專利名稱：用于蛙虹彩病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于蛙虹彩病毒檢測(cè)的標(biāo) 準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)。
背景技術(shù)：
甲魚虹彩病毒(soft-shelled turtle iridovirus，STIV)是一種感染甲魚等爬行 類水產(chǎn)的虹彩病毒，其發(fā)病死亡率超過40% (Chen etal.，1999，Virus Res. 63，147-151)。 目前針對(duì)甲魚虹彩病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)方法(PCR，熒光定量PCR等)，主要使用根據(jù)該病 毒核衣殼蛋白(major capsid protein，MCP)基因中某段保守序列設(shè)計(jì)引物或探針，將陽性 核酸樣品和檢測(cè)樣品分別在相同反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進(jìn)行特異性擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì) 照陽性核酸樣品的目的基因或特殊信號(hào)曲線，判斷檢測(cè)樣品是否為陽性。若無陽性核酸，檢 測(cè)樣品擴(kuò)增出的目的基因或捕獲的信號(hào)曲線便無法判斷真?zhèn)巍Ｄ壳凹佐~虹彩病毒檢測(cè)中使用的陽性核酸對(duì)照樣品為從染病宿主器官或敏感細(xì) 胞系中提取的總DNA。也有報(bào)道將甲魚虹彩病毒MCP擴(kuò)增出連接入T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒 (Zhao et al. , 2007, VirusRes. 129，135-144)。但該重組質(zhì)粒僅用于基因測(cè)序，未進(jìn)行檢測(cè) 方法相關(guān)的研究。目前甲魚虹彩病毒檢測(cè)中使用的陽性核酸對(duì)照樣品有以下幾個(gè)缺陷1.制備時(shí)間過長(zhǎng)。需先人工感染宿主，或敏感細(xì)胞系，待5-7天，宿主組織器官充 分病變，或敏感細(xì)胞系CPE充分后，才可提取總DNA。2.總DNA包含大量宿主DNA，導(dǎo)致樣品純度差，病毒基因難以精確定量，且易出現(xiàn) 非特異性擴(kuò)增。3.如果直接用全病毒作為對(duì)照，還存在病原擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒，可在甲魚虹彩病毒的分子生物學(xué)檢 測(cè)中作為陽性參考物質(zhì)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案首先設(shè)計(jì)了一對(duì)可特異性擴(kuò)增甲魚虹彩病毒 核衣殼蛋白全基因的引物，其具有如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。用 其擴(kuò)增出的甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白全基因，具有如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列。然 后摸索出合適的PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，構(gòu)建并篩選含有甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白全基 因的重組質(zhì)粒，將其命名為pGEM-T-S。其可作為標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)用于甲魚虹彩病毒核衣 殼蛋白基因(STIV MCP)、流行性造血器官壞死病毒核衣殼蛋白基因(EHNV MCP)或虎紋蛙虹 彩病毒核衣殼蛋白基因(TFV MCP)的分子生物學(xué)檢測(cè)。所述分子生物學(xué)檢測(cè)為PCR或熒光 定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明制備的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)pGEM-T-S狀態(tài)穩(wěn)定，在4°C和_80°C皆可長(zhǎng)期保 存，反復(fù)凍融也不易降解。
PGEM-T-S溶液本身不摻雜其他組織DNA，純度高易定量，且不易產(chǎn)生分特異性擴(kuò) 增。即可應(yīng)用于PCR定性分析，也可用于熒光定量PCR制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。pGEM-T-S結(jié)構(gòu)包含STIV全MCP基因，可與所有根據(jù)MCP某段基因設(shè)計(jì)得引物特異 性結(jié)合，在分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。易于大量制備。將pGEM-T-S轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞后，涂平板進(jìn)行蘭白斑篩選。挑白 斑菌搖菌，再提取質(zhì)粒即可大量制備。一般只需2-3天時(shí)間。由于STIV MCP基因與流行性造血器官壞死病毒(Epizootichaematopoietic necrosis virus, EHNV)和虎紋蛙虹彩病毒(Tiger frogvirus, TFV)的MCP基因同源性超 過97%，因此pGEM-T-S也可作為標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)用于EHNV和TFV MCP基因的分子生物 學(xué)檢測(cè)。甲魚虹彩病毒與流行性造血器官壞死病毒和虎紋蛙虹彩病毒同屬蛙虹彩病毒屬。


