專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法及用途的制作方法一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法及用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌構(gòu)建及其在預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)引起的仔豬腹瀉，對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，養(yǎng)豬業(yè)每年因此而遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。仔豬大腸桿菌性腹瀉包括哺乳仔豬腹瀉和斷奶仔豬腹瀉。哺乳仔豬大腸桿菌性腹瀉又分為仔豬黃痢和白痢。仔豬黃痢是初生仔豬常發(fā)的急性、致死性傳染病，主要發(fā)生于7日齡以?xún)?nèi)的乳豬，13日齡的乳豬多發(fā)，發(fā)病后以排黃色或黃白色稀便為特征。豬群一旦發(fā)病，很快傳播開(kāi)來(lái)，一窩仔豬中的發(fā)病率可達(dá)50%100%，死亡率有的可達(dá)100%。仔豬白痢多發(fā)于1030日齡的哺乳仔豬，以排灰白色有腥臭味的漿糊樣稀便，嚴(yán)重的可排水樣稀便為特征。仔豬斷奶后大腸桿菌性腹瀉多發(fā)生于斷奶后1周，癥狀雖不像出生時(shí)那么明顯，但常減慢仔豬增重速度，其它因素如斷奶應(yīng)激、食物的改變等都會(huì)加重病情。當(dāng)仔豬感染ETEC后，ETEC菌毛與小腸粘膜上皮的特異性受體結(jié)合，使得ETEC在小腸內(nèi)定居，大量繁殖，產(chǎn)生耐熱腸毒素(heat-stableenterotoxin,ST)或/和不耐熱腸毒素(heat-labileenterotoxin,LT)0腸毒素侵入小腸上皮細(xì)胞內(nèi)，改變上皮細(xì)胞的正常吸收和分泌，擾亂小腸代謝，使水、電解質(zhì)大量進(jìn)入小腸腔，從而引起劇烈腹瀉。在這個(gè)過(guò)程中，菌毛和腸毒素被認(rèn)為是主要的毒力因素，其中菌毛與小腸上皮結(jié)合是感染的首要步驟，也是致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同ETEC菌株的菌毛抗原類(lèi)型不同，主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41等，在我國(guó)最常見(jiàn)的是K88。對(duì)于哺乳仔豬大腸桿菌性腹瀉的預(yù)防，目前已有商業(yè)化疫苗可供選擇，主要有F4(K88)-F5(K99)二價(jià)苗和大腸桿菌滅活苗。用這些疫苗免疫妊娠后期母豬，會(huì)在母豬體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體，仔豬通過(guò)吮吸初乳獲得母源抗體，從而阻止產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌在腸內(nèi)定居，避免疫病發(fā)生；但現(xiàn)有商業(yè)化疫苗對(duì)仔豬斷奶后大腸桿菌性腹瀉卻難以奏效。此外，商業(yè)化的大腸桿菌滅活苗或大腸桿菌基因工程苗，因細(xì)菌胞壁含有脂多糖(內(nèi)毒素)毒性成分，接種動(dòng)物時(shí)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的副反應(yīng)。F4菌毛的生物合成和組裝至少與!^eA-FaeJ10個(gè)蛋白亞基有關(guān)。其中!^ieG含量最多，系組成菌毛的主要亞基，與菌毛的粘附特性有關(guān)，是F4受體的主要結(jié)合位點(diǎn)。乳桿菌和乳球菌被視為公認(rèn)安全(GRAQ的微生物，細(xì)胞壁不含脂多糖(內(nèi)毒素)毒性成分，以其為受體菌構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌，用于預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉，具有廣闊前景。目前國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究尚屬空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表達(dá)faeG(產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因)的基因工程益生菌的構(gòu)建方法及用途，本發(fā)明免疫原性好、具有佐劑效應(yīng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、副作用小、制備簡(jiǎn)便。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟(1)獲得大腸桿菌粘附素!^aeG基因以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83907質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)合成含有NcoI和)(baI酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，上下游引物Pl和P2分別具有SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的基因序列。采用PCR方法擴(kuò)增faeG目的基因片段。將擴(kuò)增的faeG目的基因片段與pMDIS-T載體連接，得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOPlO中，該重組質(zhì)粒命名為pMD-faeG，其具有SEQIDNO.1所示的基因序列。(2)構(gòu)建重組表達(dá)載體pNZ8148_faeG將表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和)(baI雙酶切，純化回收雙酶切載體片段和目的片段。目的片段和雙酶切載體片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliMC1061，提取重組質(zhì)粒，命名為pNZ8148-faeG，其具有SEQIDNO.2所示的基因序列。