本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副豬嗜血桿菌病疫苗。
背景技術(shù)：
豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是豬Glasser's病的病原體，引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。國外對HPS流行病學(xué)調(diào)查表明，臨床病豬的分離率高達20％左右。隨著我國集約化豬場的發(fā)展，副豬嗜血桿菌病的發(fā)生呈上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，是近年來嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的細菌性傳染病之一。副豬嗜血桿菌至少有15個血清型，不同國家或地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型不同，不同血清型的致病性和免疫學(xué)特性差異顯著。目前，已經(jīng)證實副豬嗜血桿菌在我國絕大多數(shù)豬場存在和流行。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種副豬嗜血桿菌病疫苗，從而彌補現(xiàn)有疫苗的不足。
本發(fā)明提供一種副豬嗜血桿菌病疫苗，其中抗原為滅活的副豬嗜血桿菌血清12型YBH12株；
其中副豬嗜血桿菌YBH12株(Haemophilus parasuis YBH12)，于2016年11月10日保藏在中國武漢、武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016636。
上述的滅活疫苗，其中細菌抗原的滅活采用甲醛滅活；
本發(fā)明的滅活疫苗的制備方法如下：
1)油相：MONTANIDETM ISA 201 VG佐劑；
2)水相制備：將純粹檢驗合格的YBH12株抗原，將菌泥分別重懸于適量滅菌的生理鹽水中，均稀釋至4.0×109CFU/ml滅活后，檢驗合格后，作為抗原。
3)乳化
水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘。
4)分裝 定量分裝，加蓋密封，并粘貼標簽，置2～8℃保存。本發(fā)明的疫苗所使用的副豬嗜血桿菌血清12型YBH12株的毒力強高、免疫原性好并具有較好的交叉保護性。本發(fā)明制備的疫苗的安全性良好，未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。保存期試驗中經(jīng)過性狀、安全性試驗、效力試驗數(shù)據(jù)的分析，各項指標均穩(wěn)定有效；效力試驗結(jié)果證明，YBH12株產(chǎn)生抗體快，重要的是免疫后能夠抵御流行株的保護。
具體實施方式
申請人篩選獲得了一株副豬嗜血桿菌血清12型YBH12株，將菌株制備成滅活疫苗，從而促成了本發(fā)明。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
實施例1：副豬嗜血桿菌血清12型YBH12株的篩選
1.流行病學(xué)調(diào)查自2008年以來，我們對副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)進行調(diào)查，并對部分豬場進行跟蹤調(diào)查。調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清4、5、12、13型是目前流行血清型。而4、5、13型均已篩選出適宜的制苗菌株，而且三價滅活疫苗已有研制；但副豬嗜血桿菌血清12型的菌株還未進行篩選。
2.細菌分離采集疑似病豬的肺臟、胸腹腔積液、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液和腦組織等病料，接種TSA培養(yǎng)基，于5％CO2條件下，37℃培養(yǎng)24～48h，挑取單個菌落，進行培養(yǎng)并鑒定。
3.細菌鑒定
3.1形態(tài)觀察取疑似菌落，涂片后革蘭氏染色鏡檢，觀察其細菌形態(tài)。
3.2生化特性鑒定取疑似菌落按常規(guī)進行溶血性試驗、尿素酶試驗、氧化酶試驗、V-P試驗、接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、衛(wèi)星生長試驗；糖發(fā)酵試驗，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖。同時用HPS 12型國際參考菌株作對照菌株，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。
3.3PCR鑒定根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計引物，引物為(F：5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT–3’，R：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT–3’)。對分離到的疑似HPS分離菌株進行PCR鑒定，PCR擴增的產(chǎn)物應(yīng)為822bp大小的片段。
3.4血清學(xué)特性鑒定采用瓊脂擴散試驗對副豬嗜血桿菌分離菌株進行血清型鑒定。
4.毒力試驗將分離的10株血清12型副豬嗜血桿菌分別腹腔注射8～10周齡健康易感仔豬各5頭，3.0ml/頭(活菌量均約為5.0×109CFU)，另取5頭不攻毒作為對照。連續(xù)觀察14日，記錄試驗豬的發(fā)病及死亡情況。
5.免疫原性根據(jù)毒力試驗結(jié)果，將篩選的毒力較強的YBH12株分離菌株菌液分別調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價滅活疫苗，肌肉注射3～5周齡仔豬，2.0ml/頭，每組5頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬采血并分離血清，使用微量凝集方法測定血清的抗體效價；并分別用本菌株進行腹腔注射攻毒(活菌量均約為6.0×109CFU)。觀察試驗豬的發(fā)病及死亡情況，比較不同菌株對豬的免疫原性。試驗結(jié)果表明，微量凝集抗體為5/5大于等于1:32；免疫組為5/5保護，對照組為5/5發(fā)病。
