專利名稱：均相分子燈標熒光探針pcr乙肝病毒檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種PCR乙型肝炎病毒的檢測方法，即應(yīng)用分子燈標探針進行乙型肝炎病毒DNA PCR擴增產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明涉及應(yīng)用分子燈標探針進行乙型肝炎病毒DNA PCR擴增產(chǎn)物檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒感染是一種世界性傳染病，它可以引起病人的身體極度衰弱甚至導(dǎo)致死亡。估計目前全世界范圍內(nèi)大約有2億人口為乙肝病毒攜帶者，而我國就有1億，為乙肝的高流行區(qū)，同時也是肝癌的高發(fā)國家，因此，研究乙型肝炎病毒的分子生物學(xué)特點，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)探討診斷和防治方法，是十分必要的。
對乙型肝炎病毒感染的診斷，目前仍然依據(jù)反向間接血凝實驗(RPHA)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)或放射免疫實驗(RIA)等方法檢測其血清標志物。但上述血清免疫學(xué)檢測方法存在靈敏度低的缺點，很多血清學(xué)檢測各項指標均陰性的標本，經(jīng)PCR擴增后檢測仍存在低含量的乙型肝炎病毒DNA。且血清標記物的出現(xiàn)要滯后于乙型肝炎病毒的感染，不利于感染的早期診斷，據(jù)世界衛(wèi)生組織綜合各國資料表明，輸血后乙型肝炎發(fā)生率超過3.7‰，這主要是由以往篩選獻血員方法的靈敏度不夠所造成的。
PCR作為一種DNA的體外擴增技術(shù)，可在數(shù)小時內(nèi)獲得數(shù)百萬個特異DNA序列拷貝，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于乙型肝炎病毒的診斷研究，并取得了良好的效果。對PCR擴增產(chǎn)物的鑒定通常采用的是瓊脂糖凝膠電泳-EB染色法，但在電泳結(jié)果的判定上存在著較大的人為因素，如在引物二聚體、非特異擴增條帶的辨別上帶有明顯的個人化特征，結(jié)果的準確性較差。在此情況下，使用針對特定靶序列的特異性探針與擴增產(chǎn)物進行特異雜交，能較好地提高檢測的靈敏度和特異性。目前使用的雜交檢測方法多為非均相雜交檢測，如中國專利CN 1061686C中在進行PCR產(chǎn)物的檢測時，所采用的方法是將核酸探針點樣于檢測膜上，在與生物素標記的PCR產(chǎn)物結(jié)合后，利用生物素與親和素之間的相互作用，標記以堿性磷酸酶，最后加入適當(dāng)?shù)拿傅孜镲@色檢測。該發(fā)明雖然提供了一種相對簡單的核酸分子檢測方法，但仍無法擺脫非均相雜交檢測所需要的點樣-雜交-酶標-顯色進行一系列煩瑣的操作，費時費力，十分不便。
分子燈標探針已成功地應(yīng)用在了結(jié)核桿菌的檢測研究(CN 1281901A)及細胞內(nèi)的基因分析研究中(CN 1308135A)，但在乙型肝炎檢測研究中的應(yīng)用尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種均相分子燈標熒光探針PCR乙肝病毒檢測方法和試劑盒。本發(fā)明改善了PCR檢測的靈敏度和特異性，操作簡便，可進行大批量樣品的同時檢測，在乙型肝炎的早期診斷及獻血員篩選方面顯示了廣闊的前景。
本發(fā)明為解決上述問題采用的技術(shù)方案是分子燈標為一類莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸探針，它的環(huán)部由一段與靶基因互補的探針序列構(gòu)成，探針序列的兩端是兩段與靶基因無關(guān)的相互互補的臂序列，它們之間退火形成發(fā)夾型的莖。熒光基團和猝滅基團分別連接在兩條臂的末端。發(fā)夾型的莖使熒光基團和猝滅基團相互接近，致使熒光基團的熒光通過能量轉(zhuǎn)移而被猝滅。當(dāng)有與之完全匹配的靶基因存在時，分子燈標的探針序列與靶基因特異性結(jié)合，形成探針-靶雜交體，迫使熒光基團和猝滅基團相互遠離，體系熒光復(fù)原。由于未雜交的分子燈標仍保持原來的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而不發(fā)射熒光，所以在檢測探針的雜交作用時無需將探針-靶雜交體與過剩的分子燈標分離。
