用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途；敲除綠針假單胞菌HT66(Psedunomonas?chlororaphis?HT66)CCTCC?NO：M?2013467基因組中的psrA或rpeA基因，即可。本發(fā)明從一株綠針假單胞菌出發(fā)，經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵、萃取、濃縮和結(jié)晶工藝，獲得了純度達(dá)到96％以上的吩嗪-1-甲酰胺。將該菌基因組中psrA和rpeA基因刪除后，吩嗪-1-甲酰胺的發(fā)酵產(chǎn)量高達(dá)1800ppm。經(jīng)過瓊脂平板抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吩嗪-1-甲酰胺對常見的植物病原性真菌如立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、終極腐霉和甜葉菊殼針孢具有明顯的抑制作用，且穩(wěn)定性和活性均較好，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是一個人口大國，因病蟲害導(dǎo)致的糧食產(chǎn)量問題非常嚴(yán)峻。農(nóng)藥作為一種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在維護(hù)人類的生命、生活及環(huán)境的品質(zhì)、土地與生物資源的永續(xù)利用上均扮演著重要而不可或缺的角色。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，全國2012年11月農(nóng)藥原藥產(chǎn)量336131噸，較10月產(chǎn)量(303043噸)環(huán)比增長10.92%，較去年11月產(chǎn)量(241408噸)同比增長39.2%。但是，由于人類大量使用化學(xué)農(nóng)藥和化肥等，造成病蟲害泛濫，地力下降，加速野生物物種滅絕，栽培物種的品質(zhì)退化，自然調(diào)整能力降低。
[0003]為此，我國政府不斷推出對高毒農(nóng)藥的管理措施。2011年6月15日，農(nóng)業(yè)部、工信部、環(huán)保部等五部委聯(lián)合發(fā)布第1586號公告，決定對高毒農(nóng)藥采取進(jìn)一步禁限用管理措施，停止受理克百威、氧樂果、甲基硫環(huán)磷等22種農(nóng)藥新增田間試驗(yàn)申請、登記申請及生產(chǎn)許可申請；自2011年10月31日起，撤銷苯線磷、特丁硫磷等10種高毒農(nóng)藥的登記證、生產(chǎn)許可證，停止生產(chǎn)，并于2013年10月31日起，停止銷售和使用。因此，利用生物技術(shù)創(chuàng)新，開發(fā)高效低毒的微生物源農(nóng)藥，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)高效和可持續(xù)發(fā)展的一條有效途徑。
[0004]統(tǒng)計(jì)分析表明，我國的農(nóng)作物浸染性病害中，真菌病害是目前已知植物病害中種類最多的病害，約占病害種類的80% -90%。由此可見，防治植物真菌性病害的農(nóng)藥具有廣泛的開發(fā)潛力和良好的市場前景。
[0005]吩嗪類化合物是一類含氮的雜環(huán)化合物。由于吩嗪環(huán)的存在，幾乎所有的吩嗪類化合物都具有一定的氧化還原活性，能夠與細(xì)胞內(nèi)的活性成分作用，在細(xì)胞種積累超氧化物和過氧化物，因此具有廣譜的抑制植物病原真菌的作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性。此外，吩嗪類化合物在微生態(tài)環(huán)境下還發(fā)揮著極其復(fù)雜的生理功能，如信號調(diào)控功能、影響生物膜的形成、厭氧環(huán)境下作為電子載體有助于微生物的存活、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、增強(qiáng)微生物在植物根際的定植等。目前發(fā)現(xiàn)和研究的吩嗪類化合物有6000多種。其中，天然的吩嗪類化合物有50多種，比如吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-甲酰胺、2-羥基吩嗪等。
[0006]上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院許煜泉課題組篩選到一株能同時分泌吩嗪-1-羧酸和藤黃綠菌素的銅綠假單胞菌M18，并通過分子生物學(xué)技術(shù)，對該假單胞菌株的相關(guān)調(diào)控基因進(jìn)行突變，并進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝條件，PCA的產(chǎn)量達(dá)到6000ppm以上。該研究使PCA的大規(guī)模生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)，PCA被命名為申嗪霉素，并獲得了農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的新農(nóng)藥藥證(農(nóng)藥登記證號ro20110314和ro20110315)。申嗪霉素具有安全、高效、與環(huán)境相容性好的特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種廣譜防治農(nóng)作物病害的生物農(nóng)藥。