(3)構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌粘附素基因faeG的重組乳酸乳球菌采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞L.IactisNZ9000,利用氯霉素對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，得重組菌，命名為NZ9000/8148-faeG，其具有SEQIDNO.3所示的基因序列。(4)大腸桿菌粘附素!^aeG在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE、Westernblot分析挑取重組菌NZ9000/8148-faeG接種于含有10mg/mL氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)物以3%的比例轉(zhuǎn)接于500ml含氯霉素GMl7培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至0D_=0.50.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑nisin，使其終濃度為5ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)池。一種上述表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌在預(yù)防哺乳仔豬和斷奶仔豬大腸桿菌性腹瀉中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是基因工程受體菌乳桿菌和乳球菌是公認(rèn)安全的微生物，不含內(nèi)毒素、不分泌外毒素，作為疫苗載體對(duì)靶動(dòng)物和人類(lèi)安全；構(gòu)建的基因工程乳桿菌和乳球菌表達(dá)目的抗原后，不需經(jīng)提純、復(fù)性等復(fù)雜的后處理過(guò)程，可直接使用，疫苗制作簡(jiǎn)便；乳桿菌和乳球菌自身具有佐劑效應(yīng)，能增強(qiáng)所表達(dá)目的抗原(FaeG)的免疫效果；作為口服疫苗應(yīng)用時(shí)，乳桿菌和乳球菌菌體對(duì)所表達(dá)的目的抗原(FaeG)起保護(hù)作用，抵抗胃腸道逆境的降解破壞，提高免疫效果。圖1為表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148圖譜；圖2為pMD-faeG重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜，圖中，1為DNAMarkerDL2,000，2為重組質(zhì)粒經(jīng)NcoI和^CbaI雙酶切產(chǎn)生的片段；圖3為重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG電轉(zhuǎn)化乳球菌PCR鑒定電泳圖譜，圖中，1為DL2,OOODNAMarker,2-10為重組菌PCR產(chǎn)物；圖4為重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG電轉(zhuǎn)化乳球菌提取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖譜，圖中，1為DL2，000DNAMarker,2-4為重組菌提取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；圖5為重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖譜，圖中，M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，1為含空白質(zhì)粒pNZ8148乳球菌，2為含重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG乳球菌；圖6為重組菌表達(dá)產(chǎn)物的Wfestern-blotting圖譜，1為大腸桿菌C83907(用于擴(kuò)4增粘附素基因faeG)，2為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，3-4為含空白質(zhì)粒pNZ8148乳球菌，5為含重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG乳球菌；圖7為重組菌免疫小鼠血清!^aeG特異性IgG動(dòng)態(tài)變化；圖8為重組菌口服免疫小鼠糞!^aeG特異性SIgA動(dòng)態(tài)變化。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的重組益生菌采用以下方法構(gòu)建根據(jù)已公開(kāi)的F4大腸桿菌菌毛粘附素!^aeG的基因序列及表達(dá)載體質(zhì)粒特點(diǎn)，設(shè)計(jì)含特異酶切位點(diǎn)的引物；以從腹瀉仔豬中分離得到或購(gòu)買(mǎi)的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有faeG基因的片段，將其與表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳桿菌或乳球菌細(xì)胞內(nèi)，在乳鏈菌肽(nisin)的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。其中F4大腸桿菌包括F4ab、F4ac和F4ad3個(gè)血清型；表達(dá)載體質(zhì)粒為pNZ8148或以pNZ8148為基礎(chǔ)改變選擇標(biāo)記后獲得的質(zhì)粒；受體菌為染色體上整合有nisK和nisR基因的乳桿菌或乳球菌；用于擴(kuò)增F4大腸桿菌菌毛粘附素基因faeG片段的上下游引物Pl和P2的基因序列如SEQIDNO.4和SEQIDN0.5所示PlCCATGGGGATGACTGGTGATTTCAATGNcoIP2TCTAGAATAAGTAATTGCTACGTTCAGXbaI乳桿菌和乳球菌被視為公認(rèn)安全(GRAQ的微生物，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁不含脂多糖(內(nèi)毒素)毒性成分，并具有促進(jìn)動(dòng)物消化道有益菌生長(zhǎng)、抑制有害菌繁殖、增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能等多種作用，已作為益生菌飼料添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的重組益生菌，作為疫苗用于仔豬大腸桿菌性腹瀉預(yù)防，既具有抗原保護(hù)、緩釋作用又兼具佐劑作用，可取得比現(xiàn)有以大腸桿菌為基礎(chǔ)的常規(guī)疫苗更好的效果。