政府資助本發(fā)明由美國政府部門疾病控制和預(yù)防中心(CentersforDiseaseControlandPrevention)完成。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年5月12日提交的美國臨時(shí)申請No.61/177,393的優(yōu)先權(quán)，所述申請以引用的方式全文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及病毒疫苗株及其相關(guān)疫苗組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及引起受試者體內(nèi)對輪狀病毒A的免疫反應(yīng)的人輪狀病毒A疫苗株、疫苗組合物和使用方法。
背景技術(shù)：
：在多種引起兒童嚴(yán)重腹瀉的腸道病原性病毒中，輪狀病毒是最常見的，它導(dǎo)致每年平均611,000例死亡。幾乎所有兒童在5歲前都會(huì)被輪狀病毒感染。所述病毒被認(rèn)為是高度傳染性的，并被描述為“平等”病毒，因?yàn)槠涓腥镜挠绊憶]有特別的社會(huì)經(jīng)濟(jì)或地理群的差異。盡管大部分兒童能夠得到足夠的支持性和緩解性醫(yī)療護(hù)理，挺過感染而不出現(xiàn)明顯的長期后果，然而與嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和休克有關(guān)的死亡數(shù)目是不能接受的，并且在可能的情況下需要預(yù)防性干預(yù)。輪狀病毒A是一種具有特有輻射狀形態(tài)的呼腸孤病毒科(reoviridae)的二十面體病毒。具體輪狀病毒根據(jù)病衣殼蛋白的特征按群(group)、亞群(subgroup)和血清型分類。輪狀病毒顆粒含有圍繞病毒基因組的3個(gè)蛋白層，所述病毒基因組由11段雙鏈RNA組成，每段編碼一個(gè)蛋白。所述病毒蛋白包括稱為VP的結(jié)構(gòu)蛋白和稱為NSP的非結(jié)構(gòu)蛋白。若干結(jié)構(gòu)蛋白對引發(fā)宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)特別重要，因?yàn)檫@些蛋白位于所述病毒顆粒的最外層上。具體而言，蛋白VP7和VP4均在很大程度上參與宿主免疫反應(yīng)，并因此還在輪狀病毒疫苗的開發(fā)中起中心作用。VP7和VP4結(jié)構(gòu)蛋白的變體可表征不同的輪狀病毒A血清型。具體而言，人VP7的變體被確定為“G”血清型，至少包括血清型G1、G2、G3、G4以及較少見的G5、G6、G8、G9、G10、G11、G12、G13和G14。VP4結(jié)構(gòu)蛋白的變體被確定為“P”血清型，包括P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6和P8。由于完整的輪狀病毒同時(shí)為VP7蛋白和VP4蛋白所表征，因此各個(gè)病毒血清型根據(jù)具體病毒中包含的這兩種蛋白的變體特性而命名。例如，常見的輪狀病毒A同時(shí)包含G1和P[8]變體，它們分別是VP7和VP4的變體。輪狀病毒A的G1,P[8]血清型是在全世界引起疾病的最常見病毒形式之一。輪狀病毒A的G1血清型是在全世界與人疾病有關(guān)的最常見血清型。已經(jīng)開發(fā)出若干使用輪狀病毒AG1株的疫苗，目的是在宿主中形成對輪狀病毒AG1株以及具有其他血清型的輪狀病毒A株的免疫性。然而，此方法受到G1和G2血清型之間重大不同的限制。具體而言，輪狀病毒AG2株來源于與大多數(shù)其他輪狀病毒株不同的世系。這被核酸雜交實(shí)驗(yàn)證明，所述實(shí)驗(yàn)顯示被稱為DS-1遺傳組的G2株的11個(gè)基因區(qū)段的標(biāo)記轉(zhuǎn)錄物不與包括G1、G3、G4和G9的被稱為Wa遺傳組的輪狀病毒A株中的相應(yīng)核酸雜交。這些同源基因無法雜交表明例如外衣殼蛋白VP4和VP7以及內(nèi)衣殼蛋白VP6的編碼蛋白的差異是顯著的。這些遺傳差別支持以下觀點(diǎn)：使用G1株感染或免疫的個(gè)體不太可能表現(xiàn)出對Wa遺傳組的其他病毒株那樣的對G2株的交叉保護(hù)。除了常見的G1和G2輪狀病毒A株以外，人們逐漸認(rèn)識(shí)到人輪狀病毒類型的多樣性是造成全世界急性嚴(yán)重腹瀉疾病的原因。這種多樣性突出了對能夠?qū)θ舾芍戤a(chǎn)生免疫性的強(qiáng)效疫苗的要求。最近，美國食品和藥物管理局因其制品中有污染物而暫停了ROTARIX疫苗的使用。因此，當(dāng)輪狀病毒感染仍是一個(gè)嚴(yán)重的世界性問題的時(shí)候，可用的輪狀病毒疫苗的數(shù)量卻減少了。另一種疫苗對于防止中、高收入國家兒童腹瀉似乎是安全和有效的，目前已被授權(quán)并推薦用于全世界的嬰幼兒。然而，此疫苗在亞非低收入國家的功效降低。因此，仍需要針對常見和不太常見類型的人輪狀病毒A的疫苗。附圖說明圖1A是電子顯微照片的復(fù)本，示出了完整的分離輪狀病毒A病毒粒子，該病毒粒子被確定為具有血清型P[8],G1的病毒株CDC-9。圖1B是電子顯微照片的復(fù)本，示出了完整的分離輪狀病毒A病毒粒子，該病毒粒子被確定為具有血清型P[4],G2的病毒株CDC-66。圖2是聚丙烯酰胺凝膠圖像的副本，示出了從糞便樣本(S)和Vero細(xì)胞(V)分離的輪狀病毒A株CDC-9的RNA譜，并示出了該輪狀病毒株的典型長RNA的電泳型。圖3是聚丙烯酰胺凝膠圖像的復(fù)本，示出了從糞便樣品(S)和Vero細(xì)胞(V)分離的輪狀病毒A株CDC-66的RNA譜，并示出了該輪狀病毒株的典型短RNA的電泳型。圖4A示出了CsCl純化的輪狀病毒A株CDC-9的輪狀病毒顆粒的帶。圖4B示出了輪狀病毒A株CDC-9的確定結(jié)構(gòu)病毒蛋白，通過SDS-PAGE分析，與分子量標(biāo)記對比。圖5A是柱形圖，示出了對照和接種小鼠中對熱滅活的輪狀病毒的總抗體滴度。圖5B是柱形圖，示出了對照和接種小鼠中對熱滅活的輪狀病毒的中和抗體滴度。圖6是柱形圖，示出了在對照和接種小鼠中對與Al(OH)3配制的熱滅活的輪狀病毒的總血清抗體滴度。圖7A示出了用無抗原的750微克磷酸鋁接種的4只小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7B示出了用無佐劑的抗原免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7C示出了用抗原和佐劑免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7D示出了在只用緩沖液免疫的小豬的糞便樣品中測得的病毒脫落。圖8A是柱形圖，示出了在用無抗原的600微克磷酸鋁(實(shí)心柱)接種的小豬或者用50微克抗原和600微克磷酸鋁(陰影柱)接種的小豬的血清中的輪狀病毒特異性IgG抗體反應(yīng)。圖8B是柱形圖，示出了在用無抗原的600微克磷酸鋁接種的小豬或者用50微克抗原和600微克磷酸鋁接種的小豬的血清中的中和抗體反應(yīng)。圖9A示出了用無抗原的600微克磷酸鋁接種的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖9B示出了用50微克抗原和600微克磷酸鋁接種的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種疫苗組合物，包括一種或多種分離輪狀病毒株例如株CDC-9或CDC-66和可藥用載體。本發(fā)明的疫苗任選包括佐劑。本發(fā)明疫苗中的CDC-9或CDC-66株任選是減毒活輪狀病毒或者滅活輪狀病毒。應(yīng)理解，本發(fā)明的疫苗任選包括至少兩種分離輪狀病毒株。所述至少兩種分離輪狀病毒株各自獨(dú)立地具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14的G群血清型。任選地，所述至少兩種分離輪狀病毒株各自獨(dú)立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。本發(fā)明的疫苗任選非經(jīng)腸給藥或經(jīng)口給藥。本發(fā)明還提供分離的輪狀病毒株，例如CDC-9或CDC-66株。本發(fā)明提供了一種疫苗，其包含與可藥用載體混合的特征在于具有G1群血清型的分離輪狀病毒株和特征在于具有G2群血清型的輪狀病毒株。所述G1或G2群血清型病毒株任選各自獨(dú)立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。在某些實(shí)施方案中，所述特征在于具有G1群血清型的人輪狀病毒株是CDC-9，所述特征在于具有G2群血清型的人輪狀病毒株是CDC-66。本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應(yīng)的方法，包括給予疫苗組合物，所述疫苗組合物包含與可藥用載體混合的分離人輪狀病毒株CDC-9或CDC-66。本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應(yīng)的方法，其包括給予疫苗組合物，所述疫苗組合物包含與可藥用載體混合的特征在于具有G1群血清型的分離人輪狀病毒株和特征在于具有G2群血清型的分離人輪狀病毒株。本發(fā)明還提供了一種疫苗，所述疫苗包含與可藥用載體混合的分離人輪狀病毒的一部分。所述分離人輪狀病毒的一部分是肽或多肽，所述肽或多肽包括SEQIDNo.2；SEQIDNo.5；SEQIDNo.8；SEQIDNo.11；SEQIDNo.14；SEQIDNo.17；SEQIDNo.20；SEQIDNo.23；SEQIDNo.26；SEQIDNo.29；SEQIDNo.32；SEQIDNo.3；SEQIDNo.6；SEQIDNo.9；SEQIDNo.12；SEQIDNo.15；SEQIDNo.18；SEQIDNo.21；SEQIDNo.24；SEQIDNo.27；SEQIDNo.30；SEQIDNo.33；SEQIDNo.71；SEQIDNo.77；SEQIDNo.83；SEQIDNo.89；SEQIDNo.95；SEQIDNo.101；SEQIDNo.107；SEQIDNo.113；SEQIDNo.119；SEQIDNo.125；SEQIDNo.131；SEQIDNo.72；SEQIDNo.78；SEQIDNo.84；SEQIDNo.90；SEQIDNo.96；SEQIDNo.102；SEQIDNo.108；SEQIDNo.114；SEQIDNo.120；SEQIDNo.126；SEQIDNo.132的氨基酸序列；其同源物或其片段。具體實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供了新的分離人輪狀病毒A株、包含人輪狀病毒A株的疫苗、包含人輪狀病毒A多肽和/或其免疫原性片段的疫苗、抗輪狀病毒A抗體和接種人對抗輪狀病毒A疾病的方法。本文使用的科技術(shù)語意圖具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。這些術(shù)語在多本教科書/參考書的上下文中有定義并被使用，包括例如，這些J.SambrookandD.W.Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress；3rdEd.,2001；F.M.Ausubel,Ed.,ShortProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols；5thEd.,2002；B.Albertsetal.,MolecularBiologyoftheCell,4thEd.,Garland,2002；D.L.NelsonandM.M.Cox,LehningerPrinciplesofBiochemistry,4thEd.,W.H.Freeman&Company,2004；Wild,D.,TheImmunoassayHandbook,3rdEd.,ElsevierScience,2005；Gosling,J.P.,Immunoassays:APracticalApproach,PracticalApproachSeries,OxfordUniversityPress,2005；AntibodyEngineering,Kontermann,R.andS.(Eds.),Springer,2001；Harlow,E.andLane,D.,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988；Ausubel,F.etal.,(Eds.),ShortProtocolsinMolecularBiology,Wiley,2002；J.D.Pound(Ed.)ImmunochemicalProtocols,MethodsinMolecularBiology,HumanaPress；2nded.,1998；B.K.C.Lo(Ed.),AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,MethodsinMolecularBiology,HumanaPress,2003；和Kohler,G.andMilstein,C,Nature,256:495-497(1975)，這些教科書/參考書的內(nèi)容均以引用的方式納入本文。