[0007]但是，在農(nóng)田應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，申嗪霉素的抗菌活性受到環(huán)境pH值的嚴(yán)重影響。pH7.0的條件下，吩嗪-1-羧酸抗菌活性僅為PH5.0時的20%，而在更高的pH環(huán)境中，其抑菌活性完全消失。作為其衍生物，吩嗪-1-甲酰胺具有同樣廣譜的抗真菌活性，可以用作農(nóng)業(yè)殺菌劑，但是表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性和生物活性。Chin-A-Woeng的研究發(fā)現(xiàn)，在中性或堿性環(huán)境下，PCN對尖孢鐮刀菌的抗菌活性為PCA的5~10倍(Chin-A-Woeng, etal.Mol.PlantMicrob.1n.,1998,11(11): 1069)。此外，PCN及其類似物由于可以抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II的活性，具有潛在的抗癌活性，因此受到了眾多科學(xué)家的廣泛關(guān)注。目前，能合成PCN的微生物菌株包括綠針假單胞菌PCL1391，銅綠假單胞菌PAOl、PUPa3、MML2212等菌株，但是這些菌株中PCN的產(chǎn)量太低而不足以進(jìn)行工業(yè)開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)有菌株生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量和效率較低的缺陷，提供一種用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。 [0009]本發(fā)明以綠針假單胞菌HT66為出發(fā)菌，通過基因工程技術(shù)從HT66菌株基因組的中分別或是同時敲除吩嗪合成過程中的rpeA、psrA負(fù)調(diào)控基因，構(gòu)建HT66 A rpeA、HT66 A psrA、HT66 A rpeA A psrA基因工程菌株，使得吩嚷-1-甲酸胺(Phenazine-l-carboxamide, CAS號為550-89-0，簡稱PCN)的產(chǎn)量大幅提高，能夠更加有效用于生物防治。其中HT66 A rpeA A psrA基因工程菌株具有最佳效果。
[0010]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0011]第一方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，敲除綠針假單胞菌 HT66 (Psedunomonas chlororaphis HT66) CCTCC NO:M2013467 基因組中的 psrA基因。
[0012]優(yōu)選地,所述psrA基因的堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]優(yōu)選地，所述敲除psrA基因包括如下步驟:
[0014]A、擴(kuò)增psrA基因片段，并插入pEXISTc質(zhì)粒中；(該質(zhì)粒為大腸桿菌與假單胞菌的穿梭質(zhì)粒。)
[0015]B、擴(kuò)增慶大霉素抗性基因，插入psrA基因中間，使psrA基因發(fā)生插入突變；
[0016]C、使突變的psrA基因與HT66基因組中的基因發(fā)生同源重組，根據(jù)抗性篩選出陽性克隆，即可。
[0017]優(yōu)選地，敲除所述綠針假單胞菌HT66基因組中的rpeA基因。
[0018]優(yōu)選地,所述rpeA基因的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0019]優(yōu)選地，所述敲除rpeA基因包括如下步驟:
[0020]A、擴(kuò)增rpeA基因片段，并插入pEX18Tc質(zhì)粒中；
[0021]B、擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，插入rpeA基因中間，使rpeA基因發(fā)生插入突變；
[0022]C、使突變的rpeA基因與HT66基因組或敲除psrA基因的HT66基因組中的基因發(fā)生同源重組，篩選陽性克隆，即可。
[0023]第二方面，本發(fā)明涉及一種上述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在制備防治植物真菌性病害的微生物農(nóng)藥中的用途。
[0024]優(yōu)選地，所述植物真菌性病害包括大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、蘋果、柑橘、桃、棉花、菊花、大麗花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿或番茄的根腐病，水稻紋枯病，西瓜枯萎病或甜葉菊斑枯病。