本發(fā)明的檢測方法如下(1)血清樣品中乙型肝炎病毒DNA的提取；(2)在分子燈標探針的存在下，對提取的乙型肝炎病毒DNA進行PCR擴增；(3)測定PCR反應(yīng)體系的熒光強度，判定標本中是否存在乙型肝炎病毒。
本發(fā)明的關(guān)鍵在于設(shè)計合適的分子燈標探針探針的靶序列位于乙型肝炎病毒基因序列保守區(qū)，該探針適用于四種乙型肝炎亞型(adr、adw、ayr、ayw)，并具有典型的溫度變性及復(fù)性特征和良好的特異性。5’端用FAM標記，3’端用DABCYL標記，設(shè)計借助于<Nucleic Acid Hybridization>程序及<Nucleic Acid Folding>程序完成(http∥jsll.chem.wayne.edu)。
其序列為FAM-5’-CGAGCATCTTCTGCGACGCGGGCTCG-3’-DABCYL(劃線部分為發(fā)夾的莖部，未劃線部分為與靶序列特異性互補的探針序列)，其空間結(jié)構(gòu)如下
同時，考慮到Mg2+無論是對PCR擴增，還是對分子燈標發(fā)夾結(jié)構(gòu)及分子燈標-靶雜交體的穩(wěn)定性都有較大的影響，所以有必要選擇最佳的Mg2+濃度范圍。通過一系列實驗，本發(fā)明確定Mg2+濃度在1mmol/L-8mmol/L之間為宜。
本發(fā)明用分子燈標熒光探針進行PCR乙型肝炎病毒檢測的試劑盒包括1×PCR反應(yīng)緩沖液(10mmol/L KCl，8mmol/L (NH4)2SO4，10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，NP-40)，1.5mmol/LMgCl2，各0.4mmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，各0.4μmol/L的上、下游引物，2.5UTaq DNA聚合酶，0.3μmol/L分子燈標探針。
本發(fā)明用分子燈標熒光探針進行PCR乙型肝炎病毒檢測具有以下優(yōu)勢(1)分子燈標探針操作簡便，通過簡單的熒光測定即可完成PCR產(chǎn)物的檢測，避免了瓊脂糖凝膠電泳的繁瑣操作，適用于大批量血清的同時檢測。
(2)瓊脂糖凝膠電泳-溴化乙錠(EB)染色法中所用的EB是一種強致癌物質(zhì)，操作不慎易對人體造成傷害，且試驗完成后帶有EB的瓊脂糖凝膠處理起來較為繁瑣。而分子燈標探針則為一段無任何生物活性的寡核苷酸鏈，不會對人體造成任何傷害。
(3)該方法具有極高的檢測靈敏度，可輕易地檢測出每毫升血清中幾十個乙型肝炎病毒拷貝的存在。從而為其用于乙型肝炎的早期診斷及對獻血員進行篩選提供了廣闊的前景。
(4)由于未雜交的分子燈標不發(fā)射熒光且不對PCR產(chǎn)生干擾，當(dāng)與熒光PCR儀聯(lián)用時，分子燈標可用于PCR反應(yīng)的實時監(jiān)測，這樣可使PCR擴增及產(chǎn)物檢測在一個封閉的反應(yīng)管內(nèi)同時完成，從而有效地避免了產(chǎn)物的攜帶污染，同時可以通過反應(yīng)過程中分子燈標熒光強度的變化判斷是否存在擴增產(chǎn)物，避免了外部參照的使用，使結(jié)果的判定更為準確。由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的存在，分子燈標與線性探針相比具有更佳的識別單堿基錯配的能力，在某一溫度范圍內(nèi)，分子燈標可與匹配的靶雜交產(chǎn)生強烈的熒光，而與單堿基錯配的靶不產(chǎn)生熒光或只產(chǎn)生微弱的熒光。同時由于分子燈標中獨特的能量轉(zhuǎn)移機理的存在，DABCYL可以作為燈標中多種熒光基團的通用猝滅基團，因此可以針對不同靶基因設(shè)計合成攜帶有不同熒光基團的分子燈標探針。這些性質(zhì)使分子燈標探針尤其適用于單堿基突變及多種靶基因的同時檢測。