人輪狀病毒本發(fā)明的新的人輪狀病毒A株例如被確定為CDC-9和CDC-66、其片段或其同源物。CDC-9輪狀病毒A株從Providence,RhodeIsland的5月齡男孩的糞便樣品中分離。人輪狀病毒株CDC-9通過使用G-和P-型特異性引物的RT-PCR表征。RT-PCR分析表明分離的病毒株CDC-9是具有基因型(genotype)P[8],G1的病毒株。Esona,MD,etal.,HumanVaccines,2010；6:1-7描述了CDC-9的具體特征，其鑒定、分離和在Vero細(xì)胞中的傳代，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用的方式納入本文。從糞便樣品分離后，使分離輪狀病毒株CDC-9適應(yīng)在MA104細(xì)胞中生長，MA104細(xì)胞在1980年之前制備和冷凍并有完備的記錄。然后，使CDC-9病毒株適應(yīng)在可用于疫苗生產(chǎn)的Vero細(xì)胞中生長。將CDC-9通過進(jìn)行3輪有限稀釋純化，并且在Vero細(xì)胞中擴(kuò)增后通過進(jìn)行3輪噬菌斑測定進(jìn)一步純化。所分離的病毒株CDC-9分別在MA104和Vero細(xì)胞中傳7和38代(共45代)。所述適應(yīng)和全部傳代都是使用標(biāo)準(zhǔn)操作方法和合格原材料及試劑并在GoodLaboratoryPracticeGuidelines指導(dǎo)下完成。與其他參考病毒株或?qū)嶒?yàn)室病毒株不同，所分離的病毒株CDC-9具有完整的傳代史和記錄。傳代的人輪狀病毒株CDC-9的滴度為約107ffu/ml。使用從感染的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基分離的CDC-9病毒粒子通過電子顯微術(shù)研究分離的人輪狀病毒株CDC-9。圖1A示出了分離CDC-9病毒粒子的電子顯微照片。所述顯微照片顯示所述病毒粒子具有人輪狀病毒A病毒粒子的典型形態(tài)。使用從人輪狀病毒株CDC-9分離的RNA的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步檢測所述分離的人輪狀病毒株。如圖2所示，CDC-9具有典型的長RNA電泳型，并且來自糞便的原始分離株和Vero傳代的輪狀病毒的RNA譜是相同的。圖2還示出了比較用標(biāo)準(zhǔn)品，包括Wa基因群(genogroup)人輪狀病毒的RNA譜。通過全基因組的序列分析分析了在糞便和Vero細(xì)胞(第27代)中的分離的人輪狀病毒株CDC-9。從糞便樣品分離的核酸編碼的蛋白的CDC9氨基酸序列：CDC9NSP1aa-糞便是SEQIDNo.2；CDC9NSP2aa-糞便是SEQIDNo.5；CDC9NSP3aa-糞便是SEQIDNo.8；CDC9NSP4aa-糞便是SEQIDNo.11；CDC9NSP5aa-糞便是SEQIDNo.14；CDC9VP1aa-糞便是SEQIDNo.17；CDC9VP2aa-糞便是SEQIDNo.20；CDC9VP3aa-糞便是SEQIDNo.23；CDC9VP4aa-糞便是SEQIDNo.26；CDC9VP6aa-糞便是SEQIDNo.29；CDC9VP7aa-糞便是SEQIDNo.32。從糞便樣品分離的核酸的CDC9核苷酸序列：CDC9NSP1nt-糞便是SEQIDNo.35；CDC9NSP2nt-糞便是SEQIDNo.38；CDC9NSP3nt-糞便是SEQIDNo.41；CDC9NSP4nt-糞便是SEQIDNo.44；CDC9NSP5nt-糞便是SEQIDNo.47；CDC9VP1nt-糞便是SEQIDNo.50；CDC9VP2nt-糞便是SEQIDNo.53；CDC9VP3nt-糞便是SEQIDNo.56；CDC9VP4nt-糞便是SEQIDNo.59；CDC9VP6nt-糞便是SEQIDNo.62；CDC9VP7nt-糞便是SEQIDNo.65。從分離自Vero細(xì)胞的第27代CDC9輪狀病毒分離的核酸編碼的蛋白的CDC9氨基酸序列：CDC9NSP1aa-Vero是SEQIDNo.3；CDC9NSP2aa-Vero是SEQIDNo.6；CDC9NSP3aa-Vero是SEQIDNo.9；CDC9NSP4aa-Vero是SEQIDNo.12；CDC9NSP5aa-Vero是SEQIDNo.15；CDC9VPlaa-Vero是SEQIDNo.18；CDC9VP2aa-Vero是SEQIDNo.21；CDC9VP3aa-Vero是SEQIDNo.24；CDC9VP4aa-Vero是SEQIDNo.27；CDC9VP6aa-Vero是SEQIDNo.30；CDC9VP7aa-Vero是SEQIDNo.33。從分離自Vero細(xì)胞的第27代CDC9輪狀病毒分離的核酸的CDC9核苷酸序列：CDC9NSP1nt-Vero是SEQIDNo.36；CDC9NSP2nt-Vero是SEQIDNo.39；CDC9NSP3nt-Vero是SEQIDNo.42；CDC9NSP4nt-Vero是SEQIDNo.45；CDC9NSP5nt-Vero是SEQIDNo.48；CDC9VP1nt-Vero是SEQIDNo.51；CDC9VP2nt-Vero是SEQIDNo.54；CDC9VP3nt-Vero是SEQIDNo.57；CDC9VP4nt-Vero是SEQIDNo.60；CDC9VP6nt-Vero是SEQIDNo.63；CDC9VP7nt-Vero是SEQIDNo.66。如本文所示的，將從糞便和感染的培養(yǎng)物分離的CDC-9輪狀病毒的全基因組的核苷酸和氨基酸序列與從輪狀病毒A的參考KU病毒株或其他G1P8病毒株的全基因組的氨基酸和核苷酸序列進(jìn)行比較。此外，如表2所示，CDC-9基因(除了區(qū)段3)與原型P[8],G1人KU病毒株的相應(yīng)基因具有高度序列同一性。表2.輪狀病毒株CDC-9基因區(qū)段與原型輪狀病毒株KU的同族基因序列(cognategenesequence)相比的核苷酸(NT)和推定氨基酸(AA)的同一性百分比此外，如表3所示，記錄了從糞便到Vero細(xì)胞中第27代的CDC-9病毒株的全基因組的nt和aa序列變化。表3.從糞便到Vero細(xì)胞中第27代的CDC-9的基因的nt和aa變化在Vero細(xì)胞中分離的輪狀病毒CDC-9是具有KU樣病毒株的全部基因(除了區(qū)段3)的重配株。CDC-9具有來源于DS-1樣病毒株的區(qū)段3，因?yàn)镃DC-9VP3與DS-1病毒株的同族基因具有高度同一性。此重配株可能在自然感染過程中產(chǎn)生，或者在糞便樣品中的G1P8和G2P4輪狀病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中適應(yīng)和傳代時(shí)產(chǎn)生。輪狀病毒VP3被描述為具有鳥苷轉(zhuǎn)移酶(guanyltransferase)，并可參與病毒復(fù)制和形態(tài)發(fā)生。CDC-66輪狀病毒A株從Providence,RhodeIsland的11月齡女孩的糞便樣品中分離。人輪狀病毒株CDC-66使用G-和P-型特異性引物通過RT-PCR表征。RT-PCR分析表明，分離的病毒株CDC-66是具有血清型P[4],G2的病毒株。從糞便樣品分離后，使分離的輪狀病毒株CDC-66適應(yīng)在MA104細(xì)胞中生長，MA104細(xì)胞在1980年之前制備和冷凍并有完整的傳代史和記錄。然后使CDC-66病毒株適應(yīng)在可用于疫苗生產(chǎn)的Vero細(xì)胞中生長。將CDC-66通過進(jìn)行3輪有限稀釋純化，并且在Vero細(xì)胞中擴(kuò)增后通過進(jìn)行3輪噬菌斑測定進(jìn)一步純化。所分離的病毒株CDC-66分別在MA104和Vero細(xì)胞中傳5和40代(共45代)。所述適應(yīng)和全部傳代都是使用標(biāo)準(zhǔn)操作方法和合格原材料及試劑并在GoodLaboratoryPracticeGuidelines指導(dǎo)下完成。與其他參考病毒株和實(shí)驗(yàn)室病毒株不同，所分離的病毒株CDC-66具有完整的傳代史和記錄。傳代的人輪狀病毒株CDC-66的滴度為約107pfu/ml。使用從感染的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基分離的CDC-66病毒粒子通過電子顯微術(shù)研究了分離的人輪狀病毒株CDC-66。圖1B示出了分離的CDC-66病毒粒子的電子顯微照片。該顯微照片顯示所述病毒粒子具有人輪狀病毒粒子的典型形態(tài)。使用從分離的人輪狀病毒株CDC-66分離的RNA的聚丙烯酰胺凝膠電泳對所述病毒株進(jìn)一步檢測。如圖3所示，CDC-66具有典型的短RNA電泳型，并且來自糞便的原始分離株的RNA譜和Vero傳代的輪狀病毒的RNA譜是相同的。圖3還顯示了用于比較的標(biāo)準(zhǔn)物，包括最左邊泳道的DNA分子量標(biāo)記Ⅲ(Roche)和恒河猴輪狀病毒RRV的RNA譜。通過全基因組的序列分析分析了在糞便和Vero細(xì)胞(27代)中分離的人輪狀病毒株CDC-66。從糞便樣品分離的核酸編碼的蛋白的CDC66氨基酸序列：CDC66NSP1aa-糞便是SEQIDNo.71；CDC66NSP2aa-糞便是SEQIDNo.77；CDC66NSP3aa-糞便是SEQIDNo.83；CDC66NSP4aa-糞便是SEQIDNo.89；CDC66NSP5aa-糞便是SEQIDNo.95；CDC66VP1aa-糞便是SEQIDNo.101；CDC66VP2aa-糞便是SEQIDNo.107；CDC66VP3aa-糞便是SEQIDNo.113；CDC66VP4aa-糞便是SEQIDNo.119；CDC66VP6aa-糞便是SEQIDNo.125；CDC66VP7aa-糞便是SEQIDNo.131。從糞便樣品分離的核酸編碼的蛋白的CDC66核苷酸序列：CDC66NSP1nt-糞便是SEQIDNo.68；CDC66NSP2nt-糞便是SEQIDNo.74；CDC66NSP3nt-糞便是SEQIDNo.80；CDC66NSP4nt-糞便是SEQIDNo.86；CDC66NSP5nt-糞便是SEQIDNo.92；CDC66VP1nt-糞便是SEQIDNo.98；CDC66VP2nt-糞便是SEQIDNo.104；CDC66VP3nt-糞便是SEQIDNo.110；CDC66VP4nt-糞便是SEQIDNo.116；CDC66VP6nt-糞便是SEQIDNo.122；CDC66VP7nt–糞便是SEQIDNo.128。從分離自Vero細(xì)胞的第27代CDC66輪狀病毒分離的核酸編碼的蛋白的CDC-66氨基酸序列：CDC66NSP1aa-Vero是SEQIDNo.72；CDC66NSP2aa-Vero是SEQIDNo.78；CDC66NSP3aa-Vero是SEQIDNo.84；CDC66NSP4aa-Vero是SEQIDNo.90；CDC66NSP5aa-Vero是SEQIDNo.96；CDC66VP1aa-Vero是SEQIDNo.102；CDC66VP2aa-Vero是SEQIDNo.108；CDC66VP3aa-Vero是SEQIDNo.114；CDC66VP4aa-Vero是SEQIDNo.120；CDC66VP6aa-Vero是SEQIDNo.126；CDC66VP7aa-Vero是SEQIDNo.132。從分離自Vero細(xì)胞的第27代CDC66輪狀病毒分離的核酸編碼的蛋白的CDC66核苷酸序列：CDC66NSP1nt-Vero是SEQIDNo.69；CDC66NSP2nt-Vero是SEQIDNo.75；CDC66NSP3nt-Vero是SEQIDNo.81；CDC66NSP4nt-Vero是SEQIDNo.87；CDC66NSP5nt-Vero是SEQIDNo.93；CDC66VP1nt-Vero是SEQIDNo.99；CDC66VP2nt-Vero是SEQIDNo.105；CDC66VP3nt-Vero是SEQIDNo.111；CDC66VP4nt-Vero是SEQIDNo.117；CDC66VP6nt-Vero是SEQIDNo.123；CDC66VP7nt-Vero是SEQIDNo.129。如本文所示的，將從糞便和Vero細(xì)胞分離的CDC-66輪狀病毒的全氨基酸和核苷酸序列與被認(rèn)為是最接近的相關(guān)已知輪狀病毒A——人輪狀病毒DS-1病毒株——或其他密切相關(guān)病毒株的輪狀病毒A株的全氨基酸和核苷酸序列進(jìn)行對比。如表4所示，CDC-66基因與原型P[4],G2病毒株DS-1的相應(yīng)基因具有高度序列同一性。表4.輪狀病毒疫苗株CDC-66基因組與原型輪狀病毒株DS-1的基因組序列對比得到的核苷酸(NT)及推定的氨基酸(AA)的同一性百分比?；騨t％aa％VP190.8597.24VP294.1198.86VP392.995.69VP494.0296.52VP687.9898.74VP793.8896.32NSP193.1293.21NSP286.8993.99NSP395.3197.12NSP494.7695.43NSP592.5796.5如表5所示，記錄了從糞便到在Vero細(xì)胞中傳代的CDC-66病毒株的全基因組的nt和aa序列變化。