人乳頭瘤病毒l1l2衣殼蛋白相互作用位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子病毒學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1與次要衣殼蛋白L2相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。所述蛋白結(jié)合位點(diǎn)及區(qū)域可用于作為預(yù)防HPV感染及由HPV感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等的靶位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及HPV突變型L1蛋白。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物以及所述藥物組合物用于制備治療和/預(yù)防和/輔助治療HPV感染或者由HPV感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等的用途。
CCTCC NO:C201268
2012.05.31
【專利說明】人乳頭瘤病毒L1L2衣殼蛋白相互作用位點(diǎn)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子病毒學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1 與次要衣殼蛋白L2相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。所述蛋白結(jié)合位點(diǎn)可用于作為預(yù)防HPV感染及 由HPV感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等的靶位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及HPV突變型L1蛋白。本 發(fā)明還涉及一種藥物組合物以及所述藥物組合物用于制備治療和/預(yù)防和/輔助治療HPV 感染或者由HPV感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV)屬于乳頭瘤病毒科 (Papillomaviridae)乳頭瘤病毒屬，為無包膜DNA病毒。該病毒基因組為雙鏈閉環(huán)DNA，大 小約為7. 2 - 8kb，具有8個(gè)開放閱讀框。HPV病毒顆粒直徑為45 - 55nm，核衣殼呈20面 體對(duì)稱，有72個(gè)殼微粒，由L1及L2組成。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多種型的HPV中，根據(jù)其 與腫瘤發(fā)生的關(guān)系可以分為兩類：低危型一包括HPV6和HPV11，致癌風(fēng)險(xiǎn)低，主要引起尖銳 濕疣；高危型一包括即￥16、18、31、33、35、39、45、52、58、59等，是導(dǎo)致包括女性宮頸癌在內(nèi) 的多種腫瘤疾病的主要原因 （Clifford GM，Smith JS，Plummer M, et al. Br J Cancer, 2003, 88(1) :63-73)。
[0003] HPV LI蛋白為主要衣殼蛋白，分子量為55 - 60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多 種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HPV L1蛋白可形成在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然病毒顆粒相似的病毒樣顆粒 (Virus-Like Particle, VLP)。該病毒樣顆粒保留了病毒顆粒的天然表位，具有較強(qiáng)的免疫 原性，可誘導(dǎo)針對(duì)同型HPV病毒的中和抗體（Kirnbauer，R.，F(xiàn). Booy，et al. 1992Proc Natl Acad SciUSA89(24): 12180-4)。因此，VLP疫苗已成為HPV疫苗發(fā)展的主要方向。目前已 上市的hpv疫苗為Merck的Gai>das ￡ 1?及gsk的Cervar iX? ,上述兩種疫苗分別含有 HPV6/11/16/18及HPV16/18VLP。此外，現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，可以通過預(yù)防HPV感染來預(yù) 防宮頸癌等疾病的發(fā)生。