6.交叉攻毒保護根據(jù)毒力試驗結(jié)果，將篩選的毒力較強的YBH12株分離菌株菌液調(diào)整至2.0×109CFU/ml，甲醛滅活后與201佐劑按質(zhì)量比1:1混合乳化，制備單價滅活疫苗，腿部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有仔豬分別用分離的10株同型菌株進行攻毒(6.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗仔豬的發(fā)病及死亡情況。試驗結(jié)果表明，YBH12株疫苗制備的單價滅活疫苗，能抵御YBH12株及其他9株分離株的攻擊，攻毒保護率均為5/5，具有較好的交叉攻毒保護力。
實施例2：副豬嗜血桿菌血清12型YBH12株抗原的制備
1.菌液培養(yǎng) 采用發(fā)酵罐對YBH12株進行培養(yǎng)：按發(fā)酵罐容積的60％～80％加入TSB培養(yǎng)基，同時加入消泡劑，通入高壓蒸汽進行滅菌，待其溫度降至37～38℃時，分別加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二級種子液進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度36～37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100r/min、pH值7.2～7.4，整個培養(yǎng)過程通過調(diào)節(jié)進氣量來控制溶氧量為60％～80％，菌液培養(yǎng)14小時后，取樣進行活菌計數(shù)和純粹檢驗。分別將發(fā)酵完成的菌液，導(dǎo)入柱式離心機離心，收獲菌泥，置于2～8℃保存，不超過48小時。
2.滅活 根據(jù)活菌計數(shù)結(jié)果，將菌泥重懸于適量滅菌的生理鹽水中，稀釋至4.0×109CFU/ml，分別計量加入10％甲醛溶液，使其終濃度為0.2％，37℃攪拌滅活16小時，進行滅活檢驗，其余菌液置2～8℃保存，不超過14日。
3.半成品檢驗
3.1純粹檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
3.2活菌計數(shù) 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行計數(shù)。
3.3滅活檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗。
實施例3：疫苗的制備
1水相配制 檢驗合格的YBH12株抗原。
2油相 MONTANIDETM ISA 201VG佐劑(以下簡稱201佐劑)。
3乳化 水相和油相預(yù)熱至31℃，按質(zhì)量比1:1混合，4000r/min攪拌30～40分鐘。
3分裝 定量分裝，加蓋密封，并粘貼標簽，置2～8℃保存。
4成品檢驗
4.1性狀
外觀 乳白色乳劑。
劑型 水包油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，應(yīng)呈云霧狀擴散。
穩(wěn)定性 吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不大于0.5ml。
黏度 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，應(yīng)符合規(guī)定。
4.2裝量檢查 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)符合規(guī)定。
4.3無菌檢驗 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。
4.4安全檢驗 用3～5周齡健康易感仔豬5頭，每頭頸部肌肉注射疫苗4.0ml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)因疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)。
4.5效力檢驗
4.5.1血清學(xué)方法 取3～5周齡健康易感仔豬10頭，其中5頭頸部肌肉注射疫苗2.0ml/頭，其余5頭作非免疫對照。一次免疫后21日，按相同劑量和相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日對所有仔豬采血并分離血清，檢測HPS 4、5、13型抗體效價。免疫組至少4頭仔豬的血清12型抗體效價均應(yīng)≥1:32，對照組仔豬的血清12型抗體效價均應(yīng)≤1:4。
4.5.2免疫攻毒法 用3～5周齡健康易感仔豬10頭，隨機分為A、B兩組，每組5頭，其中A組為免疫組，均頸部肌肉注射疫苗，2.0ml/頭，B組為非免疫對照組，均頸部肌肉注射生理鹽水，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同方法和相同劑量進行二次免疫，二次免疫后14日進行攻毒。A、B組試驗豬腹腔注射YBH12株菌液3.0ml(活菌量約為6.0×109CFU/頭)；。觀察14日，免疫組豬均應(yīng)至少4頭保護，對照組豬均應(yīng)至少4頭發(fā)病。
實施例4：免疫交叉保護試驗
用YBH12株制備的滅活疫苗，腿部肌肉注射仔豬，2.0ml/頭。一次免疫后21日按相同劑量相同方法進行二次免疫，二次免疫后14日所有免疫仔豬分別用分離的10株同型菌株進行攻毒(6.0×109CFU)。觀察14日，記錄試驗仔豬的發(fā)病及死亡情況。攻毒后，免疫組仔豬均未發(fā)病或死亡，均5/5保護；而對照組仔豬，均4/5-5/5發(fā)病。表明YBH12株所制備的副豬嗜血桿菌滅活疫苗能抵御YBH12株及各地方分離株的攻擊而起到保護作用。詳細結(jié)果見表1。
并且，用目前市場上出售的副豬嗜血桿菌疫苗進行免疫，再用本發(fā)明篩選的YBH12株進行攻毒實驗；結(jié)果表明目前市場上出售的疫苗的免疫效果遠低于本發(fā)明YBH12株制成的滅活疫苗的效果。
表1：YBH12株疫苗對不同菌株的免疫交叉保護試驗結(jié)果
并且，血清12型是當(dāng)前臨床上流行的主要血清型之一；而目前市場上尚無該血清型的疫苗出售。本發(fā)明的試驗結(jié)果表明，血清型YBH12株具有良好的毒力和免疫原性，是制備疫苗的良好選擇。