表5.從糞便到Vero細(xì)胞中第27次的CDC-66的基因的nt和aa變化基因nt變化aa變化NSP1無無NSP2470C→T142H→YNSP3無無NSP4無無NSP5126T→C，199A→G60I→VVP1440A→G141N→SVP2無無VP3760T→C，1143T→C，1882A→G365L→SVP4770C→A，1109T→C，1162G→A，1184A→G254T→K，367V→A，385D→N，392E→GVP6無無VP7無無疫苗本發(fā)明提供了疫苗及用其誘導(dǎo)患者體內(nèi)對引起疾病的輪狀病毒的活性免疫與防護(hù)的方法。在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明提供用于增強(qiáng)受試者體內(nèi)對輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的免疫防護(hù)的疫苗組合物，其包括與可藥用載體混合的人輪狀病毒株。本文所用的術(shù)語“疫苗組合物”是指包括生物試劑的組合物，所述生物試劑能夠誘導(dǎo)接種所述疫苗組合物的受試者中的免疫反應(yīng)。在具體實(shí)施方案中，所述生物試劑是減毒活輪狀病毒和/或滅活輪狀病毒。在其他實(shí)施方案中，所述生物試劑是輪狀病毒的抗原性部分。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物中包括的人輪狀病毒株是CDC-9或CDC-66。本發(fā)明的疫苗組合物任選包括這些人輪狀病毒株的結(jié)合物。此外，本發(fā)明的疫苗組合物任選包括CDC-9或CDC-66以外的人輪狀病毒株。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物包括至少兩種輪狀病毒株。所述兩種或多種輪狀病毒株各自獨(dú)立地具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14的G血清型。因此，例如，本發(fā)明的疫苗組合物包含CDC-9或CDC-66的至少一種，以及至少一種具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13或G14的G血清型的第二人輪狀病毒株。在具體實(shí)施方案中，疫苗組合物包含的所述至少兩種分離輪狀病毒株各自均具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P血清型。在本發(fā)明的疫苗組合物的具體實(shí)施方案中，用于增強(qiáng)受試者體內(nèi)對輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的免疫防護(hù)的疫苗組合物包含特征在于具有G1血清型的第一人輪狀病毒株和特征在于具有G2血清型的第二人輪狀病毒株。所述兩種輪狀病毒株各自獨(dú)立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。在某些實(shí)施方案中，所述具有G1血清型的人輪狀病毒株是CDC-9。在某些實(shí)施方案中，所述具有G2血清型的人輪狀病毒株是CDC-66。在本發(fā)明的疫苗組合物的具體實(shí)施方案中，人輪狀病毒株的結(jié)合物包括CDC-9和CDC-66。本發(fā)明的疫苗組合物包含的人輪狀病毒株是減毒活輪狀病毒或滅活輪狀病毒。減毒活輪狀病毒或滅活輪狀病毒的選擇取決于某些因素，例如疫苗組合物的給藥途徑。在具體實(shí)施方案中，包含人輪狀病毒A株CDC-9和/或CDC-66、一種或多種輪狀病毒ACDC-9和/或CDC-66多肽、和/或一種或多種輪狀病毒ACDC-9和/或CDC-66多肽的免疫原性片段的疫苗組合物刺激對輪狀病毒ACDC-9和/或CDC-66病毒株的中和抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包括一種或多種輪狀病毒A多肽和/或一種或多種輪狀病毒A多肽的免疫原性片段的疫苗組合物。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗組合物包括CDC-9和/或CDC-66多肽，其同源物，和/或其免疫原性片段。術(shù)語“同源物”是指特征為氨基酸序列與參考CDC-9或CDC-66輪狀病毒A多肽同源的多肽。CDC-9序列因此，本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:2的NSP1或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:2具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:3的NSP1或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:3具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:5的NSP2或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:5具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:8的NSP3或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:8具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:11的NSP4或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:11具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:14的NSP5或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:14具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:15的NSP5或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:15具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。因此，本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:17的VP1或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:17具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:20的VP2或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:20具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:23的VP3或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:23具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:26的VP4或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:26具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:27的VP4或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:27具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:29的VP6或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:29具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:30的VP6或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:30具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:32的VP7或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:32具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。CDC-66序列本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:71的NSP1或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:71具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:77的NSP2或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:77具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:78的NSP2或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:78具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:83的NSP3或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:83具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:89的NSP4或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:89具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:95的NSP5或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:95具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:96的NSP5或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:96具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。因此，本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:101的VP1或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:101具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:102的VP1或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:102具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:107的VP2或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:107具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:113的VP3或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:113具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:114的VP3或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:114具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:119的VP4或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:119具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明還提供了一種包括具有SEQIDNO:120的VP4或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:120具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:125的VP6或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:125具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種包括具有SEQIDNO:131的VP7或其同源物的病毒，所述同源物的氨基酸序列與SEQIDNO:131具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性。