[0004] 研究表明，HPV L2約有473個(gè)氨基酸，分子量約為51KD，目前L2蛋白結(jié)構(gòu)尚未解 析。研究發(fā)現(xiàn)L2的N端和C端都有一段富含正電荷的氨基酸區(qū)域以及C端有一入核信號(hào) 膚，在病毒 DNA 核定位中有重要作用（Day PM.，Gambhira R.，Roden RB.，et al. Mechanisms of human papillomavirus typel6neutralization by 12cross_neutralizing and lltype-specific antibodies.J Virol. 2008May ；82(9):4638-46. Epub2008Feb27.)〇 L2 在病毒感染初期的免疫逃逸、入侵宿主細(xì)胞、病毒DNA的核定位及病毒顆粒的高效組裝等 過程中均具有重要作用（Fahey LM.，Raff AB.，Da Silva DM. A major role for the minor capsid protein of human papillomavirus typel6in immune escape J Immunol. 2009Novl5 ； 183 (10) : 6151-6. Epub20090ct28)。隨著研究的深入，人們逐漸對(duì)HPV的入胞和致癌機(jī)制等 均有一定的認(rèn)識(shí)，但天然HPV顆粒的組裝機(jī)制及其成熟釋放的過程及HPVL1與L2相互作用 尚未完全清楚。目前，HPV16L2與L1相互作用位點(diǎn)的研究?jī)H有報(bào)道L2通過其C端396-439 位附近的氨基酸與L1疏水相互作用插入到五聚體背面的空洞中，僅有一小段暴露在表面 (Finnen RL, Erickson KD, Chen XS, et al, Interactions between papillomavirus LI and L2capsid proteins. J Virol. 2003Apr ;77 (8) :4818-26)。然而這些研究缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支 持，且描述的L1和L2的作用區(qū)域過于寬泛，應(yīng)用價(jià)值有限。
[0005] 因此，研究HPV的衣殼組裝和HPVL1與L2相互作用對(duì)HPV預(yù)防性和治療性疫苗設(shè) 計(jì)及HPV與宮頸癌之間的致病研究具有重要指導(dǎo)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人經(jīng)過深入地研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了位于HPV L1蛋白上的4個(gè)氨基 酸位點(diǎn)。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)氨基酸位點(diǎn)是L1蛋白與L2蛋白相互作用的位點(diǎn)。通 過篩選抑制這些作用位點(diǎn)的藥物，能夠得到抑制HPV特別是HPV16以及治療和/或預(yù)防和 /輔助治療宮頸癌的藥物。由此提供了下述發(fā)明：
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種分離的多肽，其氨基酸序列為：SEQID N0 :1中的第 256、315、317、340位中的任意一個(gè)或者任意幾個(gè)位點(diǎn)（例如2、3或4個(gè)）發(fā)生突變、替換 或缺失；具體地，所述4個(gè)位點(diǎn)中的任意一個(gè)或者任意幾個(gè)（例如2、3或4個(gè)）位點(diǎn)突變?yōu)?丙氨酸；更具體地，為 SEQ IDN0 :9、SEQ IDN0 :19、SEQ IDN0 :20 或 SEQ IDN0 :21 所示的序列。 具體地，所述分離的多肽為HPV突變型L1蛋白。
[0008] 本發(fā)明的另一方面涉及一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的分離的多肽；具體 地，所述多核苷酸的序列如 SEQ IDN0 :33、SEQ IDN0 :43、SEQ IDN0 :44 或 SEQ IDN0 :45 所示。
[0009] 本發(fā)明的再一方面涉及一種重組載體，其含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同的本發(fā)明的 多核苷酸；具體地，所述重組載體為重組pAAV或重組pT0-T7。
[0010] 本發(fā)明的再一方面涉及一種重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的重組載體；具體地，所 述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明的再一方面涉及一種融合蛋白，其含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同的本發(fā)明的 分離的多肽。
[0012] 本發(fā)明的再一方面涉及一種假病毒，其含有本發(fā)明的重組載體；具體地，所述假病 毒為HPV假病毒；更具體地，所述假病毒為HPV16假病毒。
[0013] 本發(fā)明的再一方面涉及一種病毒樣顆粒（VLPs)，其含有本發(fā)明的多肽或者本發(fā)明 的融合蛋白。
[0014] 本發(fā)明的再一方面涉及一種組合物，其包含一個(gè)或多個(gè)相同或不同的本發(fā)明的多 肽或者本發(fā)明的融合蛋白；具體地，所述組合物，其還包含HPV野生型L1蛋白和/或HPV野 生型L2蛋白；具體地，所述HPV野生型L1蛋白為HPV16野生型L1蛋白；具體地，所述HPV 野生型L2蛋白為HPV16野生型L2蛋白。
[0015] 本發(fā)明的實(shí)施例證明，野生型HPV16L1的第256、315、317或340位點(diǎn)突變后，L1和 L2不能正常相互作用組成衣殼。本發(fā)明涉及的相互作用位點(diǎn)可以用于篩選與HPVL1相結(jié)合 的藥物，進(jìn)而可以抑制或阻斷HPVL1&L2在人體細(xì)胞中的顆粒組裝，達(dá)到抑制感染HPV的病 人體內(nèi)的HPV持續(xù)感染，從而可以控制或治療HPV感染引起的疾病如宮頸癌。本發(fā)明的多 肽或者融合蛋白可以作為陰性對(duì)照。