本發(fā)明的突出的實質(zhì)性的特點和積極效果可從下述實施例中得以體現(xiàn)，但是它們并不是對本發(fā)明作任何限制。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步詳細地闡述本發(fā)明。
實施例1在該實施例中，比較當(dāng)PCR反應(yīng)液中含有不同Mg2+濃度時分子燈標的檢測效果，確定出PCR反應(yīng)液中Mg2+的濃度。
分別以正常人血清及含有乙型肝炎病毒的人血清為陰性及陽性模板(血清樣品的處理方法見下面實施例)進行一系列的PCR擴增反應(yīng)。其中Mg2+的濃度以0.5mmol/L為梯度由0mmol/L上升到10mmol/L，其它PCR反應(yīng)成分如下1×PCR反應(yīng)緩沖液(10mmol/LKCl，8mmol/L(NH4)2SO4，10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，NP-40)，1.5mmol/L MgCl2，各0.4mmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，各0.4μmol/L的上、下游引物(見下面實施例)，2.5U Taq DNA聚合酶，0.3μmol/L分子燈標探針，2μl模板。
按如下條件進行PCR擴增 PCR反應(yīng)完成后，在室溫下用75μl PCR反應(yīng)緩沖液(含有對應(yīng)濃度的MgCl2)將反應(yīng)液稀釋到100μl，加入微量熒光比色池中在熒光分光光度計(Ex＝490nm，Em＝517.5nm)上測定體系熒光強度。
結(jié)果表明當(dāng)Mg2+濃度低于1mmol/L及高于8mmol/L時，陽性模板及陰性模板的PCR體系的熒光差別不大。而在1-8mmol/L之間，陽性模板及陰性模板的PCR體系的熒光強度差別明顯，所以Mg2+的濃度選擇在1-8mmol/L之間。
實施例2將本發(fā)明配制如下試劑盒其原料選用如下分子燈標探針探針的靶序列位于乙型肝炎病毒基因序列保守區(qū)，該探針適用于四種乙型肝炎亞型(adr、adw、ayr、ayw)，并具有典型的溫度變性及復(fù)性特征和良好的特異性。5’端用FAM標記，3’端用DABCYL標記。
其序列為FAM-5’-CGAGCATCTTCTGCGACGCGGGCTCG-3’-DABCY委托上海申友生物技術(shù)有限公司合成。
PCR引物擴增片段包含有分子燈標探針靶序列，擴增片段長度為180bp，由大連寶生物工程有限公司合成，序列為上游引物5’-CACCAAATGCCCCTATCTTA-3’下游引物5’-GTTTCCCACCTTATGAGTCC-3’。
Taq酶購自上海生工生物工程公司，濃度5U/ul。附10×PCR反應(yīng)緩沖液(100mmol/LKCl，80mmol/L(NH4)2SO4，100mmol/L Tris-HCl，pH9.0，NP-40)及MgCl2溶液(濃度為25mmol/L)。
dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)購自上海生工生物工程公司，濃度100mmol/L樣品來源血清樣品分別由天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院及南開大學(xué)衛(wèi)生院提供。
PCR薄壁反應(yīng)管購自上海生工生物工程公司，規(guī)格200ul。
化學(xué)試劑NP-40Fluka進口分裝。
試劑盒成分如下1×PCR反應(yīng)緩沖液(10mmol/L KCl，8mmol/L (NH4)2SO4，10mmol/LTris-HCl，pH9.0，NP-40)，1.5mmol/L MgCl2，各0.4mmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，各0.4μmol/L的上、下游引物，2.5U Taq DNA聚合酶，0.3μmol/L分子燈標探針。