本發(fā)明提供了一種分離或純化的NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、VP1、VP2、VP3、VP4、VP6或VP7。本文使用的術(shù)語“純化的”或“分離的”意圖指可與其他組分分離的組成，其中所述組成相對其天然可獲得狀態(tài)——即，在此案中，相對其在細(xì)胞內(nèi)的純度，相對其在病毒粒子內(nèi)的純度或相對其在感染生物體內(nèi)的純度——被純化至任意程度。因此，分離的組成也指基本與其天然存在的環(huán)境脫離的蛋白、肽、核酸或寡核苷酸。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，多種變體、類似物或同源物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，包括增強(qiáng)、降低或不改變本發(fā)明免疫原或疫苗的功能或免疫原特性的氨基酸置換、改變、修飾或其他氨基酸變化。還應(yīng)理解，本發(fā)明的序列任選通過加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸、糖、核苷酸、側(cè)基、熒光團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、放射活性分子、脂質(zhì)、脂肪酸、它們的衍生物或本領(lǐng)域已知的其他基團(tuán)而被修飾。例如，本發(fā)明免疫原與蛋白綴合。任選地，本發(fā)明的免疫原與促進(jìn)免疫原的免疫原性的蛋白綴合，所述蛋白例如鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或其修飾物，以及來自ThermoScientific,Rockford,IL的BLUECARRIER免疫原性蛋白。其他來源的天然或人工免疫原性蛋白綴合物是本領(lǐng)域已知的。任選地，本發(fā)明的免疫原與抗體綴合。任選地，本發(fā)明的免疫原與可以含有或不含表位的G蛋白的其他區(qū)域綴合。在某些實(shí)施方案中，所述NSP1具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:2或與SEQIDNO:3具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP1具有SEQIDNO:71，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:71具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的NSP2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP2具有SEQIDNO:5，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:5具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP2具有SEQIDNO:77或SEQIDNO:78，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:77或SEQIDNO:78具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的NSP3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP3具有SEQIDNO:8，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:8具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP3具有SEQIDNO:83，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:83具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的NSP4。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP4具有SEQIDNO:11，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:11具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP4具有SEQIDNO:89，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:89具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的NSP5。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP5具有SEQIDNO:14或SEQIDNO:15，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:14或SEQIDNO:15具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述NSP5具有SEQIDNO:95或SEQIDNO:96，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:95或SEQIDNO:96具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的VP1。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP1具有SEQIDNO:17，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:17具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP1具有SEQIDNO:101或SEQIDNO:102，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:101或SEQIDNO:102具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的VP2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP2具有SEQIDNO:20，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:20具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP2具有SEQIDNO:107，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:107具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的VP3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP3具有SEQIDNO:23，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:23具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP3具有SEQIDNO:113或SEQIDNO.114，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:113或SEQIDNO.114具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的VP4。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP4具有SEQIDNO:26或SEQIDNO.27，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:26或SEQIDNO.27具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP4具有SEQIDNO:119或SEQIDNO.120，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:119或SEQIDNO.120具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的VP6。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP6具有SEQIDNO:29或SEQIDNO.30，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:29或SEQIDNO.30具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP6具有SEQIDNO:125，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:125具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明提供了一種分離的或純化的VP7。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP7具有SEQIDNO:32，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:32具有大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VP7具有SEQIDNO:131，或者是氨基酸序列與SEQIDNO:131具有大于97％、大于98％或大于99％的同一性的同源物。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了一種分離的或純化的編碼上述蛋白或其片段的核酸。任選地，所述分離的或純化的編碼上述蛋白或其片段的核酸被包括在載體中。編碼NSP1的核酸包括SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:68的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼NSP2的核酸包括SEQIDNO:38、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼NSP3的核酸包括SEQIDNO:41、SEQIDNO:80的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼NSP4的核酸包括SEQIDNO:44、SEQIDNO:86的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼NSP5的核酸包括SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼VP1的核酸包括SEQIDNO:50、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼VP2的核酸包括SEQIDNO:53、SEQIDNO:104的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼VP3的核酸包括SEQIDNO:23、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼VP4的核酸包括SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:116、SEQIDNO:117的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼VP6的核酸包括SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:122的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。編碼VP7的核酸包括SEQIDNO:65、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129的核苷酸序列或其編碼至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，由于遺傳編碼的簡并性，具體多肽或其片段可由多于一種核酸序列編碼?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入突變。