[0016] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的組合物在篩選抑制HPV的藥物或者治療和/或預(yù) 防和/輔助治療HPV所致疾病例如宮頸癌的藥物中的用途；具體地，所述HPV為HPV16 ;具 體地，所述宮頸癌為HPV16所致宮頸癌。
[0017] 本發(fā)明的再一方面涉及一種篩選抑制HPV的藥物或者治療和/或預(yù)防和/輔助治 療HPV所致疾病例如宮頸癌的藥物的方法，包括使用本發(fā)明的組合物的步驟；具體地，所述 HPV為HPV16 ;具體地，所述宮頸癌為HPV16所致宮頸癌。
[0018] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的多肽、多核苷酸、重組載體、重組細(xì)胞、融合蛋白、 假病毒或者病毒樣顆粒在制備抑制HPV的藥物或者治療和/或預(yù)防和/輔助治療HPV所致 疾病例如宮頸癌的藥物（例如宮頸癌疫苗）中的用途。
[0019] 本發(fā)明的實(shí)施例證明，野生型HPV16L1的第256、315、317或340位點(diǎn)突變后，這4 個(gè)點(diǎn)突變蛋白的這12個(gè)抗原表位均未發(fā)生顯著變化，位點(diǎn)突變后仍能保持與原野生型相 同的構(gòu)象。
[0020] 本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋
[0021] 在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供 相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"HPVL1"是指人乳頭瘤病毒（HPV)的L1蛋白，其序列是本領(lǐng)域 公知的（參見，例如NCBI數(shù)據(jù)庫序列號(hào)：DQ469930. 1)。在本發(fā)明中，當(dāng)涉及HPV L1的序列 時(shí)，如果沒有特別說明，參考 Chen, X. S.，Garcea, R. L.，and Harrison, S. C. et al. 2000. Mol Cell, 5(3) :557-567.其使用 NCBI 數(shù)據(jù)庫序列號(hào)：DQ469930. 1(SEQ ID NO :1)進(jìn)行描述。
[0023] 本發(fā)明中"野生型HPV LI" 一詞指的是，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，純化而制備的野 生型HPVL1蛋白。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"HPV L1突變蛋白"是指，在L1蛋白中的某一位或某幾位氨基酸 殘基進(jìn)行缺失或用其它氨基酸殘基置換所獲得的蛋白質(zhì)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"HPVX Y Z"是指，用Z氨基酸殘基的置換HPV型L1蛋白質(zhì)N末 端的第Y位的X氨基酸殘基所獲得的蛋白質(zhì)。如"HPV-F256A"指用丙氨酸（A)殘基置換 HPVL1蛋白質(zhì)N末端的第256位的半胱氨酸（F)殘基所獲得的蛋白質(zhì)。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"HPVL2"是指人乳頭瘤病毒（HPV)的L2蛋白，其序列是本領(lǐng)域 公知的（參見，例如NCBI數(shù)據(jù)庫序列號(hào)：CAC51368. 1)。在本發(fā)明中，當(dāng)涉及HPV L2的序列 時(shí)，如果沒有特別說明，參考 Ramon Pereira，Inga I. Hitzeroth，Edward P. Rybicki. 2009. Arch Virol, 154:187-197.其使用 NCBI 數(shù)據(jù)庫序列號(hào)：CAC51368. 1 (SEQ ID NO :97)進(jìn)行描 述。
[0027] 本發(fā)明中的術(shù)語"SAS"是指，利用Discovery Studio軟件分析蛋白質(zhì)的溶劑可及 化表面積（solvent accessibility surfaces, SAS)。SAS表示氨基酸可以接觸到溶劑的表 面積占整個(gè)氨基酸表面積的比例，是反映氨基酸暴露程度的一個(gè)指標(biāo)，其值越大表明該氨 基酸暴露在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面的程度越高。