[0025]第三方面，本發(fā)明涉及一種上述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在制備微生物肥料中的用途。
[0026]第四方面，本發(fā)明涉及一種吩嗪-1-甲酰胺的制備方法，將上述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株發(fā)酵、提取后制備得到所述吩嗪-1-甲酰胺。
[0027]優(yōu)選地，所述發(fā)酵具體為將所述基因工程菌株在微生物培養(yǎng)基中發(fā)酵20~40h，所述提取具體為以有機(jī)溶劑萃??；有機(jī)相經(jīng)濃縮、結(jié)晶后獲得所述吩嗪-1-甲酰胺。
[0028]優(yōu)選地，所述吩嗪-1-甲酰胺的CAS號為550-89-0。
[0029]優(yōu)選地，所述發(fā)酵溫度為20~40°C，搖床轉(zhuǎn)速或發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為150~800轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時間為20~40h。
[0030]優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑包括丁酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯中的一種或幾種。
[0031]第五方面，本發(fā)明涉及一種上述的制備方法制得的吩嗪-1-甲酰胺在制備防治植物真菌性病害的微生物源農(nóng)藥中的用途。
[0032]優(yōu)選地，所述植物真菌性病害包括大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、蘋果、柑橘、桃、棉花、菊花、大麗花 、南瓜、西瓜、甘蔗、苜?；蚍训母?，水稻紋枯病，西瓜枯萎病或甜葉菊斑枯病。
[0033]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0034]1、用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的菌株為綠針假單胞菌，至今未有致病性的報(bào)道，因此其環(huán)境友好，安全可靠。
[0035]2、吩嗪-1-甲酰胺的開發(fā)成本低:綠針假單胞菌的營養(yǎng)需求不高，穩(wěn)定性較好，生產(chǎn)工藝簡單易行。
[0036]3、本發(fā)明中使用的綠針假單胞菌，其野生株液體培養(yǎng)時吩嗪-1-甲酰胺濃度高達(dá)420mg/L,為目前國際上吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量最高的野生菌株，因此其生防功能強(qiáng)大。
[0037]4、本發(fā)明的菌劑具有廣譜的抗真菌活性，可以用于防治水稻紋枯病、西瓜枯萎病、甜葉菊斑枯病或大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、蘋果、柑橘、桃、棉花、菊花、大麗花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等作物的根腐病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯:
[0039]圖1為吩嗪-1 -甲酰胺的核磁共振氫譜圖；
[0040]圖2為吩嗪-1-甲酰胺的核磁共振碳譜圖；
[0041]圖3為吩嗪-1-甲酰胺的分子結(jié)構(gòu)示意圖；
[0042]圖4為綠針假單胞菌HT66基因工程菌的吩嗪_1_甲酰胺產(chǎn)量圖；
[0043]圖5為綠針假單胞菌HT66基因工程菌的生長曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0045]本發(fā)明的綠針假單胞菌HT66 (Pseudomonas choloraphis HT66),該菌株已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏單位地址為:中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編為:430072，保藏日期為:2013年10月12日，保藏編號為:CCTCC NO: M 2013467。
[0046]實(shí)施例1、吩嗪-1-甲酰胺的制備與鑒定
[0047]I)綠針假單胞菌菌種的活化:分別配制固體的LB或者KMB培養(yǎng)基；取出冷凍保藏的綠針假單胞菌HT66，接種固體培養(yǎng)基上面于26~32°C活化48h，然后轉(zhuǎn)種到新的固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)傳代2~3次；
[0048]2)綠針假單胞菌的種子制備:配制液體LB或者KMB培養(yǎng)基；挑取一環(huán)活化的菌體，接種到50mL液體培養(yǎng)基(裝于250mL三角瓶)中，置于26~32°C的恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)10~20h，搖床轉(zhuǎn)速為150~5000轉(zhuǎn)/分鐘。然后，將該種子液進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到1000~5000mL的液體培養(yǎng)基中，于相同條件下培養(yǎng)，以獲得大量的生長旺盛而且健壯的種子；
