑Zav為162nm，pdI為0.131，包封率為90％。復(fù)制子可通過同一載體表達兩種蛋白。在63天時取血清進行免疫學分析(3wp3)。CMV中和效價(相對于對照組，每孔中發(fā)生陽性病毒數(shù)50％降低的血清稀釋度的倒數(shù))如下：gH/gLVRPgHsol/gLVRPgH/gL脂質(zhì)體gHsol/gL脂質(zhì)體45762393424010062在上皮細胞分析中，表達全長度或可溶型的CMVgH/gL復(fù)合物可誘導高效價的中和抗體。脂質(zhì)體包封RNA誘導的平均效價至少和相應(yīng)的VRP一樣高。重復(fù)實驗證實復(fù)制子能通過單一的載體表達兩種蛋白。RNA復(fù)制子誘導的3wp3效價是11457，對應(yīng)的VRP是5516。在vA160以外還用不同復(fù)制子作了進一步實驗。vA526復(fù)制子在三個亞基因組啟動子控制下表達CMV五聚復(fù)合物(gH-gL-UL128-UL130-UL-131)的：第一個啟動gH表達；第二個啟動gL表達；第三個啟動UL128-2A-UL130-2A-UL131聚合蛋白表達，其中含有在三個UL基因之間的兩個2A剪切位點。vA527復(fù)制子通過三個亞基因組啟動子和兩個IRES表達CMV五聚復(fù)合物：第一個亞基因組啟動子啟動gH表達；第二個亞基因組啟動子啟動gL表達；第三個亞基因組啟動子啟動UL128聚合蛋白表達；UL130受控于EMCVIRES；UL131受控于EV71IRES。這三種復(fù)制子制成脂質(zhì)體(方法(H)，批次大小是150μg)或VRP來給藥。BALB/c小鼠，每組10只，在0天、21天和42天時雙側(cè)肌肉注射以下疫苗(每條腿50μL)：第1組：表達gHFL/gL(1x106IU)的VRP第2組：五聚物，2AVRP(1x105IU)第3組：五聚物，2AVRP(1x106IU)第4組：五聚物，IRESVRP(1x105IU)第5組：以脂質(zhì)體包封的自我復(fù)制型RNAvA160(1μg)第6組：以脂質(zhì)體包封的自我復(fù)制型RNAvAvA526(1μg)第7組：以脂質(zhì)體包封的自我復(fù)制型RNAvAvA527(1μg)第8組：配制成陽離子型納米乳液的自我復(fù)制型RNAvA160(1μg)第9組：配制成陽離子型納米乳液的自我復(fù)制型RNAvA526(1μg)第10組：配制成陽離子型納米乳液的自我復(fù)制型RNAvA527(1μg)在21天(3wp1)、42天(3wp2)和63天(3wp3)時取血清進行免疫學分析。21天、42天和63天時CMV血清中和效價如下：疫苗組別3wp13wp23wp311266296265252N/AN/A67693N/A344273484N/AN/A226553479848423196179122108000071510512001300008N/AN/A8459N/AN/A22810N/AN/A413自我復(fù)制型RNA可用來通過單一載體表達多重抗原，用來誘導強效和特異性的免疫應(yīng)答。復(fù)制子能表達5種抗原(CMV五聚復(fù)合物(gH-gL-UL128-UL130-UL-131)并誘導強效的免疫應(yīng)答。上皮細胞分析中在所有分析時間點上(3wp1、3wp2和3wp3)自我復(fù)制型RNA以脂質(zhì)體形式遞送給藥能誘導較高效價的中和抗體。這些應(yīng)答強于相對應(yīng)的VRP和陽離子型納米乳。給藥體積液壓遞送利用了由大體積溶液快速注射產(chǎn)生的力來克服細胞膜的物理阻力，這種阻力可阻止大的不可透過膜的化合物進入細胞。曾顯示這種現(xiàn)象對DNA疫苗在細胞內(nèi)的遞送有用。用于小鼠的典型的肌肉注射給藥體積是在后腿注射50μl，這對于小鼠腿部肌肉而言是相對較大的注射體積。相對來說，約0.5ml的人類肌肉注射量是較小的。如果小鼠體內(nèi)的免疫原性為體積依賴性的，那么復(fù)制子疫苗在液壓力作用下其效力或許會失去，至少是一部分，這樣就不提倡將相同疫苗用于人類和大型動物。BALB/c小鼠，每組10只，在0天和21天時用vA317復(fù)制子進行雙側(cè)肌肉注射(每條腿5或50μL)：第1組：裸復(fù)制子，每條腿0.2μg50μL第2組：裸復(fù)制子，每條腿0.2μg5μL第3組：脂質(zhì)體配方的復(fù)制子(每條腿0.2μg50μL)第4組：脂質(zhì)體配方的復(fù)制子(每條腿0.2μg5μL)在14天和35天取血清進行抗體分析。