[0028] 本發(fā)明中"載體"一詞指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲 得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì) 元件在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)得以表達(dá)。舉例來說，載體包括：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色 體如酵母人工染色體（YAC)、細(xì)菌人工染色體（BAC)或P1來源的人工染色體（PAC);噬菌體 如λ噬菌體或M13噬菌體及動(dòng)物病毒等。用作載體的動(dòng)物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄酶病毒（包括 慢病毒）、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒（如單純皰疹病毒）、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病 毒、乳頭多瘤空泡病毒（如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動(dòng)子序 列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。 載體還有可能包括有協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只 有這些物質(zhì)。
[0029] 本發(fā)明中的"單抗"一詞指的是由雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗。單抗對(duì)抗原上的單一表 位具有高特異性。單抗與多抗不同，多抗是包含了識(shí)別抗原上的不同表位的抗體分子。如， 本發(fā)明涉及的單抗可采用Kohler等首次報(bào)道的雜交瘤技術(shù)獲得（Nature, 256:495, 1975)
[0030] 本發(fā)明中"抗體滴度"一詞指的是，利用間接法ELISA檢測(cè)抗原與抗體的結(jié)合水 平，以反應(yīng)呈陽性的最高的抗體稀釋度表示，反應(yīng)滴度越高，則抗原與抗體的結(jié)合越強(qiáng)。若 抗體與幾個(gè)抗原的反應(yīng)滴度相當(dāng)，則說明這幾個(gè)抗原的該抗體表位的結(jié)構(gòu)是相似的。
[0031] 本發(fā)明中的假病毒指利用HPV VLP可非特異性包裝核酸的特性，通過在細(xì)胞內(nèi)表 達(dá)HPV的L1和L2蛋白，通過包裹細(xì)胞內(nèi)的游離體病毒DNA或外源導(dǎo)入的報(bào)告質(zhì)粒，組成 HPV 假病毒（Yeager, M. D, Aste-Amezaga, M. et al (2000) Virology (278) 570 - 7)。具體方法 包括重組病毒表達(dá)系統(tǒng)法及多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法。
[0032] 本發(fā)明中的野生型假病毒指在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)野生型的L1和L2蛋白，通過包裹細(xì)胞 內(nèi)的游離體病毒DNA或外源導(dǎo)入的報(bào)告質(zhì)粒，組成HPV假病毒。
[0033] 本發(fā)明中的HPV突變假病毒是指在假病毒的L1或L2基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變， 而后使用與制備假病毒同樣的方法進(jìn)行制備。如
[0034] 本發(fā)明中的TCID5(I是指，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（Tissue culture infective dose，TCID5(I)，又稱50%組織細(xì)胞感染量，反映感染性滴度，即指能在半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)板或孔 內(nèi)引起細(xì)胞病變的病毒量。
[0035] 感染滴度，反映病毒的感染能力，用TCID5(l/ml來表示，即每毫升病毒溶液稀釋多 少倍之后仍具有能在半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)板或孔內(nèi)引起細(xì)胞病變的病毒量。因此，數(shù)值越高，感染 能力越強(qiáng)。
[0036] 本發(fā)明提供了一種雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法（Sandwich ELISA)檢測(cè)假病毒 中衣殼蛋白L1含量的方法。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種蛋白免疫印跡方法（Westren-blot)檢測(cè)假病毒中衣殼蛋白 L2方法。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種免疫共沉淀方法（Co-IP)檢測(cè)假病毒中衣殼蛋白L1和L2相 互作用的方法。
[0039] "序列相同百分比"一詞指的是候選序列中的核酸或氨基酸分別與對(duì)應(yīng)的核酸 或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。這里涉及到的與核酸序列或者多肽序列有 關(guān)的術(shù)語"序列相似百分比"定義為候選核酸序列或氨基酸殘基序列分別與目的核酸序 列或氨基酸序列的相似百分比。對(duì)于某一個(gè)序列，將它和目的序列進(jìn)行比對(duì)，必要時(shí)可跳 過突變?nèi)笨?，以達(dá)到最大的基因相似百分比，而不去考慮相似序列的任意保守性突變。本 領(lǐng)域的多種比對(duì)方法可用于確定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的計(jì)算機(jī)軟件包括 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)等。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的工作人員懂 得給比對(duì)設(shè)定合適的測(cè)量參數(shù)，包括為使用最大可比性的一些運(yùn)算法則達(dá)到而全長(zhǎng)序列的 比較。