具體應(yīng)用方法如下哺乳仔豬大腸桿菌性腹瀉表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的重組益生菌經(jīng)滅活后以注射途徑產(chǎn)前免疫母豬，仔豬通過(guò)吮吸初乳獲得母源抗體預(yù)防哺乳期大腸桿菌性腹瀉。斷奶仔豬大腸桿菌性腹瀉表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的重組益生菌以口服途徑接種仔豬，通過(guò)激活粘膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生粘附素MeG特異性SIgA，與產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌菌毛結(jié)合從而阻斷病菌與豬腸粘膜上皮細(xì)胞受體結(jié)合，預(yù)防斷奶仔豬大腸桿菌性腹瀉。經(jīng)過(guò)一系列免疫保護(hù)試驗(yàn)，證明表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的重組益生菌可有效預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉。下面結(jié)合附圖舉例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地描述，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。1、生物材料(1)目的基因序列大腸桿菌粘附素!^aeG的基因序列來(lái)自于國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)Genbank中。(2)載體質(zhì)粒nisin誘導(dǎo)型胞內(nèi)表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148來(lái)自荷蘭NIZO研究所，圖譜詳見(jiàn)圖1。pMDIS-T載體購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。(3)菌株大腸桿菌T0P10購(gòu)自hvitrogen公司；大腸桿菌E.coliMC1061購(gòu)自hvitrogen公司；含大腸桿菌粘附素i^aeG基因的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83907(0149:K91,K88ac)來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)監(jiān)察所；受體菌L.IactisNZ9000來(lái)自荷蘭NIZO研究所。2、大腸桿菌粘附素!^aeG基因的獲得以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83907質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)合成含有NcoI和)(baI酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，采用PCR方法擴(kuò)增faeG目的基因片段。將faeG基因PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10中。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定(詳見(jiàn)圖2~)和測(cè)序(上海英俊生物技術(shù)有限公司)分析，證明擴(kuò)增的目的片段為faeG的完整基因，該重組質(zhì)粒命名為pMD-faeG，其基因序列如SEQIDNO.1所示。上下游引物Pl和P2的基因序列如SEQIDNO.4和SEQIDN0.5所示。3、重組表達(dá)載體pNZ8148_faeG的構(gòu)建將表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XbaI雙酶切，純化回收雙酶切載體片段和目的片段。目的片段和雙酶切載體片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliMC1061，提取重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序(上海英俊生物技術(shù)有限公司)分析驗(yàn)證后命名為pNZ8148-faeG，其基因序列如SEQIDN0.2所示。4、表達(dá)大腸桿菌粘附素基因faeG的重組乳酸乳球菌構(gòu)建采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pNZ8148_faeG轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞L.IactisNZ9000,電擊條件為電壓2500V、電阻400Ω、電容25uF。利用氯霉素對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，經(jīng)PCR鑒定(詳見(jiàn)圖幻、酶切鑒定(詳見(jiàn)圖4)和測(cè)序(上海英俊生物技術(shù)有限公司)驗(yàn)證后重組菌命名為NZ9000/8148-faeG，其基因序列如SEQIDN0.3所示。5、大腸桿菌粘附素！^⑷在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGEJesternblot分析挑取重組菌NZ9000/8148_faeG接種于含有10ug/mL氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)物以3%的比例轉(zhuǎn)接于500ml含氯霉素GMl7培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600=0.50.