圖1為本發(fā)明制備的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)pGEM-T-S的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為使用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)pGEM-T-S，作為模板，使用不同病毒檢測(cè) 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中M 分子量標(biāo)準(zhǔn)；-陰性對(duì)照；其他為相應(yīng)的病毒MCP特異性 引物擴(kuò)增結(jié)果；圖3為使用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)pGEM-T-S，作為模板，使用不同病毒檢測(cè) 引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果，其中M 分子量標(biāo)準(zhǔn)；信號(hào)曲線從上到下依次為STIV引 物探針、TFV引物探針以及EHNV引物探針。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)的構(gòu)建1.特異性引物設(shè)計(jì)及目的基因PCR擴(kuò)增根據(jù)甲魚虹彩病毒(STIV)核衣殼蛋白(MCP)全基因序列設(shè)計(jì)并合成引物 SPl (如 SEQ ID NO. 1 所示)5' CGCATGTCTTCTGTAACTGG 和 SP2 (如 SEQ ID NO. 2 所示) 5' CGTTACAAGATTGGGAATCC。引物序列為發(fā)明人全新設(shè)計(jì)，具備以下特點(diǎn)特異性強(qiáng)，可特 異性擴(kuò)增STIV MCP全基因序列；CG含量適中、兩條因無TM值相近，不易形成發(fā)卡環(huán)的結(jié)構(gòu)， 符合PCR使用要求；所擴(kuò)增序列適合連接入T載體。目的基因長(zhǎng)度為1397bp，序列如SEQ ID NO. 3所示。PCR體系為 20 μ 1 :STIV 總 DNA模板 0. 5ul,Buffer with Mg2+Ul,dNTP 0. 5ul，引物 (50pmol/ul)各0. 3ul，Taq DNA聚合酶0. 5ul。反應(yīng)條件為94°C預(yù)處理3min，進(jìn)行30個(gè) 循環(huán)，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，循環(huán)完成后，72°C充分延伸lOmin。 使用引物SP1/SP2進(jìn)行擴(kuò)增。2.目的基因連接入pGem-T easy載體；標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒pGEM-T-S的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳后，目的基因條帶用TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN, China)試劑盒回收純化。所純化的目的基因連接入pGem_T esay 載體(Novigen)中，連接反應(yīng)體系為 25ul 10*buffer 2. 5ul, pGem-T esay 載體0. 03pmol,目的基因0. 3pmol, T4DNA連接酶Iul，加雙蒸水至25ul。反應(yīng)條件:16°C，12-24 小時(shí)。3.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5ci感受態(tài)中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。①從-80°C取出DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，室溫迅速溶解后，立刻置于冰水上。②取100 μ 1感受態(tài)細(xì)胞加于10 μ 1連接混合物中，輕輕吹吸混勻。③靜置冰水浴中，約30min。④42°C水浴熱擊90sec，立刻放于冰上冷卻5min。⑤加900 μ 1 LB,置于 37°C溫浴 60min。⑥在含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的LB平板表面均勻涂抹7 μ IIPTG和40 μ 1 X-gal貯存液，置于37°C培養(yǎng)箱。⑦將溫浴的感受態(tài)細(xì)胞，5000rpm離心3min，去上清，留約100 μ 1液體懸浮細(xì)菌， 均勻涂于LB/Amp/IPTG/X-gal平板上。⑧37°C溫箱倒置培養(yǎng)過夜。4.重組質(zhì)粒的提取與鑒定將白色單個(gè)陽性重組菌株接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)液，37°C搖菌過夜，取1.0ml 菌液測(cè)序。目的基因成功連接的陽性菌液，以 TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver 2. 0試劑盒提純質(zhì)粒，檢測(cè)其濃度后換算成拷貝數(shù)濃度，梯度稀釋后作為模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)。擴(kuò)增出目的基因的重組質(zhì)粒命名為PGEM-T-S (見圖1)，作為STIV檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)陽性參 考物質(zhì)貯存。5.使用方法pGEM-T-S結(jié)構(gòu)包含STIV全MCP基因，可與所有根據(jù)MCP某段基因設(shè)計(jì)得引物特異 性結(jié)合，可應(yīng)用于STIV的PCR和熒光定量PCR檢測(cè)。同時(shí)，由于STIV MCP基因與流行性造 血器官壞死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)禾口虎紋娃虹彩病毒 (Tiger frog virus, TFV)的MCP基因同源性超過97%，因此pGEM-T-S也可作為標(biāo)準(zhǔn)陽性 參考物質(zhì)用于EHNV和TFV MCP基因的分子生物學(xué)檢測(cè)。