[0040] 發(fā)明的有益效果
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的主要衣殼蛋白L1與次要衣殼蛋白L2相互作用的 結(jié)合位點(diǎn)具有顯著的有利方面。特別地，本發(fā)明的結(jié)合位點(diǎn)能夠阻斷L1和L2蛋白形成HPV 衣殼，從而使其在病毒的預(yù)防與治療方面具有特別顯著的優(yōu)勢(shì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖1 :pAAV-HPV16L123個(gè)突變載體構(gòu)建過程中的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果。泳道樣 品順序如下：泳道1 :pAAV-H16Ll-E106A質(zhì)粒；泳道2 :pAAV-H16Ll-F248A質(zhì)粒；泳道3 : PAAV-H16L1-Y249A 質(zhì)粒；泳道 4 :pAAV-H16Ll-L250A 質(zhì)粒；泳道 5 :pAAV-H16Ll-R251A 質(zhì)粒；泳道 6 :pAAV-H16Ll-R252A 質(zhì)粒；泳道 7 :pAAV-H16Ll-Q254A 質(zhì)粒；泳道 8 : PAAV-H16L1-F256A 質(zhì)粒；泳道 9 :pAAV-H16Ll-S298A 質(zhì)粒；泳道 10 :pAAV-H16Ll-M299A 質(zhì)粒；泳道 11 :pAAV-H16Ll-T301A 質(zhì)粒；泳道 12 :pAAV-H16Ll-D303A 質(zhì)粒；泳道 13 : PAAV-H16L1-N308A 質(zhì)粒；泳道 14 :pAAV-H16Ll-K309A 質(zhì)粒；泳道 15 :pAAV-H16Ll-P310A 質(zhì)粒；泳道 16 :pAAV-H16Ll-W312A 質(zhì)粒；泳道 17 :pAAV-H16Ll-Q314A 質(zhì)粒；泳道 18 : PAAV-H16L1-R315A 質(zhì)粒；泳道 19 :pAAV-H16Ll-Q317A 質(zhì)粒；泳道 20 :pAAV-H16Ll-T340A 質(zhì)粒；泳道 21 :pAAV-H16Ll-K467A 質(zhì)粒；泳道 22 :pAAV-H16Ll-L470A 質(zhì)粒；泳道 23 : PAAV-H16L1-Q471A質(zhì)粒。結(jié)果顯示，成功地構(gòu)建了 23個(gè)pAAV-HPV16Ll突變質(zhì)粒。
[0043] 圖2 :pAAV_16Ll突變載體質(zhì)粒酶切結(jié)果。泳道樣品順序如下：泳道1 : PAAV-H16L1-E106A 質(zhì)粒；泳道 2 :pAAV-H16Ll-F248A 質(zhì)粒；泳道 3 :pAAV-H16Ll-Y249A 質(zhì)粒；泳道 4 :pAAV-H16Ll-L250A 質(zhì)粒；泳道 5 :pAAV-H16Ll-R251A 質(zhì)粒；泳道 6 : PAAV-H16L1-R252A 質(zhì)粒；泳道 7 :pAAV-H16Ll-Q254A 質(zhì)粒；泳道 8 :pAAV-H16Ll-F256A 質(zhì)粒；泳道 9 :pAAV-H16Ll-S298A 質(zhì)粒；泳道 10 :pAAV-H16Ll-M299A 質(zhì)粒；泳道 11 : PAAV-H16L1-T301A 質(zhì)粒；泳道 12 :pAAV-H16Ll-D303A 質(zhì)粒；泳道 13 :pAAV-H16Ll-N308A 質(zhì)粒；泳道 14 :pAAV-H16Ll-K309A 質(zhì)粒；泳道 15 :pAAV-H16Ll-P310A 質(zhì)粒；泳道 16 : PAAV-H16L1-W312A 質(zhì)粒；泳道 17 :pAAV-H16Ll-Q314A 質(zhì)粒；泳道 18 :pAAV-H16Ll-R315A 質(zhì)粒；泳道 19 :pAAV-H16Ll-Q317A 質(zhì)粒；泳道 20 :pAAV-H16Ll-T340A 質(zhì)粒；泳道 21 : PAAV-H16L1-K467A 質(zhì)粒；泳道 22 :pAAV-H16Ll-L470A 質(zhì)粒；泳道 23 :pAAV-H16Ll-Q471A 質(zhì) 粒。結(jié)果顯示，成功地構(gòu)建了 23個(gè)pAAV-HPV16Ll突變基因。