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑nisin，使其終濃度為5ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)汕。重組菌裂解后經(jīng)SDS-PAGE(詳見(jiàn)圖5)和Wfesternblot(詳見(jiàn)圖6)分析證明目的基因得到正確表達(dá)。重組菌經(jīng)nisin誘導(dǎo)后，在27.OkD處出現(xiàn)一特異性蛋白條帶，與預(yù)期的大小一致。凝膠經(jīng)薄層掃描分析顯示，目的蛋白約占受體菌總蛋白的10%。6、基因工程疫苗的免疫效果本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)大腸桿菌粘附素!^aeG的重組乳酸乳球菌，分別采用皮下注射和口服途徑免疫小鼠，結(jié)果(詳見(jiàn)圖7、8)表明(1)注射接種初免后五周血清!^aeG特異性IgG效價(jià)高于1000，初免后七周血清效價(jià)高于4000;(幻口服途徑初免后七周，小鼠糞中!^eG特異性SlgA水平顯著高于對(duì)照組。圖7中，口服對(duì)照組，"C"口服低劑量轉(zhuǎn)基因乳球菌組，^r-:口服高劑量轉(zhuǎn)基因乳球菌組，聯(lián)合口服高劑量轉(zhuǎn)基因乳球菌和佐劑組，皮下注射接種組。圖8中，對(duì)照組"O-:低劑量重組菌組-高劑量重組菌組，t:高劑量重組菌和佐劑聯(lián)合組。權(quán)利要求1.一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)獲得大腸桿菌粘附素i^aeG基因以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌C83907質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)合成含有NcoI和)(baI酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，上下游引物Pl和P2分別具有SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的基因序列。采用PCR方法擴(kuò)增faeG目的基因片段。將擴(kuò)增的faeG目的基因片段與PMD18-T載體連接，得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOPlO中，該重組質(zhì)粒命名為pMD-faeG，其具有SEQIDNO.1所示的基因序列。(2)構(gòu)建重組表達(dá)載體pNZ8148-faeG將表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和)(baI雙酶切，純化回收雙酶切載體片段和目的片段。目的片段和雙酶切載體片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliMC1061，提取重組質(zhì)粒，命名為pNZ8148-faeG，其具有SEQIDNO.2所示的基因序列。(3)構(gòu)建表達(dá)大腸桿菌粘附素基因faeG的重組乳酸乳球菌采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞L.IactisNZ9000，利用氯霉素對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，得重組菌，命名為NZ9000/8148-faeG，其具有SEQIDNO.3所示的基因序列。(4)大腸桿菌粘附素!^aeG在乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGEJesternblot分析挑取重組菌NZ9000/8148-faeG接種于含有10mg/mL氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)物以3%的比例轉(zhuǎn)接于500ml含氯霉素GM17培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至0D_=0.50.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑nisin，使其終濃度為5ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)池。2.—種權(quán)利要求1所述表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌在預(yù)防哺乳仔豬和斷奶仔豬大腸桿菌性腹瀉中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)faeG的基因工程益生菌的構(gòu)建方法及用途，根據(jù)已公開(kāi)的F4大腸桿菌菌毛粘附素FaeG的基因序列及表達(dá)載體質(zhì)粒特點(diǎn)，設(shè)計(jì)含特異酶切位點(diǎn)的引物；以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有faeG基因的片段，將其與表達(dá)載體質(zhì)粒pNZ8148進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pNZ8148-faeG，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳桿菌或乳球菌細(xì)胞內(nèi)，得到表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌，在乳鏈菌肽(nisin)的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，并經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析證明目的基因得到正確表達(dá)。該重組菌可用于預(yù)防哺乳仔豬和斷奶仔豬大腸桿菌性腹瀉。文檔編號(hào)C12N1/21GK102031262SQ201010256198公開(kāi)日2011年4月27日申請(qǐng)日期2010年8月17日優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日發(fā)明者劉淑杰,徐子偉,李永明,王一成申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院