檢測步驟如下(一)血清樣品中乙型肝炎病毒DNA的提取在1.5ml離心管內(nèi)，將95μl人血清與5NP-40充分混合，在56℃水浴中溫育1小時后，在沸水中煮8分鐘，最后以10000r/min離心5分鐘。取上層清液作為PCR反應(yīng)的模板。
(二)PCR擴增反應(yīng)(1)PCR反應(yīng)混合液將2μl上述處理的血清樣品作為模板加入到試劑盒中進行PCR擴增，擴增反應(yīng)液總體積為25μl，成分如下1×PCR反應(yīng)緩沖液(10mmol/L KCl，8mmol/L (NH4)2SO4，10mmol/LTris-HCl，pH9.0，NP-40)，1.5mmol/L MgCl2，各0.4mmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，各0.4μmol/L的上、下游引物，2.5U Taq DNA聚合酶，0.3μmol/L分子燈標探針，2μl模板。
(2)PCR擴增條件 (一)結(jié)果判定(1)PCR反應(yīng)液熒光強度的測定PCR反應(yīng)完成后，在室溫下用75μl PCR反應(yīng)緩沖液(含1.5mmol/L MgCl2)將反應(yīng)液稀釋到100μl，加入微量熒光比色池中在熒光分光光度計(Ex＝490nm，Em＝517.5nm)上測定體系熒光強度。
(2)結(jié)果判定以正常血清標本為陰性對照，將它們熒光強度的平均值加上4倍標準偏差作為判定標準，把熒光強度高于此標準(F＝14.8)的血清樣品判定為乙型肝炎病毒感染的血清，而將低于此標準的判定為正常血清。
試劑盒專一性的確定分別將正常人血清、攜帶有乙型肝炎病毒的人血清、攜帶有丙型肝炎病毒的人血清及攜帶有戊型肝炎病毒的人血清進行乙型肝炎病毒DNA提取后取2μl上層清液試劑盒中作為PCR反應(yīng)的模板，以2μl水為陰性參照進行PCR擴增，按上面提到的方法進行檢測。結(jié)果表明，除攜帶有乙型肝炎病毒的血清標本產(chǎn)生了較強的熒光外，其余的四個反應(yīng)體系的熒光強度均在判定標準以下，被判定為陰性，說明試劑盒具有很好的專一性。
另外，將等量的含乙型肝炎病毒的血清與含丙型肝炎病毒的血清混合作為乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒共感染血清，將等量的含乙型肝炎病毒的血清與含戊型肝炎病毒的血清混合作為乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清，將等量的含丙型肝炎病毒的血清與含戊型肝炎病毒的血清混合作為丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清，將等量的含乙型肝炎病毒的血清、含丙型肝炎病毒的血清及含戊型肝炎病毒的血清混合作為乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清，分別以這四種血清按上述方法進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒共感染血清的熒光強度低于檢測標準外，其它三種血清樣本均可使分子燈標產(chǎn)生較強的熒光，且熒光強度與乙型肝炎病毒單獨感染的血清相當(dāng)。這說明分子燈標可用于混合感染的血清中乙型肝炎病毒的檢測，而不受共存的其他病毒干擾。
試劑盒檢測血清中乙型肝炎病毒的敏感性將已知病毒數(shù)目的陽性血清用正常人血清進行10倍連續(xù)稀釋，分別按上面提到的方法進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光強度隨血清中病毒拷貝數(shù)的增多呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢，當(dāng)血清中乙型肝炎病毒達到16拷貝/ml時，熒光強度即可達到檢測標準之上，當(dāng)血清中乙型肝炎病毒達到160拷貝/ml時，熒光強度明顯高于檢測標準，由此可見，將PCR擴增與分子燈標檢測相結(jié)合，可檢測出每毫升血清中30個以上病毒拷貝的存在。與瓊脂糖凝膠電泳-溴化乙錠染色相比，靈敏度大大提高。