[0044] 圖3 :蛋白質(zhì)印跡對(duì)各突變假病毒的L1和L2蛋白量的檢測(cè)結(jié)果。泳道1 :L1蛋白； 泳道2 :L2蛋白；泳道3 :E106A突變假病毒；泳道4 :F248A突變假病毒；泳道5 :Y249A突變 假病毒；泳道6 :L250A突變假病毒；泳道7 :R251A突變假病毒；泳道8 :R252A突變假病毒； 泳道9 :Q254A突變假病毒；泳道10 :F256A突變假病毒；泳道11 :S298A突變假病毒；泳道 12 :M299A突變假病毒；泳道13 :T301A突變假病毒；泳道14 :D303A突變假病毒；泳道15 : N308A突變假病毒；泳道16 :K309A突變假病毒；泳道17 :P310A突變假病毒；泳道18 :W312A 突變假病毒；泳道19 :Q314A突變假病毒；泳道20 :R315A突變假病毒；泳道21 :Q317A突變 假病毒；泳道22 :T340A突變假病毒；泳道23 :K467A突變假病毒；泳道24 :L470A突變假病 毒；泳道25 :Q471A突變假病毒；泳道26 :HPV16野生型假病毒。結(jié)果顯示，除E106A、N308A 和W312A突變后未表達(dá)L1蛋白外，其余均正常表達(dá)。
[0045] 圖4 :使用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定不同L1突變構(gòu)建的突變假病毒以及野生型 HPV16假病毒中L1含量測(cè)定結(jié)果。wt，wildtype，野生型HPV16假病毒，Llalone，野生型 HPV16L1但無 L2的假病毒。結(jié)果顯示，除了 E106A、N308A和W312A突變后未表達(dá)L1蛋白 夕卜，其余均正常表達(dá)。
[0046] 圖5 :6個(gè)純化后的HPV16L1突變蛋白以及野生型HPV16L1蛋白SDS-PAGE結(jié)果。其 中 1 為野生型 HPV16L1，2 為 HPV16L1-F256A，3 為 HPV16L1-R315A，4 為 HPV16L1-Q317A，5 為 HPV16L1-T340A，6 為 HPV16L1-R251A，7 為 HPV16L1-T301A，8 為 HPV16L1 - K476A。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，4個(gè)HPV16L1突變蛋白純化純度均達(dá)到了 95%左右。
[0047] 圖6 :使用透射電鏡觀察HPV16L1突變蛋白的結(jié)果。其中圖6A為野生型HPV16L1， 圖 6B 為 HPV16L1-F256A，圖 6C 為 HPV16L1-R315A，圖 6D 為 HPV16L1-Q317A，圖 6E 為 HPV16L1-T340A，圖 6F 為 HPV16L1 - R251A，圖 6G 為 HPV16L1 - T301A，圖 6H 為 HPV16L1 -K476A。結(jié)果顯示，HPV16L1突變蛋白在電鏡視野下均能觀察到均一的直徑約為50nm的顆粒， 表明這些位點(diǎn)突變后不影響VLP的形成。
[0048] 圖 7 :通過間接法 ELISA 檢測(cè) HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、 HPV16L1-T340A以及野生型HPV16L1蛋白與HPV16抗體的反應(yīng)性。檢測(cè)結(jié)果表明， HPV16L1-F256A、HPV16L1-R315A、HPV16L1-Q317A、HPV16L1-T340A 蛋白與 HPV16 抗體的反應(yīng) 滴度在105-107之間，與野生型HPV16L1與HPV16抗體的反應(yīng)性相當(dāng)。
[0049] 圖8 :最低稀釋度的不同突變L1構(gòu)建的突變假病毒感染293FT細(xì)胞表達(dá)GFP在 熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果。A :野生型HPV16假病毒；B :單獨(dú)L1形成的HPV16假病毒；C : 單獨(dú)L2形成的HPV16假病毒；D :H16L1-E106A突變假病毒；E :H16L1-F248A突變假病毒； F :H16L1-Y249A突變假病毒；G :H16L1-L250A突變假病毒；H :H16L1-R251A突變假病毒；I : H16L1-R252A突變假病毒；J :H16L1-Q254A突變假病毒；K :H16L1-F256A突變假病毒；L : H16L1-S298A突變假病毒；M :H16L1-M299A突變假病毒；N :H16L1-T301A突變假病毒；0 : H16L1-D303A突變假病毒；P :H16L1-N308A突變假病毒；Q :H16L1-K309A突變假病毒；R : H16L1-P310A突變假病毒；S :H16L1-W312A突變假病毒；T :H16L1-Q314A突變假病毒；U : H16L1-R315A突變假病毒；V :H16L1-Q317A突變假病毒；W :H16L1-T340A突變假病毒；X : H16L1-K417A突變假病毒；Y :H16L1-L470A突變假病毒；Z :H16L1-Q371A突變假病毒。結(jié) 果顯示，單獨(dú)的L1蛋白形成的假病毒，單獨(dú)L2形成的假病毒以及H16L1-E106A突變假病 毒，H16L1-N308A突變假病毒和H16L1-W312A突變假病毒無法感染293FT細(xì)胞使報(bào)告基因 表達(dá)，而H16L1-F256A突變假病毒、H16L1-R315A突變假病毒、H16L1-R317A突變假病毒和 H16L1-T340A突變假病毒的感染滴度顯著降低。其余突變假病毒感染能力與野生型假病毒 相當(dāng)。