F-特異性的血清IgG效價(GMT)如下：天數(shù)123414422126692610352411541765518516可見脂質(zhì)體配方的復(fù)制子，其免疫原性不因給藥體積的不同而發(fā)生變化，說明這些RNA疫苗的效力與液壓遞送無關(guān)。表達動力學表達熒光素酶報告基因(luc)的自我復(fù)制型RNA復(fù)制子(“vA311”)被用來研究注射后的蛋白表達動力學。BALB/c小鼠，每組5只，在0天時雙側(cè)肌肉注射以下疫苗(每條腿50μL)：第1組：表達熒光素酶的DNA，以電穿透方法遞送(10μg)第2組：配制成脂質(zhì)體的自我復(fù)制型RNA(1μg)第3組：配制成陽離子型納米乳液的自我復(fù)制型RNA(1μg)第4組：配制成陽離子型納米乳液的自我復(fù)制型RNA(1μg)第5組：表達熒光素酶的VRP(1x106IU)接種疫苗前先將小鼠去毛。麻醉小鼠(含有2％異氟烷的氧氣)，先用電動剃刀刮毛，再用Nair進行化學脫毛。在第3、7、14、21、28、35、42、49、63和70天時用XenogenIVIS200成像系統(tǒng)(卡鉗生命科學公司(CaliperLifeSciences))獲取生物熒光數(shù)據(jù)。在成像前5分鐘腹腔注射8mg/kg量的熒光素溶液。麻醉動物并轉(zhuǎn)移到成像系統(tǒng)上。用制冷CCD照相機檢測生物熒光信號時，圖像采集時間保持恒定。據(jù)目測觀察，可見熒光素酶表達細胞處于RNA注射的原位，動物在去除四肢后無信號顯示。定量方面，熒光素酶表達測定以70天里的平均輻射強度(p/s/cm2/sr)來量化，5組的結(jié)果如下：天數(shù)1234538.69E+073.33E+062.11E+069.71E+061.46E+0771.04E+088.14E+061.83E+075.94E+071.64E+07148.16E+072.91E+069.22E+063.48E+078.49E+05211.27E+073.13E+056.79E+045.07E+056.79E+05281.42E+076.37E+052.36E+044.06E+032.00E+03351.21E+076.12E+052.08E+03421.49E+078.70E+05491.17E+072.04E+05639.69E+061.72E+03709.29E+06配制成陽離子型納米乳液的自我復(fù)制型RNA在第3天顯示生物熒光，在第7天達到峰值，然后在28-35天間降至背景水平。當被制成脂質(zhì)體時，RNA在第3天顯示可檢測到的生物熒光，在第7天達到峰值，到63天降至背景水平。用VRP遞送的RNA在第21天顯示比配方RNA增強的生物熒光，但在28天時表達降至背景水平。電穿孔DNA在所有檢測時間點都顯示最高強度的生物熒光，而且在實驗的70天里生物熒光未降至背景水平。給藥途徑用編碼HIVgp140的脂質(zhì)體包封RNA對小鼠進行肌肉或皮內(nèi)或皮下給藥。所有三種給藥途徑都得到高水平的HIV-特異性IgG(圖15)，超過應(yīng)答電穿透肌肉內(nèi)DNA觀察到的效價。棉鼠用棉鼠(Sigmodonhispidis)替代小鼠進行研究。與裸RNA相比，1μg劑量的脂質(zhì)體包封物使F-特異性IgG效價提高了8.3倍，PRNT提高了9.5倍?？贵w應(yīng)答強度與5x106IU的VRP相當。裸RNA和脂質(zhì)體包封RNA兩者都能對接受RSV刺激(1x105空斑形成單位)的棉鼠形成保護，使肺內(nèi)病毒負荷下降3.5個數(shù)量級。包封使降低程度增加約2倍。進一步的棉鼠實驗采用了四種不同復(fù)制子：表達全長RSV-F的vA317；表達截短RSV-F(去除跨膜和胞質(zhì)尾區(qū))的vA318；表達去除了融合肽的RSV-F的vA142；表達截短且去除融合肽的RSV-F的vA140。棉鼠，每組4-8只動物，在0天和21天時雙側(cè)肌肉注射上述四種復(fù)制子疫苗(每條腿100μL)，共采用兩種劑量(1.0和0.1μg)，復(fù)制子按照方法(D)進行脂質(zhì)體包封，但批次大小為150μgRNA。對照組分別接受輔以明礬佐劑的RSV-F亞單位蛋白疫苗(5μg)(每組8只動物)、表達全長VRP的RSV-F(1x106IU，每組8只動物)，或是未經(jīng)免疫處理(每組4只動物)。