實際血清樣品的測定將92臨床血清樣品(30個正常血清，62乙型肝炎病毒感染血清)按上面提到的方法用試劑盒進行檢測，均獲得了正確的檢測結(jié)果。結(jié)果見下表。


其中，1-30為正常血清，31-92含有乙型肝炎病毒的血清?？梢姳驹噭┖芯哂袠O高的靈敏度，可以檢測出血清中30個以上病毒拷貝的存在，且操作簡便，適用于大批量血清樣品的同時檢測，另外，該方法具有極高的特異性，還可用于混合感染的血清中乙型肝炎病毒的檢測，而不受共存的其他病毒的干擾。
權(quán)利要求
1.一種均相熒光探針PCR乙型肝炎病毒檢測方法，其特征在于，該方法包括下述步驟(1)血清樣品中乙型肝炎病毒DNA的提?。?2)在分子燈標探針的存在下，對提取的乙型肝炎病毒DNA進行PCR擴增；(3)測定PCR反應(yīng)體系的熒光強度，判定標本中是否存在乙型肝炎病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的均相熒光探針PCR乙型肝炎病毒檢測方法，其特征在于所說的分子燈標探針在乙型肝炎病毒基因保守區(qū)設(shè)計與靶序列互補的分子燈標探針，5’端用FAM標記，3’端用DABCYL標記，其序列為FAM-5’-CGAGCATCTTCTGCGACGCGGGCTCG-3’-DABCYL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的的均相熒光探針PCR乙型肝炎病毒檢測方法，其特征在于所說的PCR擴增其選擇的PCR引物擴增片段包含有分子燈標探針靶序列，擴增片段長度為180bp，引物序列為上游引物5’-CACCAAATGCCCCTATCTTA-3’；下游引物5’-GTTTCCCACCTTATGAGTCC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的均相熒光探針PCR乙型肝炎病毒檢測方法，其特征在于所說的PCR擴增條件95℃ 5分鐘→94℃ 30秒→51℃ 30秒→72℃ 30秒→95℃ 5分鐘→56℃15分鐘，其中94℃ 30秒→51℃ 30秒→72℃ 30秒之間進行40次循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說的均相熒光探針PCR乙型肝炎病毒檢測方法，其特征在于所說的PCR反應(yīng)混合液中Mg2+的濃度在1-8mmol/Ｌ之間。
6.一種均相分子燈標熒光探針PCR乙型肝炎病毒檢測的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括1×PCR反應(yīng)緩沖液10mmol/L KCl，8mmol/L (NH4)2SO4，10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，NP-40；1.5mmol/L MgCl2，各0.4mmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，各0.4μmol/L的上、下游引物，2.5U Taq DNA聚合酶，0.3μmol/L分子燈標探針。
全文摘要
本發(fā)明是一種均相分子燈標熒光探針PCR乙肝病毒檢測方法。根據(jù)乙型肝炎病毒基因序列,在其保守區(qū)設(shè)計特異性分子燈標探針,用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)對乙型肝炎病毒基因特異性片段進行擴增,使用分子燈標探針對擴增產(chǎn)物進行檢測,檢測過程通過對反應(yīng)體系進行直接的熒光測定即可完成,根據(jù)體系的熒光強度,判定標本中是否存在乙型肝炎病毒,該方法可檢測出血清中30以上個病毒拷貝的存在,且操作簡便,適用于大批量血清樣品的同時檢測。本發(fā)明還提供了應(yīng)用該方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/25GK1357634SQ01136949
公開日2002年7月10日 申請日期2001年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月26日
發(fā)明者沈含熙, 孔德明, 古瓏 申請人:南開大學(xué)