[0050] 圖9 :不同L1突變構(gòu)建的突變假病毒的感染滴度結(jié)果。wt，Wildtype，野生型HPV16 假病毒；Llalone，野生型HPV16L1但無 L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2但無 L1的假 病毒。結(jié)果顯示，單獨(dú)的L1蛋白形成的假病毒，單獨(dú)L2形成的假病毒以及H16L1-E106A突 變假病毒，H16L1-N308A突變假病毒和H16L1-W312A突變假病毒無法感染293FT細(xì)胞使報(bào) 告基因表達(dá)，而H16L1-F256A突變假病毒、H16L1-R315A突變假病毒、H16L1-R317A突變假病 毒和H16L1-T340A突變假病毒的感染滴度顯著降低。其余突變假病毒感染能力與野生型假 病毒相當(dāng)。
[0051] 圖10 :1〇Α - 10C顯示了不同突變L1構(gòu)建的突變假病毒感染293FT細(xì)胞后，由流 式細(xì)胞儀檢測(cè)其感染率的結(jié)果；圖10D是突變假病毒感染率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。wt，wildtype，野 生型HPV16假病毒；Llalone，野生型HPV16L1但無 L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2 但無 L1的假病毒。結(jié)果顯示了單獨(dú)的L1蛋白形成的假病毒，單獨(dú)L2形成的假病毒以及 H16L1-E106A突變假病毒，H16L1-N308A突變假病毒和H16L1-W312A突變假病毒無法感 染293FT細(xì)胞使報(bào)告基因表達(dá)，而H16L1-F256A突變假病毒、H16L1-R315A突變假病毒、 H16L1-R317A突變假病毒和H16L1-T340A突變假病毒的感染滴度顯著降低。其余突變假病 毒感染能力與野生型假病毒相當(dāng)。
[0052] 圖11 :蛋白免疫印跡分析結(jié)果。Wt，wildtype，野生型HPV16假病毒；Llalone，野 生型HPV16L1但無 L2的假病毒；L2alone，野生型HPV16L2但無 L1的假病毒；其余則為突 變假病毒；L1與L2分別指使用HPV16L1的單抗22E4以及HPVL2的單抗14H6對(duì)免疫共沉 淀的蛋白進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。圖11A顯示14H6抗體捕獲L2時(shí)，單獨(dú)L2檢測(cè)不到，野生型假 病毒中被免疫共沉淀下來的L1蛋白量比4個(gè)H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A和 H16L1-T340A突變假病毒的L1多圖；11B顯示了野生型假病毒中被共沉淀的L2蛋白量較 H16L1-F256A、H16L1-R315A、H16L1-Q317A 和 H16L1-T340A 這 4 個(gè)突變假病毒多。
[0053] 關(guān)于生物材料保藏的說明
[0054] 本發(fā)明涉及以下生物材料：
[0055] 雜交瘤細(xì)胞HPV14H6,其于2012年5月31日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCN0:C201268,保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，430072。

【具體實(shí)施方式】
[0056] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0057] 除非特別指明，本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測(cè)法，基本上 參照J(rèn). Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,以及 F. M. Ausubel等人，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述 的方法進(jìn)行；限制性內(nèi)切酶的使用依照產(chǎn)品制造商推薦的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施 例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
[0058] 實(shí)施例1 :計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)HPV16L1與HPV16L2相互作用位點(diǎn)
[0059] 本實(shí)驗(yàn)室用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析與模擬的Discovery Studio軟件購自美國(guó) Accelrys公司。利用Discovery Studio軟件分析HPVL1五聚體可能與L2相互作用的表面 氨基酸，通過氨基酸的溶劑可及化表面積（solvent accessibility surfaces, SAS)來評(píng)價(jià)。 SAS表示氨基酸可以接觸到溶劑的表面積占整個(gè)氨基酸表面積的比例，是反映氨基酸暴露 程度的一個(gè)指標(biāo)，其值越大表明該氨基酸暴露在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面的程度越高（Le Grand，S. Μ. ,Eyrand,V. An algorithm for the representation and conputatio of suermolecular surface and volumes. J. Comp. Chen. 1989, 10:868-871)。其中，篩選出 23 個(gè)位點(diǎn)，其 SAS 在 15%以上，如表1。