[0049]其中，所述LB培養(yǎng)基的組成為:每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，pH7.5 ;固體培養(yǎng)基為在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中添加1.2%的瓊脂粉。
[0050]其中，所述King, sB培養(yǎng)基(KMB):每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨20克，K2HP040.392克，甘油15mL，MgS040.732克，pH7.2 ;固體培養(yǎng)基為在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中添加1.2~
1.5%的瓊脂粉。
[0051]3)綠針假單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng):配制大體積的液體LB或者KMB培養(yǎng)基，裝入發(fā)酵罐中于121°C滅菌20min ;待發(fā)酵罐溫度冷卻到26~32°C時，以I~5%的比例接入綠針假單胞菌的種子液；然后于26~32°C下通氣攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵罐攪拌槳轉(zhuǎn)速為150~1000轉(zhuǎn)/分鐘，通氣比為I: 0.5~I(VVM)，發(fā)酵時間為30~40h。
[0052]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成并無特殊要求，其中碳源為淀粉、葡萄糖、蔗糖或者甘油，氮源可以為蛋白胨、豆柏、肉膏、玉米漿等，另外添加適量的磷酸鹽和硫酸鎂等無機(jī)鹽，發(fā)酵液的pH值保持在7.0~8.0。
[0053]4)吩嗪-1-甲酰胺的提取:在發(fā)酵液中加入0.1~0.5%。的破乳劑如十二烷基溴化吡啶，然后按照1:1的比例加入丁酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯等有機(jī)溶劑中的一種，進(jìn)行充分的震蕩或攪拌，待靜置分層后分離有機(jī)溶劑相；于薄膜濃縮設(shè)備中減壓濃縮，并逐步降低溫度至吩嗪-1-甲酰胺析出。
[0054]5)使用傅里葉紅外光譜儀對高純度產(chǎn)物做紅外光譜，紅外光譜的數(shù)據(jù)清晰的顯示了 NH基團(tuán)、酰胺基團(tuán)以及苯環(huán)骨架的存在，同時也顯示了產(chǎn)物中沒有羧基。使用核磁共振波譜儀(AvancellMOOMHz)進(jìn)行分析。圖1為吩嗪_1_甲酰胺的核磁共振氫譜圖，氫譜的頻率是400MHz，由圖1可知，所有氫原子的化學(xué)位移分別是:H-2 (d8.46，dd)，H_3 (d8.07，dd)，H-4 (d8.86，dd)，H_6 (d8.38，ddd)，H_7 (d8.00，ddd)，H_8 (d8.02，ddd)，H_9 (d8.29，ddd)。圖2為吩嗪-1-甲酰胺的核磁共振碳譜圖，碳譜的頻率是100MHz，溶劑是氘代甲醇。由圖2可知，所有碳原子化學(xué)位移分別為:C-1.128.93ppm, C~2,133.68ppm, C_3，129.23ppm，C_4，134.89ppm，C_a，141.84ppm，C_b，143.06ppm，C_6，131.89ppm，C_7，129.44ppm，C_8，129.76ppm，C-9，131.42ppm，C_c，142.93ppm，C-d, 140.66ppm，C_ll，167.50ppm，與以下的PCN結(jié)構(gòu)式完全吻合，見圖3。
[0055]圖3為吩嗪-1- 甲酰胺的分子結(jié)構(gòu)示意圖。由圖3可知，該化合物是一個含兩個氮原子的雜環(huán)化合物，屬于吩嗪類衍生物。同時，在I位碳原子上有一個酰胺基團(tuán)，可能與其雜環(huán)穩(wěn)定性及抗菌活性有密切的關(guān)系。
[0056]實(shí)施例2、rpeA某閔體外突奪體的構(gòu)律
[0057]以質(zhì)粒pUCGM為模板，擴(kuò)增其中的慶大霉素抗性基因aacCl。根據(jù)綠針假單胞菌 HT66 基因組中 rpeA 序列設(shè)計(jì)引物 5 ' -TATTAATCTAGACCTGTTCAGCCGTTCCGAAT-3 ' (Xbal JnSEQ ID N0.3)和 5' -AATTATGAATTC-CCACGCCCAGTTGATCCT-3' (EcoRI JnSEQ IDN0.4)，以該基因組DNA為模版，擴(kuò)增基因組中的相應(yīng)片段。將PCR產(chǎn)物與pMD19T載體相連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒驗(yàn)證，獲得質(zhì)粒PMD19TA和pMD19TG，將這兩種質(zhì)粒分別使用ClaI酶切，過柱純化，使用T4連接酶連接，獲得質(zhì)粒pMD19TAG，使用EcoRI和XbaI對穿梭質(zhì)粒pEX18Tc和pMD19TAG進(jìn)行雙酶切，并且將酶切產(chǎn)物過柱純化，將獲得的突變質(zhì)粒得到體外突變質(zhì)粒pEX18TcAG轉(zhuǎn)化大腸桿菌SMlO。