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變而不改變輪狀病毒多肽的功能特性。例如，可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、加入或缺失而不改變輪狀病毒多肽的功能特性。還應(yīng)理解多種突變?nèi)芜x地增強(qiáng)、降低或不改變本發(fā)明多肽的免疫原性?？稍谳啝畈《径嚯闹羞M(jìn)行保守氨基酸置換以產(chǎn)生同源物。保守氨基酸置換是本領(lǐng)域承認(rèn)的一種氨基酸對具有相似特性的另一種氨基酸的置換。例如，每種氨基酸均可被描述為具有一種或多種以下特性：正電性的、負(fù)電性的、脂肪族的、芳香族的、極性的、疏水的和親水的。保守性置換是具有結(jié)構(gòu)或功能特性的一種氨基酸對另一種具有相同特性的氨基酸的置換。酸性氨基酸包括天門冬氨酸、谷氨酸；堿性氨基酸包括組氨酸、賴氨酸、精氨酸；脂肪族氨基酸包括異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和色氨酸；極性氨基酸包括天門冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、纈氨酸和色氨酸；保守性置換包括各組內(nèi)的氨基酸之間的置換。氨基酸還可以就相對大小進(jìn)行描述，丙氨酸、半胱氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸、天門冬酰胺、脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸通常被認(rèn)為是小氨基酸。在進(jìn)行這些改變時(shí)，可考慮氨基酸的水化指數(shù)(hydropathicindex)。本領(lǐng)域通常理解水化氨基酸指數(shù)對賦予多肽相互作用的生物功能的重要性。已知某些氨基酸可被具有相似水化指數(shù)或分?jǐn)?shù)的其他氨基酸置換，仍形成具有相似生物活性的多肽。每個(gè)氨基酸都被基于其疏水性和荷電特性而賦以一個(gè)水化指數(shù)。這些指數(shù)為：異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天門冬氨酸(-3.5)、天門冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)、精氨酸(-4.5)。所述氨基酸的相對水化特性被認(rèn)為決定了所形成多肽的二級結(jié)構(gòu)，其進(jìn)而確定所述多肽與其他分子例如酶、底物、受體、抗體、抗原等的相互作用。本領(lǐng)域已知，氨基酸可被具有相似水化指數(shù)的另一氨基酸置換，仍得到功能上等價(jià)的多肽。在這種變化中，優(yōu)選水化指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸的置換，特別優(yōu)選水化指數(shù)在±1之內(nèi)的氨基酸的置換，甚至更優(yōu)選水化指數(shù)在±0.5之內(nèi)的氨基酸的置換。相似氨基酸的置換還可基于親水性進(jìn)行，特別是當(dāng)這樣得到的生物功能等價(jià)的蛋白或肽旨在用于免疫學(xué)實(shí)施方案時(shí)。氨基酸殘基被如下親水性值：精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天門冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天門冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、脯氨酸(-0.5±1)、蘇氨酸(-0.4)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。應(yīng)理解，一個(gè)氨基酸可被另一具有相似親水性值的氨基酸置換，仍得到生物學(xué)上等價(jià)(具體而言免疫學(xué)上等價(jià))的多肽。在這種變化中，優(yōu)選親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸的置換，特別優(yōu)選親水性值在±1之內(nèi)的氨基酸的置換，甚至更優(yōu)選親水性值在±0.5之內(nèi)的氨基酸的置換。如上所述，氨基酸置換通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等等?？紤]多種前述特征的示例性置換在本領(lǐng)域廣為技術(shù)人員所知，包括(原始?xì)埢菏纠灾脫Q)：(Ala:Gly,Ser)、(Arg:Lys)、(Asn:Gln,His)、(Asp:Glu,Cys,Ser)、(Gln:Asn)、(Glu:Asp)、(Gly:Ala)、(His:Asn,Gln)、(HIle:Leu,Val)、(Leu:Ile,Val)、(Lys:Arg)、(Met:Leu,Tyr)、(Ser:Thr)、(Thr:Ser)、(Tip:Tyr)、(Tyr:Trp,Phe)、(Val:HeIle,Leu)。本發(fā)明的實(shí)施方案因此考慮以上列出的多肽的功能或生物學(xué)等價(jià)物。具體而言，所述多肽的實(shí)施方案可以包括與所關(guān)注多肽有約50％、60％、70％、80％、90％和95％序列同一性的變體。輪狀病毒顆粒、核酸、多肽及其片段可使用廣為人知的常規(guī)技術(shù)在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。在宿主細(xì)胞中有效生產(chǎn)所編碼的蛋白或其片段的任意核酸構(gòu)建體均可用于生產(chǎn)輪狀病毒顆粒、輪狀病毒多肽或其片段。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉許多方式可制備用于本發(fā)明的疫苗組合物或用于本發(fā)明方法的本發(fā)明的CDC-9或CDC-66病毒。例如，從糞便或其他生物學(xué)樣品分離假定存在的輪狀病毒是慣常做法，任選包括使用類似于例如Esona,MD,etal.,HumanVaccines,2010；6:1-7中的方法在細(xì)胞培養(yǎng)物例如在Vero細(xì)胞中傳代，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)方式分離病毒株，通過本領(lǐng)域廣為人知的技術(shù)表征基因組序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員對病毒基因組測序并將所得序列與模式序列例如本文公開的CDC-9或CDC-66的序列對比以確定所分離的病毒是否具有所需基因序列，為CDC-9、CDC-66、或其同源物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知曉修飾模式輪狀病毒例如KU或DS-1以得到CDC-9或CDC-66病毒的方法。一個(gè)這種方法使用Komoto,S.,etal.,PNASUSA,2006；103:4646-4651的反向遺傳學(xué)方法，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文。簡言之，病毒株KU的每個(gè)基因均可通過以下方法分離和擴(kuò)增：采集感染的MA104細(xì)胞的培養(yǎng)液，提取病毒dsRNA并使用起始引物以禽成髓細(xì)胞血癥病毒反轉(zhuǎn)錄酶(avianmyeloblastosisvirusreversetranscriptase)(SeikagakuKogyo,Tokyo,Japan)合成DNA。設(shè)計(jì)合成cDNA的引物完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉多種用于引物合成的免費(fèi)和市售程序。例如，Komoto,S.,etal.,PNASUSA,2006；103:4646-4651描述了用于KUVP4基因的引物。對KU或任何其他病毒株的序列進(jìn)行修飾以得到CDC-9或CDC-66的序列是例如通過用序列比對進(jìn)行序列修飾實(shí)現(xiàn)的。一旦弄清核苷酸置換，就可通過使用可從AgilentTechnologies,SantaClara,CA獲得的QUICKCHANGEXL定點(diǎn)誘變試劑盒實(shí)現(xiàn)對cDNA的修飾。任選地將經(jīng)修飾的與CDC-9、CDC-66或其同源物的序列一致的基因序列連同輔助病毒例如KU一起插入到細(xì)胞系例如COS-7細(xì)胞中，所述輔助病毒用作將基因插入新病毒的基礎(chǔ)。隨后通過已知的技術(shù)分離經(jīng)修飾的病毒。使用一種可選的重復(fù)方法，籍此CDC-9或CDC-66的各個(gè)基因逐步置換所述輔助病毒的基因，籍此使用分離的由第一基因的置換得到的置換病毒株作為用于置換第二基因的輔助病毒，如此類推，直至從源病毒株獲得CDC-9或CDC-66。輔助病毒或模式輪狀病毒的實(shí)例可在以下Genbank登錄號中找到：(a)VP3病毒株:RV161-00(DQ490547)、RV176-00(DQ490553)、DRC88(DQ005112)、DRC86(DQ005123)、TB-Chen(AY787654)、DS-1(AY277914)、AU-1(DQ490537)、T152(DQ146701)、Hosokawa(DQ870491)、Hochi(AY277915)、Wa(AY267335)、L26(AY277918)、KU(AB022767)、Dhaka25-02(DQ146651)、Dhaka12-03(DQ146662)、B4633-03(DQ146640)、PO-13(AB009631)。(b)VP7(G1)病毒株:SK417(EU839907)、DH415(EU839906)、MMC82(EU839913)、Dhaka18-02(AY631051)、MMC56(EU839911)、Matlab159-02(AY631055)、ISO-4(AY098670)、Thai-2104(DQ512982)、CMH042/04(EF199713)、417(D16328)、T73(AF450291)、TE1(D17721)、K18(D16319)、Chi-87(DQ512998)、J-4825(DQ512989)、88H249(AB081795)、421(D16326)、RV-4(M64666)、AU007(AB081799)、HOU8697(U88717)、Mvd9607(AF480295)、80(D16325)、DC03(AF183859)、KU(AB222788)、K2(D16323)、K8(D16344)、Egy-8(U26374)、Brz-5(U26367)、Wa(K02033)、D(AB118022)、C95(L24165)、T449(M92651)、DS-1(AB118023)。(c)VP4P[8]病毒株:ITO(AB008280)、D(EF672570)、Wa(L34161)、Hochi(AB008295)、Odelia(AB008296)、VA70(AJ540229)、CH32(AB008274)、MO(AB008278)、KU(AB222784)、Wi61(EF672619)、F45(U30716)P(EF672598)、AI-39(AB008283)、90-544(AB008304)、B4633-03(DQ146641)、Dhaka25-02(DQ146652)、SK438(EU839955)、DH402(EU839958)、DH415(EU839955)、DS-1(AB118025)。(d)NSP4病毒株:Dhaka16-03(DQ492678)、1099(AJ236759)、Dhaka12-03(DQ146669)、Dhaka25-02(DQ146658)、KU(AB022772)、Wa(AF093199)、RMC321(AF541921)、OSU(D88831)、AU-1(D89873)、CMH120/04(DQ923799)、B4106(AY740732)、C-11(AF144793)、DRC86(DQ005116)、DRC88(DQ005105)、DS-1(AF174305)、TB-Chen(AY787650)、Ch-1(AB065287)。上述登錄號的每個(gè)文件和序列均以引用的方式納入本文。其他方法、引物、分離技術(shù)、測序技術(shù)和表征技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并在本文中可以同樣方式操作。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從分離的基因從頭重構(gòu)CDC-9或CDC-66病毒，例如通過例如Gonzalez,SA,andAffranchino,JL,J.Gen.Virol.,1995；76:2357-2360的技術(shù)或其改進(jìn)方法以捕獲的基因裝配病毒粒子，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文。