[0060] 不拘于理論的限制，由于丙氨酸體積小、無其他官能團(tuán)的甲基，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 的影響較小，若換成側(cè)鏈更小的甘氨酸，因其阿爾法-碳沒有手性，可能對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)有較大 影口向(Morrison, K. L. &ffeiss, G. A. Combinatorial alanine-scanning[J]. Curr Opin Chem Biol, 2001，5:302-307)。故采用丙氨酸掃描法將這23個(gè)位點(diǎn)逐一突變成丙氨酸，，驗(yàn)證其 是否是與L2相互作用的位點(diǎn)。這23個(gè)突變的L1大蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID N0 : 2 - 24所不，其編碼這些氨基酸序列的DNA序列分別如SEQ ID NO :26 - 48所不。
[0061] 表1 :計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)HPV16L1&L2可能相互作用位點(diǎn)（23個(gè)）
[0062]
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的多肽，其氨基酸序列為： SEQ ID NO :1中的第256、315、317、340位中的任意1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變、 替換或缺失；具體地，所述4個(gè)位點(diǎn)中的任意1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?；更?體地，為 SEQ IDN0 :9、SEQ IDN0 :19、SEQ IDN0 :20 或 SEQ IDN0 :21 所示的序列。
2. -種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的分離的多肽；具體地，所述多核苷酸 的核酸序列如 SEQ IDN0 :33、SEQ IDN0 :43、SEQ IDN0 :44 或 SEQ IDN0 :45 所示。
3. -種重組載體，其含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同的權(quán)利要求2所述的多核苷酸；具體 地，所述重組載體為重組pAAV或重組pT0-T7。
4. 一種重組宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的重組載體；具體地，所述重組細(xì)胞為重 組大腸桿菌細(xì)胞。
5. -種融合蛋白，其含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同的權(quán)利要求1所述的分離的多肽。
6. -種假病毒，其含有權(quán)利要求3所述的重組載體；具體地，所述假病毒為HPV假病 毒；更具體地，所述假病毒為HPV16假病毒。
7. -種病毒樣顆粒，其含有權(quán)利要求1所述的多肽或者權(quán)利要求5所述的融合蛋白。
8. -種組合物，其包含一個(gè)或多個(gè)相同或不同的權(quán)利要求1所述的多肽或者權(quán)利要求 5所述的融合蛋白；具體地，所述組合物，其還包含HPV野生型L1蛋白和/或HPV野生型L2 蛋白；具體地，所述HPV野生型L1蛋白為HPV16野生型L1蛋白；具體地，所述HPV野生型 L2蛋白為HPV16野生型L2蛋白。
9. 權(quán)利要求8所述的組合物在篩選抑制HPV的藥物或者治療和/或預(yù)防和/輔助治療 HPV所致疾病例如宮頸癌的藥物中的用途；具體地，所述HPV為HPV16 ;具體地，所述宮頸癌 為HPV16所致宮頸癌。
10. -種篩選抑制HPV的藥物或者治療和/或預(yù)防和/輔助治療HPV所致疾病例如宮 頸癌的藥物的方法，包括使用權(quán)利要求8的組合物的步驟；具體地，所述HPV為HPV16 ;具體 地，所述宮頸癌為HPV16所致宮頸癌。
11. 權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2所述的多核苷酸、權(quán)利要求3所述的重組載體、 權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的融合蛋白、權(quán)利要求6所述的假病毒或者權(quán) 利要求7所述的病毒樣顆粒在制備抑制HPV的藥物或者治療和/或預(yù)防和/輔助治療HPV 所致疾病例如宮頸癌的藥物（例如宮頸癌疫苗）中的用途。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104231060SQ201410234629
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月5日
【發(fā)明者】李少偉, 吳坤寶, 張麗, 劉亞靜, 王大寧, 俞海, 張軍, 夏寧邵 申請(qǐng)人:廈門大學(xué), 廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司