[0058]充分活化含有rpeA體外突變質(zhì)粒的SMlO菌株，接種于含有四環(huán)素20mg/L，慶大霉素40mg/L的LB培養(yǎng)基中，37°C，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12h。將充分活化的HT66菌接種于LB培養(yǎng)基中，28°C，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12h。5000轉(zhuǎn)/分收集并洗滌兩種菌體，分別用IOOuL重懸菌體，并將兩種細(xì)菌混在一起。取無菌的濾紙片于普通LB平板上，將混勻的菌體涂布在濾紙片上，37°C培養(yǎng)24h。刮取菌體，重懸于IOOuLLB培養(yǎng)基中，并涂布在含有蔗糖15%，壯觀霉素100mg/L，慶大霉素40mg/L的LB平板中。28°C倒置培養(yǎng)3d，將長出來的菌落用無菌牙簽分別依次點(diǎn)在含壯觀霉素100mg/L，四環(huán)素150mg/L的LB平板和含壯觀霉素100mg/L，慶大霉素40mg/L的LB平板上，在第一個平板上不能生長而在第二個平板上能夠正常生長的菌落即為同源重組成功的菌落。PCR驗(yàn)證HT66菌的rpeA基因中插入了長約IKMB的慶大抗性基因，并命名為HT66ArpeA，而野生型中則無此基因。
[0059]實(shí)施例3、psrA某閔體外突奪體的構(gòu)律
[0060]以pBS (kan)質(zhì)粒`為模板，PCR擴(kuò)增得到1.0KMB的kan基因(卡那抗性基因)。根據(jù)綠針假單胞菌HT66基因組中psrA基因的序列設(shè)計(jì)引物，5’ -TTAAGCTTACGGTCGGGTCGTCGCTGCATA-3，(HindIlUn SEQ ID N0.5)和 5，-AAGAGCTCCGCTGTTCATGCCACGGATAAAG-3，(SacI，如SEQ ID N0.6)。以HT66基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到1.5KMB的psrA基因，使用HindIII和SacI酶切后，克隆至pEX18Tc質(zhì)粒的相同位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pEX18Tc-psrA。轉(zhuǎn)AE.coli DH5a的感受態(tài)細(xì)胞，使其具有四環(huán)素抗性。
[0061]將kan基因和重組質(zhì)粒pEX18Tc-psrA分別用SphI酶切，割膠回收后，使用T4DNA連接酶進(jìn)行連接過夜。連接產(chǎn)物直接42°C熱激轉(zhuǎn)化E.coli DH5a的感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化過的感受態(tài)細(xì)胞于37°C，180轉(zhuǎn)/分鐘復(fù)蘇lh，然后5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，去除上清，用IOOuLLB培養(yǎng)基重懸菌體，并涂布在含有卡那霉素50mg/L和四環(huán)素20mg/L抗性的LB平板上篩選陽性的重組質(zhì)粒pEX18Tc-psrA-kan。使用熱激法將其轉(zhuǎn)入E.coli SMlO的感受態(tài)細(xì)胞中，通過含有四環(huán)素20mg/抗性篩選得到含有pEX18Tc-psrA-kan質(zhì)粒的E.coli SMlO細(xì)胞。
[0062]將充分活化的HT66細(xì)胞接種于LB培養(yǎng)基中，28°C，180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)12h。接種導(dǎo)入了 pEX18Tc_psrA_kan質(zhì)粒的E.coli SMlO細(xì)胞于四環(huán)素20mg/L,卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37°C，180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)12h。分別ImL綠針假單胞菌HT66菌液和2mL含pEX18Tc-psrA-kan質(zhì)粒的E.coli SMlO細(xì)胞，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，用LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次。各使用IOOuL培養(yǎng)基重懸菌體，并將HT66菌液與含pEX18Tc-psrA-kan質(zhì)粒的E.coliSMlO細(xì)胞菌體混合在一起，37°C靜置培養(yǎng)lh。取滅菌的濾紙片于普通LB平板上，分別將混合菌液小心的涂布在濾紙片上，將平板置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，完成質(zhì)粒從SMlO菌株到HT66菌株的轉(zhuǎn)移。用槍頭刮取濾紙片上的菌體，重懸于IOOuL的LB培養(yǎng)基中，將混合菌液全部涂布于含鹿糖15%,壯觀霉素100mg/L,卡那霉素50mg/L的LB平板上。28°C倒置培養(yǎng)3d。將長出來的菌落用無菌牙簽分別依次點(diǎn)在含壯觀霉素100mg/L，四環(huán)素150mg/L的LB平板和含壯觀霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L的LB平板上，在第一個平板上不能生長而在第二個平板上能夠正常生長的菌落即為同源重組成功的菌落。PCR驗(yàn)證重組菌的psrA基因中插入了長約IKMB的卡那抗性基因，將其命名為HT66APsrA，而野生型中則無此基因。