表達(dá)構(gòu)建體及其產(chǎn)生方法以及表達(dá)所需蛋白的用途為本領(lǐng)域所知，如例如在Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001；Ausubel,F.etal.,(Eds.),ShortProtocolsinMolecularBiology,Wiley,2002；andS.J.HigginsandB.D.Hames(Eds.),ProteinExpression:APracticalApproach,OxfordUniversityPress,USA,1999中所述。例如，編碼一種或多種輪狀病毒多肽和/或輪狀病毒多肽片段的核酸分子與控制表達(dá)載體中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連接。將所述表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，然后可分離得到的輪狀病毒顆粒、一種或多種輪狀病毒多肽和/或輪狀病毒多肽片段。示例性構(gòu)建體包括通過以下方式將輪狀病毒核酸分子可操作地連接到質(zhì)粒pT7中：先使用包括T7啟動(dòng)子序列的引物擴(kuò)增所述核酸分子，并將所擴(kuò)增的核酸連接到T7表達(dá)載體pX8dT中，如Schnell,MJ,etal.,EMBOJ,1994；13:4195-4203所述，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文?？刂票磉_(dá)載體中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控序列的非限制性實(shí)例包括例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接信號、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號、多腺苷酸化信號、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)以及它們的結(jié)合或者其他調(diào)控序列。表達(dá)載體包括但不限于用于表達(dá)所需蛋白的病毒載體和細(xì)菌載體。表達(dá)載體的非限制性實(shí)例包括細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和慢病毒。用于表達(dá)多肽及其片段的宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用廣為人知的技術(shù)例如感染或轉(zhuǎn)染將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)染包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔和超聲波穿孔。除了重組方法以外，還可使用化學(xué)合成技術(shù)來生產(chǎn)多肽及其片段。例如，可使用固相合成、溶液相合成、部分固相合成或片段縮合法。本文使用的術(shù)語“分離的”是指已與其他細(xì)胞組分分離的物質(zhì)，所述其他細(xì)胞組分在自然條件下與所述物質(zhì)有聯(lián)系，或者當(dāng)以重組方式產(chǎn)生時(shí)不意欲與所述物質(zhì)有聯(lián)系，并且所述其他細(xì)胞組分可干擾所述物質(zhì)在治療、預(yù)防、診斷、研究或其他用途中的應(yīng)用。通常，本文所述的分離的物質(zhì)的純度為至少約80％、至少約90％、至少約95％或大于約99％。純化可使用廣為人知的標(biāo)準(zhǔn)方法例如分級分離和/或色譜法實(shí)現(xiàn)，例如硫酸銨沉淀和洗脫色譜法如尺寸排阻色譜法、置換色譜法、離子交換色譜法和生物親和色譜法。S.Doonan,ProteinPurificationProtocolsHumanaPress,1996中描述了示例性純化方法。同一性百分比可通過比較氨基酸或核酸序列確定，所述氨基酸或核酸序列包括參考輪狀病毒A氨基酸或核酸序列以及推定的同源物氨基酸或核酸序列。用于確定同一性百分比的算法包括例如以下文獻(xiàn)中的算法：S.KarlinandS.Altshul,PNAS,90:5873-5877,1993；T.SmithandM.Waterman,Adv.Appl.Math.2:482-489,1981；S.NeedlemanandC.Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443-453,1970；W.PearsonandD.Lipman,PNAS,85:2444-2448,1988；以及其他納入計(jì)算機(jī)執(zhí)行的算法，例如但不限于GAP、BESTFIT、FASTA、TFASTA；以及BLAST，例如納入WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison的算法，可從NationalCenterforBiotechnologyInformation公開獲得。輪狀病毒ACDC-9和/或CDC-66多肽、其同源物和/或其免疫原性片段可通過包括以下方法的多種方法中的任一種制備：從源例如培養(yǎng)細(xì)胞或患者樣品分離病毒顆粒；從病毒顆粒分離一種或多種多肽和/或一種或多種多肽片段；重組生產(chǎn)病毒多肽、片段和/或病毒顆粒(包括完整顆粒和病毒樣顆粒)；和/或通過化學(xué)合成技術(shù)。在本文中、在本文引用的參考文獻(xiàn)中詳細(xì)描述了分離病毒顆粒、病毒多肽和/或一種或多種病毒多肽片段的方法；重組產(chǎn)生病毒多肽、病毒多肽片段和/或病毒顆粒的方法，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。如果需要，可通過以下方式使抗原的免疫原性更強(qiáng)：連接于例如牛血清白蛋白或鑰孔血藍(lán)蛋白的載體分子并且/或者通過使用佐劑。載體連接可通過多種技術(shù)中的任一種實(shí)現(xiàn)，所述技術(shù)例如包括但不限于綴合并表達(dá)融合蛋白?？蓸?biāo)記重組表達(dá)的多肽或肽以使其可更容易分離。例如，將這些多肽和肽任選進(jìn)行標(biāo)記，例如Fc-標(biāo)記、6xHIS-標(biāo)記、FLAG標(biāo)記或用其他適合分離標(biāo)記的多肽的標(biāo)簽標(biāo)記。疫苗制備在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于納入本發(fā)明的疫苗組合物的輪狀病毒A株通過通常用于制備活輪狀病毒或滅活輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，通常將相容的細(xì)胞類型與輪狀病毒株一起孵育并將所述細(xì)胞保持在允許病毒復(fù)制和感染顆粒產(chǎn)生的條件下。允許輪狀病毒感染、復(fù)制和顆粒產(chǎn)生的細(xì)胞類型的具體實(shí)例為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如Vero細(xì)胞系。通常從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中采收輪狀病毒顆粒，以包括在疫苗組合物中。所述輪狀病毒顆?？蓮募?xì)胞培養(yǎng)上清液中分離，例如通過過濾和/或離心。任選將分離的輪狀病毒顆粒凍干，例如用于以后重懸浮于可藥用載體中。術(shù)語“可藥用載體”是指對受試者基本無毒并且對疫苗組合物中包含的輪狀病毒基本無活性的載體。可藥用載體為固體、液體或凝膠形式，并通常為無菌和無熱原的。本發(fā)明的疫苗組合物可以為適合給予受試者的任意形式。疫苗組合物可通過任何合適的給藥途徑給予，所述途徑包括口服和非經(jīng)腸如靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻或皮下給藥途徑。用于非經(jīng)腸給藥的疫苗組合物可被制為包含輪狀病毒和可藥用載體的注射液。合適的水性和非水性載體的實(shí)例包括水；乙醇；多元醇如丙二醇、聚乙二醇、甘油等，以及它們的合適混合物；植物油如橄欖油；以及可注射有機(jī)酯如油酸乙酯?？杀３趾线m的流動(dòng)性，例如通過使用包衣如卵磷脂；在分散系的情況下通過保持所需的粒徑；以及/或者通過使用表面活性劑如十二烷基硫酸鈉。任選包括穩(wěn)定劑，如蔗糖、EDTA、EGTA和抗氧化劑。用于給藥或用于懸浮于液體然后給藥的固體劑型包括例如膠囊劑、片劑、粉劑和粒劑。在這些固體劑型中，將輪狀病毒與以下成分混合：至少一種載體，所述載體包括例如緩沖劑如檸檬酸鈉或堿金屬磷酸鹽，所述堿金屬磷酸鹽包括例如磷酸鈉、磷酸鉀和磷酸鈣；填充劑如淀粉、乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；粘合劑如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠；保濕劑如甘油；崩解劑，例如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、植物淀粉如馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸，某些復(fù)合硅酸鹽和碳酸鈉；溶液緩聚劑如石蠟；吸收加速劑如季銨化合物；潤濕劑如十六烷醇、單硬脂酸甘油酯和二醇；吸附劑如高嶺土和膨潤土；潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態(tài)聚乙二醇或十二烷基硫酸鈉；防腐劑如抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，包括例如山梨酸、慶大霉素和苯酚；以及穩(wěn)定劑如蔗糖、EDTA、EGTA和抗氧化劑。固體劑型任選包括包衣如腸溶衣。所述腸溶衣通常為聚合材料。優(yōu)選的腸溶衣材料的特點(diǎn)為是可生物蝕解的、可逐漸水解的和/或可逐漸溶于水的聚合物。用于固體劑型的包衣材料的量通常決定服藥和藥物釋放之間的時(shí)間間隔。使用的包衣具有的厚度使得整個(gè)包衣不溶解在與胃酸有關(guān)的pH小于3的胃腸液中，而溶解在pH大于3的小腸環(huán)境中?？梢灶A(yù)期，在實(shí)施本發(fā)明的過程中，任何具有pH依賴性的溶解性特征的陰離子聚合物都可容易地作為腸溶衣，以實(shí)現(xiàn)將所述活性物質(zhì)遞送到下胃腸道中。具體腸溶衣材料的選擇倚賴于以下性質(zhì)，例如，對胃中崩解的抗性；對胃液的不滲透性而活性物質(zhì)在胃中擴(kuò)散；在目標(biāo)腸位置消散的能力；儲(chǔ)存過程中的物理和化學(xué)穩(wěn)定性；無毒性；以及易用性。合適的腸溶衣材料包括，例如，纖維素聚合物如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙酸纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、偏苯三酸乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、琥珀酸羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；丙烯酸聚合物和共聚物，優(yōu)選地由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸銨、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或乙酯形成；乙烯基聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、鄰苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；蟲膠；以及它們的結(jié)合物。一種具體的腸溶衣材料包括例如美國專利No.6,136,345所述的丙烯酸聚合物和共聚物。所述腸溶衣任選包含增塑劑以防止形成可使胃液滲入所述固體劑型的孔和裂縫。合適的增塑劑包括，例如，檸檬酸三乙酯(Citroflex2)、三醋精(三醋酸甘油酯)、乙酰檸檬酸三乙酯(CitroflecA2)、Carbowax400(聚乙二醇400)、鄰苯二甲酸二乙酯、檸檬酸三丁酯、乙?；视鸵货?、甘油、脂肪酸酯、丙二醇和鄰苯二甲酸二丁酯。具體地，由陰離子羧基丙烯酸聚合物構(gòu)成的包衣通常含有大約10-25wt％增塑劑，尤其是鄰苯二甲酸二丁酯、聚乙二醇、檸檬酸三乙酯和三醋精。所述包衣也可含有其他包衣賦形劑如防粘劑(detackifier)、消泡劑、潤滑劑(如硬脂酸鎂)和穩(wěn)定劑(如羥丙基纖維素、酸或堿)以溶解或分散所述包衣材料并且改善包衣性能和所包覆的產(chǎn)品。用于口服給藥的液體劑型包含輪狀病毒和可藥用載體，被制成乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酏劑。