在0天、21天和34天時取血清進行抗體分析。21天和34天時的F-特異性血清IgG效價及RSV血清中和抗體效價如下：本試驗研究的所有四種復(fù)制子(vA317、vA318、vA142、vA140)以脂質(zhì)體形式給藥在棉鼠中都呈現(xiàn)免疫原性，盡管其血清中和效價比含佐劑的蛋白疫苗或VRP所誘導的至少低10倍。脂質(zhì)體/RNA疫苗誘導在第一次疫苗接種后誘導了F-特異性IgG和RSV中和抗體，第二次接種有效加強了應(yīng)答。第二次接種采用1μg復(fù)制子劑量比0.1μg劑量得到的F-特異性IgG效價高2-3倍。四種復(fù)制子誘導的抗體效價水平相當，說明無論有沒有融合肽，全長和截短的RSV-F在棉鼠中免疫原性相似。進一步的棉鼠試驗采用了vA317、vA318和vA142復(fù)制子。棉鼠，每組2-8只動物，在0天和21天時雙側(cè)肌肉注射(每條腿100μL)RV01脂質(zhì)體包封的復(fù)制子(0.1或1μg)，包封物根據(jù)方法(D)制得，但批次大小為150μgRNA量。對照組接受輔以明礬佐劑的RSV-F亞單位蛋白疫苗(5μg)，或表達全長RSV-F的VRP(1x106IU，每組8只動物)。所有這些動物在第56天用輔以明礬佐劑的RSV-F亞單位蛋白疫苗(5μg)進行第三次疫苗接種。另設(shè)一組未經(jīng)免疫處理的對照(每組4只動物)。此外另加一組在0天和56天時接受雙側(cè)肌肉注射(每條腿50μL)1μgvA317RNA脂質(zhì)體，但不作第三次的亞單位蛋白疫苗接種。在0天、21天、35天、56天、70天時取血清進行抗體分析，增加的一組另加14天、28天和42天的分析。F-特異性血清IgG效價(GMT)如下：血清中和效價如下(每組內(nèi)分兩批各取3-4只小鼠所測得的60％RSV中和效價，每組中兩批的GMT值)：增加組的血清效價和中和效價如下：由此證實這些復(fù)制子在棉鼠中具有免疫原性，在第一次接種疫苗后可誘導F-特異性IgG和RSV中和抗體。第二次接種有效加強了應(yīng)答。第二次接種采用1μg復(fù)制子劑量比0.1μg劑量得到的F-特異性IgG效價高1.5-4倍。對作過F三聚體亞單位+明礬注射的棉鼠進行第三次接種疫苗(蛋白，56天時)，效價未得到增強，但其確實可以大大增加先前注射過復(fù)制子疫苗的棉鼠的效價。多數(shù)情況下，經(jīng)兩次復(fù)制子疫苗注射再加上蛋白加強免疫，RSV血清中和效價等于或高于兩次或三次蛋白疫苗注射所誘導的效價。本研究還評價了1.0μgvA317誘導抗體應(yīng)答的動力學。單次疫苗接種所誘導的F-特異性血清IgG效價和RSV中和效價在21天左右達到峰值，并至少保持到56天(F-特異性IgG效價降低50-70％，RSV中和效價幾乎不變)。56天時對這些動物進行相同的第二次接種，抗體效價增加到至少與21天作第二次疫苗注射的水平相等。進一步實驗有關(guān)于病毒刺激。vA368復(fù)制子編碼野生型RSV全長度表面融合糖蛋白，其融合肽被去除，表達由EV71IRES啟動。棉鼠，每組7只，在0天和21天時雙側(cè)肌肉注射(每條腿100μL)脂質(zhì)體包封的vA368或者帶有同樣復(fù)制子的VRP。包封物按方法(H)制得，但一批的RNA量是175μg。還設(shè)置了接受5μg含明礬佐劑蛋白和未經(jīng)免疫處理的對照組。所有組在最后一次免疫接種4周后接受1x106PFURSV鼻腔刺激(i.n.)。在0天、21天、35天時取血清進行抗體分析。在刺激后第5天測定肺部病毒效價。結(jié)果如下：可見RNA疫苗使肺部病毒負荷降低了三個數(shù)量級：從未接種對照棉鼠的約106PFU/g到接種棉鼠的少于103PFU/g。大型哺乳動物研究大型動物研究用牛來進行。小牛(4-6周齡，約60-80kg,每組5只)在0天、21天、86天和146天時，以66μg編碼全長度RSVF蛋白的vA317復(fù)制子注射免疫。復(fù)制子被包封在脂質(zhì)體內(nèi)。單獨注射PBS作為陰性對照，獲批準的商品疫苗作為陽性對照(來自富道公司(FortDodge)的“Triangle4”，含有滅活的病毒)。所有小牛在146天時接受含MF59佐劑的15μgF蛋白乳液注射。一只奶牛在86天時被誤用了錯的疫苗而非Triangle4，故其數(shù)據(jù)從100天起被排除在外。