[0063]實(shí)施例4、rpeA和DsrA雙突變株HT66 A rpeA A psrA的構(gòu)建
[0064]將充分活化的HT66ArpeA細(xì)胞接種于LB培養(yǎng)基中，28°C，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12h。接種導(dǎo)入了 pEX18Tc_psrA_kan質(zhì)粒的E.coli SMlO細(xì)胞于四環(huán)素20mg/L,卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37°C，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12h。分別取ImL兩種菌液，5000轉(zhuǎn)/分離心5min，用LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次。各使用IOOuL重懸菌體，并將兩種菌體混合在一起，37°C靜置培養(yǎng)lh。所有操作應(yīng)盡量輕柔，以減少對菌體鞭毛的影響。取滅過菌的濾紙片于普通LB平板上，將混合菌液小心的涂布在濾紙片上，將平板置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，完成質(zhì)粒從SMlO菌株到HT66的轉(zhuǎn)移。用槍頭刮取濾紙片上的菌體，重懸于IOOuLLB培養(yǎng)基中，將混合菌液全部涂布于含鹿糖15%,壯觀霉素100mg/L,卡那霉素50mg/L的LB平板上。28°C倒置培養(yǎng)3d。將長出來的菌落用無菌牙簽分別依次點(diǎn)在含壯觀霉素100mg/L，四環(huán)素150mg/L的LB平板和含壯觀霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L的LB平板上，在第一個平板上不能生長而在第二個平板上能夠正常生長的菌落即為同源重組成功的菌落。PCR驗(yàn)證重組菌的psrA基因中插入了 長約IKMB的卡那抗性基因，將其命名為HT66 A rpeA A psrA而野生型中則無此基因。
[0065]實(shí)施例5、某閔工稈菌HT66 A rpeA A DsrA中PCN的牛物合成
[0066]將活化后的綠針假單胞菌HT66以及其基因工程菌株HT66 A rpeA、HT66ApsrA、HT66 A rpeA A psrA,分別接種于KMB培養(yǎng)基中，置于28°C的恒溫?fù)u床上(180轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)至光密度(0D600)為0.5~2.0之間時，將上述菌液以I~10: 100的體積比，加入到新配制的KMB培養(yǎng)基中，24~30°C進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100~300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間為24~72h后收獲菌液。取發(fā)酵液0.5mL，加入3mL乙酸乙酯，充分振蕩混勻，6000轉(zhuǎn)/分離心5min，取0.2mL有機(jī)相，蒸發(fā)后用甲醇溶解。使用HPLC檢測發(fā)酵液中吩嗪-1-甲酰胺產(chǎn)量。
[0067]HPLC檢測條件:
[0068]流動相為乙臆_25mM 乙酸銨，色譜柱為 WondaSilC18_WRreversephasecolumn (5 Um ；4.6 X 250mm, Shimadzu, Japan)，檢測波長 254nm,檢測條件乙臆-92% 25mM乙酸銨，2-20min,乙腈濃度從8 %升至60 %，乙酸銨濃度從92 %下降至40 %，20-2Imin, 8 %乙臆_92*% 25mM乙酸按。
[0069]圖4為綠針假單胞菌HT66的不同基因工程菌與野生株中吩嗪_1_甲酰胺的產(chǎn)量變化圖。由圖4可知，rpeA基因的敲除導(dǎo)致PCN的產(chǎn)量由野生株的424mg/L上升到703mg/L，提高了 1.66倍；psrA基因的敲除導(dǎo)致PCN的產(chǎn)量由野生株的424mg/L上升到1300mg/L，提高了 3.06倍；兩個基因的雙敲除突變株中，PCN的產(chǎn)量達(dá)到1800mg/L，與野生株相比提高T 4.24 倍。
[0070]實(shí)施例6、假單朐菌HT66及某閔工稈菌HT66 A rDeA A DsrA牛長曲線的測定