液體劑型的本發(fā)明的疫苗組合物可包括潤濕劑、乳化劑、助懸劑、增甜劑、調(diào)味劑或芳香劑。關(guān)于用于制備劑型的常規(guī)成分、設(shè)備和方法的詳細(xì)信息參見PharmaceuticalDosageForms:Tablets,eds.H.A.Liebermanetal.,NewYork:MarcelDekker,Inc.,1989；andinL.V.Allen,Jr.etal.,Ansel'sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,8thEd.,Philadelphia,PA:Lippincott,Williams&Wilkins,2004,throughoutandinchapter16；A.R.Gennaro,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,LippincottWilliams&Wilkins,21sted.,2005,particularlychapter89；andJ.G.Hardmanetal.,Goodman&Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw-HillProfessional,10thed.,2001。本發(fā)明實(shí)施方案的病毒組合物中任選包含佐劑。佐劑為本領(lǐng)域所知曉，包括例如弗氏佐劑、氫氧化鋁、磷酸鋁、氧化鋁、皂角甙、葡聚糖如DEAE-葡聚糖，植物油(如花生油、橄欖油和/或維生素E醋酸酯)、礦物油、細(xì)菌脂多糖、肽聚糖和蛋白聚糖。本文使用的術(shù)語“受試者”是指人。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，術(shù)語受試者也可指非人動(dòng)物，例如，包括其他靈長類、牛、馬、綿羊、山羊、豬、狗、貓、鳥類、家禽和嚙齒動(dòng)物。將所分離的輪狀病毒進(jìn)行處理以滅活或減毒所述輪狀病毒。因此，在具體實(shí)施方案中，人輪狀病毒疫苗包含減毒活人輪狀病毒或者滅活人輪狀病毒。術(shù)語“減毒活輪狀病毒”是指具有感染合適宿主或宿主細(xì)胞并復(fù)制的能力的輪狀病毒，該術(shù)語用于區(qū)分“滅活”輪狀病毒。術(shù)語“減毒活輪狀病毒”是指特征在于與野生型人輪狀病毒相比毒力大大降低的輪狀病毒。術(shù)語“毒力”用于描述輪狀病毒對宿主細(xì)胞或宿主生物體的致病性程度。毒力可使用本領(lǐng)域已知的多種測定的任一種確定。例如，毒力可通過下述方式來評估：使培養(yǎng)的宿主細(xì)胞接觸減毒輪狀病毒，并確定呈現(xiàn)致病反應(yīng)的細(xì)胞的數(shù)量和/或引起的致病反應(yīng)的嚴(yán)重度。當(dāng)減毒輪狀病毒在宿主細(xì)胞和/或宿主生物體中導(dǎo)致一種或多種致病效應(yīng)的能力降低時(shí)，就存在毒力降低。本文使用的術(shù)語“滅活”輪狀病毒是指已被殺死并因此既不能復(fù)制也不能感染宿主細(xì)胞或宿主生物體的輪狀病毒。滅活可通過多種技術(shù)中的任一種實(shí)現(xiàn)，所述技術(shù)例如包括使用一種或多種化學(xué)試劑滅活、熱滅活和/或UV線滅活。用于滅活輪狀病毒的化學(xué)試劑為本領(lǐng)域所知，例如包括乙撐亞胺類(ethyleneimines)如二乙撐亞胺類(binaryethyleneimine)；交聯(lián)醛類如甲醛和戊二醛；蛋白酶類例如包括鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶；以及洗滌劑如辛基酚乙氧基化物和烷基三甲基銨鹽。輪狀病毒可通過用堿處理例如通過在高于10.0的pH下孵育輪狀病毒而滅活。熱滅活可通過在例如高于50℃的溫度下加熱而實(shí)現(xiàn)。滅活可通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評估，所述技術(shù)例如包括在滅活步驟過程中的多個(gè)時(shí)間采集病毒樣品并觀察樣品對合適細(xì)胞例如Vero細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)或感染性。應(yīng)理解，除了減毒活輪狀病毒和滅活輪狀病毒以外，本發(fā)明的疫苗組合物還任選包含輪狀病毒的抗原性部分。因此，例如，能夠誘導(dǎo)受試者體內(nèi)免疫反應(yīng)的來源于輪狀病毒的蛋白或肽被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具體而言，本發(fā)明的疫苗組合物任選包含被鑒定為CDC-9或CDC-66的人輪狀病毒株的抗原性部分。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了誘導(dǎo)受試者體內(nèi)對輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的免疫反應(yīng)的方法，包括給予治療量的包含至少一種人輪狀病毒株的疫苗組合物。本文所用的術(shù)語“治療有效量”是指可有效地誘導(dǎo)足以預(yù)防或改善輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的體征或癥狀的免疫反應(yīng)的量。誘導(dǎo)受試者體內(nèi)的免疫反應(yīng)可通過本領(lǐng)域所知多種技術(shù)中的任一種確定，所述技術(shù)包括例如輪狀病毒抗體、輪狀病毒抗體滴度和/或淋巴細(xì)胞增殖測定。Tsunemitsu,H,etal.,J.Clin.Microbiol,1992；30:2129-2134描述了用于檢測輪狀病毒抗體的示例性方法，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文。可監(jiān)測輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的體征和癥狀以檢測給予受試者本發(fā)明疫苗組合物所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)例如為輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的臨床體征和癥狀的減輕，例如糞便中病毒脫落量的下降、糞便中病毒脫落天數(shù)的減少、受試者腹瀉天數(shù)的減少、死亡率的下降、發(fā)病率的下降、體重減少的下降或體重增加。免疫反應(yīng)例如為給予發(fā)明的組合物之后抗輪狀病毒抗體的產(chǎn)生，T細(xì)胞、B細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞的活化，或者本領(lǐng)域已知的其他免疫反應(yīng)。在具體實(shí)施方案中，誘導(dǎo)受試者體內(nèi)對輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的免疫反應(yīng)的方法包括以典型疫苗組合物給予104-108ffu的減毒活疫苗或者1-25μg的滅活病毒。在某些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)受試者體內(nèi)對輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的免疫反應(yīng)的方法包括給予治療有效量的包含人輪狀病毒株CDC-9和/或CDC-66、其多肽片段、其同源物或它們的結(jié)合物的疫苗組合物。在另一實(shí)施方案中，誘導(dǎo)受試者體內(nèi)對輪狀病毒介導(dǎo)的疾病的免疫反應(yīng)的方法包括給予治療有效量的包含G1群血清型和特征在于具有G2群血清型的第二人輪狀病毒株的疫苗組合物。在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法給予疫苗組合物包括一次性給予受試者一劑或多劑疫苗組合物?；蛘?，以數(shù)天、數(shù)周或數(shù)年的時(shí)間間隔給予兩劑或多劑疫苗組合物。給予疫苗組合物劑量的合適方案倚賴若干因素，包括例如受試者的年齡和健康狀態(tài)，所用疫苗組合物的類型和給藥途徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定用于給予具體受試者的給藥劑量和方案。以下實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方案。提供這些實(shí)施例是出于說明的目的，而不應(yīng)被認(rèn)作對本發(fā)明組合物和方法的范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1-適應(yīng)和傳代：將1ml在DMEM中的10％病毒懸浮液與新霉素加入一個(gè)1.7ml無菌低結(jié)合試管中，充分混合，然后在Eppendorf微量離心機(jī)中以3,000rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新試管并以10,000rpm(8,000xg)離心10分鐘。將澄清的上清液通過穿過0.45微米孔濾膜進(jìn)行除菌。用EIA(Rotaclone；MeridianBiosciences)檢測所述上清液，如果OD值>1.0，則將其保存在4℃直至用于感染。感染前一天可進(jìn)行糞便提取和Rotaclone測試。將各個(gè)轉(zhuǎn)管中的培養(yǎng)基從細(xì)胞單層除去。將每個(gè)轉(zhuǎn)管用2ml維持培養(yǎng)基洗滌，然后向每試管中加入2ml維持培養(yǎng)基并在37℃下在轉(zhuǎn)動(dòng)設(shè)備中孵育直至準(zhǔn)備好病毒接種物。將一小份0.5ml的上清液轉(zhuǎn)移至無菌試管中，加入1μlCaCl2儲(chǔ)液(300g/l)，使終濃度為800μg/ml。將該試管在室溫下孵育30分鐘，然后加入3μl豬胰蛋白酶儲(chǔ)液(2.5mg/ml)，使終濃度為15μg/ml。將所得混合物在37℃下孵育60分鐘。以相同方式處理相同體積的MEM作為假接種液。使用不同的移液器槍頭來吸取病毒懸浮液和胰蛋白酶溶液。全部病毒吸取均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。從每個(gè)轉(zhuǎn)管中除去培養(yǎng)基并使用不同的無菌移液器向每個(gè)轉(zhuǎn)管中加入0.2-0.3ml的胰蛋白酶消化的病毒懸浮液或假接種液。將蓋旋緊并將所述試管在位于培養(yǎng)箱中的轉(zhuǎn)管設(shè)備上于37℃孵育。孵育2小時(shí)后，使用1ml移液器取出接種物并用2ml維持培養(yǎng)基輕柔地洗滌。向每試管中加入2ml含有不同濃度(10、20或30μg/ml，取決于病毒株)的胰蛋白酶的維持培養(yǎng)基并在位于培養(yǎng)箱中的轉(zhuǎn)管設(shè)備上于37℃孵育2小時(shí)。每天觀察所述細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，在第4天采收所述細(xì)胞并保存于-70℃。在下次傳代之前將所述細(xì)胞凍融2次。如上所述用CaCl2和胰蛋白酶處理凍融的細(xì)胞裂解物，并如上所述進(jìn)行后續(xù)傳代。將所述細(xì)胞凍融至少一次，然后用Rotaclone試劑盒測定輪狀病毒抗原或者通過FFA測定法確定病毒滴度。實(shí)施例2-輪狀病毒株的產(chǎn)生和純化輪狀病毒的產(chǎn)生通過使用大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)瓶來完成。簡言之，將Vero細(xì)胞在添加有5％胎牛血清(InvitrogenCorp.,GrandIsland,NY)和50μg/ml的新霉素(Sigma,St.Louis,MO)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)瓶中單層匯合的Vero細(xì)胞用某種輪狀病毒株感染，感染復(fù)數(shù)為0.1。將通過大規(guī)模生產(chǎn)得到的輪狀病毒根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟純化。簡言之，在感染后4天從感染的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中采收輪狀病毒。通過以下方式從上清液中純化三層的輪狀病毒顆粒：使用SW32Ti轉(zhuǎn)頭通過TNC緩沖液中的40％蔗糖墊層以106,750×g離心2小時(shí)，然后使用SW40Ti轉(zhuǎn)頭以111,160g通過等密度的CsCl梯度度離心17小時(shí)。還可使用蔗糖梯度純化輪狀病毒顆粒。TNC緩沖液是10mMTris(pH8.0)、140mMNaCl和10mMCaCl2。