病毒檢測(cè)時(shí)，將pGEM-T-S與其他檢測(cè)樣品作為模板分別加入相同的反應(yīng)體系中， 在相同的反應(yīng)條件下擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)照PGEM-T-S的檢測(cè)結(jié)果，若有相同的目的基因 或信號(hào)曲線，可判斷檢測(cè)樣品為陽性。實(shí)施例2 使用實(shí)施例1構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)pGEM-T-S，作為模板，使用不同病毒檢測(cè) 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物來源見表1。結(jié)果如圖2所示，其中M 分子量標(biāo)準(zhǔn)；-陰性對(duì)照。 其他為相應(yīng)的病毒MCP特異性引物擴(kuò)增結(jié)果。如圖2A所示，只有STIV，以及同為蛙虹彩病 毒屬的EHNV和TFV有目的基因，如圖2B所示，其他樣品為陰性。結(jié)果表明本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)陽 性參考物質(zhì)pGEM-T-S不與非蛙虹彩病毒屬病毒引物結(jié)合，特異性極好，適合在STIV、EHNV 和TFV的PCR檢測(cè)中作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照。表1 :pGEM-T_S PCR特異性檢測(cè)引物 實(shí)施例3 使用實(shí)施例1構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)pGEM-T-S，作為模板，使用不同病毒檢測(cè) 弓I物和探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，弓I物和探針來源見表2。引物和探針序列、反應(yīng)條件和 反應(yīng)體系根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果如圖3所示，其中M 分子量標(biāo)準(zhǔn)；信號(hào)曲線從上到 下依次為STIV引物探針、TFV引物探針以及EHNV引物探針。結(jié)果表明本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)陽性 重組質(zhì)粒pGEM-T-S能與STIV、EHNV和TFV的MCP特異性引物探針結(jié)合，發(fā)出熒光信號(hào)，因 此適合在此3種病毒的熒光定量PCR檢測(cè)中作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照。表2 :pGEM-T-S熒光定量PCR特異性檢測(cè)引物 由以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明實(shí)施例通過設(shè)計(jì)特異性引物、摸索PCR反應(yīng)體系 與反應(yīng)條件、以及構(gòu)建與篩選重組質(zhì)粒，得到了一種本身不摻雜其他組織DNA，純度高易定 量，且不易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的，用于多種蛙虹彩病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)。其可應(yīng)用 于PCR定性分析，也可用于熒光定量PCR制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
可特異性擴(kuò)增甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白全基因的引物，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白基因的全基因序列，其特征在于，具有如SEQID NO. 3所示 的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述全基因序列的重組質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)用于甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白 基因、流行性造血器官壞死病毒核衣殼蛋白基因或虎紋蛙虹彩病毒核衣殼蛋白基因的分子 生物學(xué)檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述分子生物學(xué)檢測(cè)為PCR或熒光定量PCR 檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明首先設(shè)計(jì)了一對(duì)可特異性擴(kuò)增甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白全基因的引物，其具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。用其擴(kuò)增出的甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白全基因，具有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。然后摸索出合適的PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，構(gòu)建并篩選含有甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白全基因序列的重組質(zhì)粒pGEM-T-S。其可作為標(biāo)準(zhǔn)陽性參考物質(zhì)用于甲魚虹彩病毒核衣殼蛋白基因(STIV MCP)、流行性造血器官壞死病毒核衣殼蛋白基因(EHNV MCP)或虎紋蛙虹彩病毒核衣殼蛋白基因(TFV MCP)的分子生物學(xué)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921757SQ20101025630
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者張旻, 江育林 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院