RNA疫苗編碼人類RSVF而“Triangle4”一名含牛RSVF，但RSVF在BRSV之間HRSV呈高度保守。脂質(zhì)體按方法(E)制備，但是使用1.5mgRNA的批次大小。牛接受了2ml的各試驗疫苗，在頸部兩側(cè)肌肉各注射1ml。作為對比，在頸部單次注射2ml的“Triangle4”疫苗。在0、14、21、35、42、56、63、86、100、107、114、121、128、135、146、160、167、174、181、188、195和202天時取血清進行抗體分析。如果單個動物的效價低于檢測限，則將其定為效價＝5。圖14A顯示在前63天里F-特異性IgG效價。RNA復(fù)制子脂質(zhì)體的形式對奶牛有免疫原性，盡管其效價低于商品疫苗。所有接受疫苗的奶牛在第二次接種后出現(xiàn)F-特異性抗體，而且其效價在第二次接種后的2-6周之間很穩(wěn)定(RNA疫苗特別穩(wěn)定)。圖14B顯示210天里F-特異性血清IgG效價(GMT)，測定到202天為止的數(shù)據(jù)如下：RSVP血清中和抗體效價如下：用于第二次脂質(zhì)體給藥的材料不是新鮮制作的，小鼠免疫原性研究顯示同批次的RNA有效力降低的現(xiàn)象。因此有可能如果使用的所有疫苗材料都是新鮮的，疫苗免疫原性將會更強。當進行補體測試時，在所有接種疫苗的奶牛中檢測到中和抗體。該項測試中，所有接種疫苗的牛在第二次RNA接種后顯示很好的中和抗體水平。此外，幾只牛在第二次接種后、所有牛在第三次接種后，檢測到RNA疫苗誘導的F-特異性血清IgG效價。含MF59佐劑的RSV-F能加強所有先前經(jīng)疫苗接種的牛的IgG應(yīng)答，能加強先前經(jīng)RNA疫苗接種的牛的補體非依賴中和抗體。以往曾發(fā)現(xiàn)，基于DNA的疫苗當被從小型動物模型轉(zhuǎn)移至大一些的動物或人類時有效力喪失的現(xiàn)象，因而對RNA疫苗在大型動物上進行概念驗證顯得特別重要。用于奶牛的典型的DNA疫苗劑量是0.5-1mg[47,48]，所以僅僅66μg的RNA就能誘導出免疫應(yīng)答的結(jié)果很令人鼓舞。應(yīng)該理解本發(fā)明只是以實例的方式加以描述，可在本發(fā)明范圍和精神內(nèi)進行修改。表1：有用的磷脂參考文獻：[1].Johanning等(1995)NucleicAcidsRes23:1495-1501.[2].Heyes等(2005)JControlledRelease107:276-87.[3].WO2005/121348.[4].Liposomes:MethodsandProtocols,(《脂質(zhì)體：方法和方案》)第1卷:PharmaceuticalNanocarriers:MethodsandProtocols.(藥物納米載體：放馬和方案)(Weissig編).休曼出版社(HumanaPress),2009.ISBN160327359X.[5].LiposomeTechnology,(《脂質(zhì)體技術(shù)》)第I、II和III卷.(Gregoriadis編輯).印富瑪健康護理公司(InformaHealthcare),2006.[6].FunctionalPolymerColloidsandMicroparticlesvolume4(Microspheres,microcapsules&liposomes)(《功能聚合物膠體和微顆?！?第4卷(微團、微膠囊和脂質(zhì)體).(Arshady和Guyot編輯).辭塔斯圖書公司(CitusBooks),2002.[7].Jeffs等(2005)PharmaceuticalResearch22(3):362-372.[8].PolymersinDrugDelivery.(《藥物遞送中的聚合物》)(Uchegbu和Schatzlein編).CRC出版社,2006.[9].MicroparticulateSystemsfortheDeliveryofProteinsandVaccines.(《用于蛋白和疫苗遞送的微粒系統(tǒng)》)(Cohen和Bernstein編).CRC出版社,1996.[10].O’Hagan等(2001)JVirology75:9037-9043.[11].Singh等(2003)Phar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