將純化的病毒顆粒重懸浮于稀釋緩沖液中，所述稀釋緩沖液為含有CaCl2和MgCl2(InvitrogenCorp.,GrandIsland,NY)并添加有10％的山梨糖醇(SigmaCorp.,St.Louis,MO)的漢克斯平衡鹽溶液。將所述重懸浮的分離輪狀病毒保存于-70℃直至將其滅活并給予此實(shí)施例中的受試者。通過多種技術(shù)的任一種分析純化的輪狀病毒的純度和種類，所述技術(shù)例如包括SDS-PAGE和后續(xù)考馬斯亮藍(lán)染色、使用輪狀病毒特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡和/或電子顯微術(shù)。此外，純化的輪狀病毒株的純度和種類還可通過識(shí)別具體結(jié)構(gòu)病毒蛋白實(shí)現(xiàn)。圖4A示出了CsCl純化的輪狀病毒株CDC-9。圖4B示出了所確定的雙層和三層CDC-9的結(jié)構(gòu)病毒蛋白，通過SDS-PAGE分析，與分子量標(biāo)記相對比。實(shí)施例3-滅活輪狀病毒(IRV)的免疫原性在小鼠模型中測試了輪狀病毒株的免疫原性。將純化的滅活輪狀病毒顆粒肌內(nèi)給予小鼠而不給予佐劑。用量為2-20μg的滅活輪狀病毒蛋白免疫動(dòng)物。通過測量在給藥后各個(gè)時(shí)間獲得的血液樣品中包括IgM、IgA和IgG的免疫球蛋白滴度測定免疫原性。通過JiangB,etal.,Vaccine1999；17:1005-13中詳細(xì)描述的微量中和試驗(yàn)測量中和抗體滴度，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式納入本文。簡言之，將小鼠血清進(jìn)行兩倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度重復(fù)兩個(gè)孔，用以胰蛋白酶滅活的RRV輪狀病毒孵育。將滅活輪狀病毒或經(jīng)類似處理的無血清MEM培養(yǎng)基在無小鼠血清的情況下孵育，分別用作陽性和陰性對照。將添加有終濃度為10μg/ml的胰蛋白酶和0.5％雞血清(InvitrogenCorp.,GrandIsland,NY)的MEM培養(yǎng)基中的MA104細(xì)胞加入每孔中。在37℃下孵育18小時(shí)后，用福爾馬林固定細(xì)胞。通過用兔抗RRV超免疫血清、HRP-標(biāo)記的抗兔IgG然后用四甲基聯(lián)苯胺孵育細(xì)胞來檢測MA104細(xì)胞中的輪狀病毒抗原。血清中的中和抗體滴度被定義為吸收值比病毒對照吸收值降低70％時(shí)的最高稀釋度的倒數(shù)。比較以滅活純化輪狀病毒顆粒注射的小鼠中的抗體滴度與對照小鼠中的抗體滴度。對照小鼠中的抗體滴度通常小于100。圖5A和5B顯示了對照和接種小鼠中的總抗體和中和抗體滴度。總血清抗體(圖5A)和中和抗體(圖5B)對小鼠中熱滅活輪狀病毒反應(yīng)。用滅活YK-1通過兩次肌內(nèi)注射(I.M.)接種小鼠，如上所述用EIA確定輪狀病毒特異性總抗體(IgA、IgG和IgM)和中和抗體。對于總抗體，以初始稀釋度1:100對每個(gè)血清樣品進(jìn)行檢測。預(yù)抽的血清樣品在此稀釋度下檢測不到抗體。將數(shù)值20用于確定幾何平均滴度并作圖。以初始稀釋度1:20檢測中和抗體。抗體滴度表示為每組(n＝7或6)的幾何平均值。誤差棒表示1標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)施例4-佐劑在另一實(shí)施例中，在給予小鼠的疫苗中加入Al(OH)3作為輪狀病毒顆粒的佐劑。用含有或不含600μgAl(OH)3的2μg或0.2μg滅活純化輪狀病毒顆粒經(jīng)肌內(nèi)免疫動(dòng)物一次。在給予的輪狀病毒的兩個(gè)濃度下，AlOH均強(qiáng)烈地增加小鼠中的總抗體滴度。在以600μgAl(OH)3免疫的對照小鼠中未檢測到抗體滴度(<100的稀釋度)。圖6是柱形圖，示出了在對照和接種小鼠中對以Al(OH)3制劑的熱滅活輪狀病毒反應(yīng)的總血清抗體滴度。用含有或不含有Al(OH)3的滅活YK-1經(jīng)肌內(nèi)注射(I.M.)接種小鼠一次，如上所述用EIA確定輪狀病毒特異性總抗體(IgA、IgG和IgM)。對于總抗體，以初始稀釋度1:100對每個(gè)血清樣品進(jìn)行檢測。預(yù)抽的血清樣品在此稀釋度下檢測不到抗體。將數(shù)值20用于確定幾何平均滴度并作圖?？贵w滴度表示為每組(n＝6)的幾何平均值。誤差棒表示1標(biāo)準(zhǔn)誤差。實(shí)施例5-限菌小豬模型使用輪狀病毒疾病的限菌小豬模型。此小豬模型使得檢測可在確定環(huán)境下進(jìn)行，從而避免動(dòng)物暴露環(huán)境的問題，并使得疾病可用作結(jié)果變量。此模型使得還可檢測針對同型Wa攻擊的具有G1血清型的滅活輪狀病毒疫苗。限菌小豬是目前最好的用于人輪狀病毒株的感染和疾病的動(dòng)物模型(SeeSaifLJ,etal.,ArchivesofVirology,1996；12:S153-61和IosefC,etal.,Vaccine,2002；20:1741-53；其內(nèi)容均以引用的方式納入本文)。選擇13只限菌幼豬并隨機(jī)分為表6所示的4組。表6.小豬研究設(shè)計(jì)組名組中小豬數(shù)量CDC-9抗原(μg)磷酸鋁(μg)AA40750BB4750CC375750DD20(緩沖液)0(緩沖液)表6所示的每組動(dòng)物均圈養(yǎng)在不同的隔離室。分別用不含或含有佐劑的滅活輪狀病毒疫苗肌內(nèi)接種組BB和CC中的動(dòng)物三次。此實(shí)施例中的疫苗制劑在混合有750μg磷酸鋁的稀釋液中包含75μg滅活純化CDC-9輪狀病毒。分別用750μg磷酸鋁和緩沖液以相同方式接種AA組和DD組中的動(dòng)物。用布拉德福特法確定抗原吸收，顯示約50％的抗原與磷酸鋁結(jié)合。在這些免疫接種中，注射了結(jié)合和未結(jié)合的抗原。如表6所示，用包含以下成分的疫苗制劑對小豬進(jìn)行免疫：750μg磷酸鋁但無抗原、75μg抗原但無磷酸鋁、75μg抗原和750μg磷酸鋁或者既無抗原也無磷酸鋁(即僅緩沖液)。每次接種都是通過將0.5ml疫苗制劑注射到小豬的后肢肌肉內(nèi)進(jìn)行。在以10-12天的間隔給予3劑疫苗制劑后，用毒力Wa輪狀病毒經(jīng)口服攻擊小鼠。病毒攻擊之前，對每只小豬接種3ml碳酸氫鈉以中和胃中的酸。每天從被攻擊的小豬收集糞便樣品，持續(xù)10天。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，以7-14天的間隔采集血樣。圖7A示出了用無抗原的750μg磷酸鋁接種的4只小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7B示出了用無佐劑的抗原免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7C示出了用抗原和佐劑免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7D示出了在只用緩沖液免疫的小豬的糞便樣品中測量的病毒脫落。這些結(jié)果顯示，只用磷酸鋁或只用稀釋緩沖液假接種的小豬均脫落輪狀病毒，最長達(dá)5天并處于高滴度。相反，用無磷酸鋁的滅活輪狀病毒接種的小豬被部分保護(hù)，以縮短的1天脫落或者脫落延遲和降低為證。在用滅活輪狀病毒和磷酸鋁接種的3只小豬中，2只被完全保護(hù)，1只僅短短1天的降低的脫落。因此，這些結(jié)果表明了本發(fā)明實(shí)施方案的滅活疫苗制劑的有效性。實(shí)施例6-限菌小豬模型-II為重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，選擇11只限菌幼豬并隨機(jī)分為表7所示的2組。表7.小豬研究設(shè)計(jì)組名組中小豬數(shù)量CDC-9抗原(μg)磷酸鋁(μg)GG50600HH650600如表7所示，并如Wang,Y,etal.,Inactivatedrotavirusvaccineinducesprotectiveimmunityingnotobioticpiglets(付印中，其內(nèi)容以引用的方式納入本文)所述，用包含以下成分的疫苗制劑免疫小豬：600μg磷酸鋁但無抗原、或者50μg抗原和600μg磷酸鋁。每次接種都通過將0.5ml疫苗制劑注射到小豬的后肢肌肉內(nèi)進(jìn)行。在以10-12天的間隔給予3劑疫苗制劑后，用毒力Wa輪狀病毒經(jīng)口服攻擊小鼠。病毒攻擊之前，對每只小豬接種3ml碳酸氫鈉以中和胃中的酸。每天從被攻擊的小豬收集糞便樣品，持續(xù)10天。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，以7-14天的時(shí)間間隔采集血樣。圖8A示出了在用無抗原的600μg磷酸鋁(實(shí)心柱)接種的小豬或者用50μg抗原和600μg磷酸鋁(陰影柱)接種的小豬的血清中的輪狀病毒特異性IgG抗體反應(yīng)的水平。圖8B示出了在用無抗原的600μg磷酸鋁(實(shí)心柱)接種的小豬或者用50μg抗原和600μg磷酸鋁(陰影柱)接種的小豬的血清中的中和抗體反應(yīng)。以抗原接種的小豬產(chǎn)生顯著水平的血清IgG。經(jīng)口輪狀病毒攻擊進(jìn)一步增強(qiáng)了血清IgG水平。在以50μg的抗原和600μg的磷酸鋁接種的小豬中的中和活性水平顯著高于假免疫動(dòng)物中的中和活性水平。圖9A示出了以50μg抗原和600μg磷酸鋁接種的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖9B示出了以無抗原的600μg磷酸鋁接種的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。這些圖表明，只用磷酸鋁或只用稀釋緩沖液假接種的小豬均脫落輪狀病毒，最長達(dá)5天并處于高滴度。相反，以滅活輪狀病毒和磷酸鋁接種的小豬被保護(hù)不發(fā)生病毒脫落。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明實(shí)施方案的疫苗制劑的有效性，并確證了第一小豬實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果。這些結(jié)果清楚地表明，以鋁制劑的IRV具有高度免疫原性并防護(hù)小豬免于感染,因此建立了滅活輪狀病毒疫苗的概念證明。實(shí)施例7-限菌小豬模型-III——以CDC-66進(jìn)行免疫：為使用CDC-66輪狀病毒重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，選擇11只限菌幼豬并隨機(jī)分為表8所示的2組。表8.小豬研究設(shè)計(jì)組名組中小豬數(shù)量CDC-66抗原(μg)磷酸鋁(μg)GG50600HH650600如表7所示，用包含以下成分的疫苗制劑對小豬進(jìn)行免疫：600μg磷酸鋁但無抗原、或者50μg抗原和600μg磷酸鋁(AlPO4)。每次接種都通過將0.5ml疫苗制劑注射到小豬的后肢肌肉內(nèi)進(jìn)行。在以10-12天的間隔給予3劑疫苗制劑后，用毒力DS-1輪狀病毒經(jīng)口服攻擊小鼠。病毒攻擊之前，對每只小豬接種3ml碳酸氫鈉以中和胃中的酸。每天從被攻擊的小豬收集糞便樣品，持續(xù)10天。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，以7-14天的時(shí)間間隔采集血樣。以抗原接種的小豬產(chǎn)生了顯著水平的血清IgG。經(jīng)口輪狀病毒攻擊進(jìn)一步增強(qiáng)了血清IgG水平。在以50μg的CDC-66抗原和600μg的磷酸鋁接種的小豬中的中和活性水平顯著高于假免疫動(dòng)物中的中和活性水平。只用磷酸鋁或只用稀釋緩沖液假接種的小豬均脫落輪狀病毒，最長達(dá)5天，并處于高滴度。相反，以滅活輪狀病毒CDC-66和磷酸鋁接種的小豬被保護(hù)不發(fā)生病毒脫落。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明實(shí)施方案的疫苗制劑的有效性，并確證了第一小豬實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果。這些結(jié)果清楚地表明，以鋁制劑的IRV具有高度免疫原性并防護(hù)小豬免于感染，因此建立了滅活輪狀病毒疫苗的概念證明。本說明書提到的所有專利或出版物都以引用的方式納入本文中，程度相當(dāng)于每篇單獨(dú)的出版物都被具體地且分別地指出以引用的方式納入本文中。本文所述的組合物和方法在目前表示優(yōu)選的實(shí)施方案、實(shí)例，而非意圖作為對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)想到其中的變化和其他應(yīng)用。這些變化和其他應(yīng)用可在不背離如權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍的情況下作出。當(dāng)前第1頁1 2 3