[0071]接種充分活化的假單胞菌HT66及基因工程菌到新鮮的KMB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16小后測定菌液的0D600值，以滅菌后的新鮮培養(yǎng)基按一定比律稀釋該菌液到0D600值為0.02。分別取四株綠針假單胞菌的稀釋液200 u L加入到96孔板中，每個菌株進(jìn)行5個平行實(shí)驗(yàn)，置于全自動微生物生長曲線分析儀(Bioscreen，USA)中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，以180轉(zhuǎn)/分的速度搖動96孔板。每隔3h測定一次菌液0D600值，共測定72h。
[0072]圖5為綠針假單胞菌HT66的野生株及不同基因工程菌的生長曲線。由圖5可知，rpeA基因的敲除對菌體的生長不大；psrA基因的敲除使菌體濃度明顯增加；但是，在rpeA和psrA雙敲除突變株中，菌體濃度顯著低于其它菌株，表明這兩個基因?qū)w的生長有著復(fù)雜的影響。
[0073]實(shí)施例7、吩嗪-1-甲酰胺的抗真菌效果
[0074]向馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，分別加入一定量吩嗪-1-甲酰胺，配制成直徑為9cm、濃度分別為0.05mg/L和0.10mg/L的鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基平板，不添加吩嗪_1_甲酰胺的葡萄糖培養(yǎng)基平板為對照，每個處理設(shè)置三個重復(fù)；在空白馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)水稻紋枯病菌、終極腐霉、甜葉菊斑枯病菌和西瓜枯萎病菌五天，在實(shí)驗(yàn)組和對照組平板中央接入直徑為8mm的病原菌菌絲塊，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5天后，采用十字交叉法分別測定接種在各種馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中的菌塊的直徑。抑菌率即對真菌生長的抑制效率的計(jì)算方法為:抑菌率=(對照菌斑平均直徑-實(shí)驗(yàn)菌斑平均直徑)/ (對照菌斑平均直徑-初始菌斑直徑)X 100 %，結(jié)果見表1。
[0075]表1綠針假單胞菌HT66產(chǎn)物PCN的抑菌活性表
【權(quán)利要求】
1.一種用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，敲除綠針假單胞菌HT66 (Psedunomonas chlororaphis HT66) CCTCC NO:M2013467 基因組中的 psrA 基因。
2.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述psrA基因的堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述敲除psrA基因包括如下步驟: A、擴(kuò)增psrA基因片段，并插入pEX18Tc質(zhì)粒中； B、擴(kuò)增慶大霉素抗性基因，插入psrA基因中間，使psrA基因發(fā)生插入突變； C、使突變的psrA基因與HT66基因組中的基因發(fā)生同源重組，根據(jù)抗性篩選出陽性克隆，即可。
4.如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，敲除所述綠針假單胞菌HT66基因組中的rpeA基因。
5.如權(quán)利要求4所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述rpeA基因的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
6.如權(quán)利要求5所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述敲除rpeA基因包括如下步驟: A、擴(kuò)增rpeA基 因片段，并插入pEX18Tc質(zhì)粒中； B、擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，插入rpeA基因中間，使rpeA基因發(fā)生插入突變； C、使突變的rpeA基因與HT66基因組或敲除psrA基因的HT66基因組中的基因發(fā)生同源重組，篩選陽性克隆，即可。
7.—種如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在制備防治植物真菌性病害的微生物農(nóng)藥中的用途。
8.—種如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株在制備微生物肥料中的用途。
9.一種吩嗪-1-甲酰胺的制備方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的用于生產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株發(fā)酵、提取后制備得到所述吩嗪-1-甲酰胺。
10.一種如權(quán)利要求9中所述的制備方法制得的吩嗪-1-甲酰胺在制備防治植物真菌性病害的微生物源農(nóng)藥中的用途。
【文檔編號】C05F11/08GK103642714SQ201310566864
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】彭華松, 張雪洪, 張平原, 王威, 胡洪波 申請人:上海交通大學(xué)