專利名稱：蠶絲心蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其基因工程生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉纖維改良基因工程，尤其是涉及一種蠶絲心蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其基因工程生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
棉纖維作為一種天然纖維，一直是紡織業(yè)和其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的主要原材料。棉纖維由棉花種皮的表皮細(xì)胞分化產(chǎn)生。成熟棉纖維中纖維素含量達(dá)90％以上，同時(shí)含有一部分蛋白。棉纖維的品質(zhì)，主要決定于纖維強(qiáng)力、長(zhǎng)度、伸長(zhǎng)度等性狀。這些性狀主要受基因型控制，環(huán)境因子和栽培對(duì)其影響低于20％。隨著分子生物學(xué)研究的深入和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟，用基因工程方法改良棉纖維品質(zhì)，將成為培育優(yōu)質(zhì)棉的重要手段。目前，美國(guó)、澳大利亞等國(guó)都投入大量資金進(jìn)行棉纖維的分子生物學(xué)研究。美國(guó)Agrocetus公司的科學(xué)家M.E.John博士等克隆了數(shù)個(gè)棉纖維特異表達(dá)的基因(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773；John ME，Plant Mol Biol，1996，30297-306；John ME，Critical Reviews in Biotechnology，1997，17(3)185-203)，并利用棉纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子將外源合成PHB的基因轉(zhuǎn)入棉花，使棉花纖維中產(chǎn)生脂肪聚酯復(fù)合物-PHB(多羥基丁酸酯)(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，9312768-12773)。
角蛋白可分為兩類，一類是α-角蛋白，一類是β-角蛋白。蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白絲心蛋白是β-角蛋白。絲心蛋白分子是片層結(jié)構(gòu)，鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。由于這種結(jié)構(gòu)方式使絲纖維具有很高的抗張強(qiáng)度，又有很柔軟的特性。
蠶絲由蠶絲心蛋白組成，國(guó)外已從蠶中分離到了蠶絲心蛋白基因(Yoshimi，K等，Gene.110(1992)151-158)。蠶絲心蛋白由兩條鏈組成，一條重鏈和一條輕鏈，其中重鏈350kDa大小，輕鏈25kDa大小。
將蠶絲心蛋白輕鏈基因轉(zhuǎn)入棉花，在棉纖維中特異表達(dá)，以改進(jìn)棉纖維的纖維韌性及柔軟性等。這是一種新的思路和技術(shù)，具有重大的實(shí)用意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蠶絲心蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維，即應(yīng)用基因工程途徑將蠶絲心蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花，使棉纖維中產(chǎn)生蠶絲心蛋白成分，改良棉纖維的韌性、彈性等。
運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室從亞洲棉基因組文庫(kù)中分離到棉纖維特異表達(dá)的啟動(dòng)子；克隆出蠶絲心蛋白基因，并在原核細(xì)胞中表達(dá)，制備蠶絲心蛋白抗體；接著構(gòu)建由棉纖維特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蠶絲心蛋白基因的轉(zhuǎn)基因二元載體，轉(zhuǎn)化棉花后，對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行了組織化學(xué)染色、PCR等分子驗(yàn)證?，F(xiàn)T2代正處于生長(zhǎng)期，纖維成熟后進(jìn)一步應(yīng)用Western blot驗(yàn)證棉纖維中蠶絲心蛋白的表達(dá)；最后對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花纖維進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)、強(qiáng)力、彈性等品質(zhì)特征分析，并分析其長(zhǎng)度、強(qiáng)度等各種性能。轉(zhuǎn)基因棉花纖維T1代棉纖維已經(jīng)檢測(cè)，其強(qiáng)度、彈性等都有增強(qiáng)。本發(fā)明技術(shù)方案詳述于后。
本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)蠶絲心蛋白基因棉纖維及其基因工程上產(chǎn)方法，利用棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在棉纖維中特異表達(dá)蠶絲心蛋白基因，能生產(chǎn)出全新的基因工程棉花，使棉纖維產(chǎn)生蠶絲心蛋白成分，使棉纖維強(qiáng)力提高，手感等更好。
本發(fā)明蠶絲心蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其轉(zhuǎn)基因工程方法及鑒定包括1、棉纖維特異表達(dá)的GAE6基因的克隆以亞洲棉D(zhuǎn)NA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物為參閱文獻(xiàn)(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)設(shè)計(jì)的，分別為E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。
PCR產(chǎn)物純化后，采用TA克隆方法裝入pGEM-T載體(購(gòu)自Promega公司)中，轉(zhuǎn)化XL1-Blue(本實(shí)驗(yàn)室保存菌種)，然后對(duì)插入片段進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定(Yu Xiao-hong，Zhu Yong-qing等，Acta PhytophysiologicaSinica，2000，26(2)143-147)。DNA序列由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)組用Appliedbiosystem373型全自動(dòng)熒光序列分析儀測(cè)定。序列用PCGENE軟件系統(tǒng)分析。
以PCR-96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫(kù)，正向引物為E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物為E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。經(jīng)7輪篩選，將陽性孔噬菌體稀釋后鋪板，挑取單個(gè)噬菌斑到SM溶液中，再以PCR鑒定陽性噬菌斑，依照Stratagene的實(shí)驗(yàn)指南釋放質(zhì)粒，得到一個(gè)陽性克隆，命名為GAE6-3A，經(jīng)多種酶切鑒定其插入片段長(zhǎng)8.0千堿基對(duì)。
DNA序列由寶生物工程公司Applied biosystem373型全自動(dòng)熒光序列分析儀測(cè)定，所得的GAE6-3A克隆上游啟動(dòng)子長(zhǎng)1457個(gè)堿基對(duì)，其核苷酸序列見SEQ ID No.1。
將該啟動(dòng)子克隆于含有內(nèi)含子的GUS基因前，基因槍法轉(zhuǎn)化了正常的棉花胚珠和突變體無絮棉胚珠，培養(yǎng)2天后進(jìn)行組織化學(xué)染色檢查GUS的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常胚珠中染色為多為深藍(lán)色并且GUS陽性比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于突變體，說明該啟動(dòng)子具有棉纖維特異性。
2、蠶絲心蛋白基因的克隆提取即將吐絲的蠶總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成了cDNA，根據(jù)文獻(xiàn)(YoshimiKikuchi等，Gene，1992，110151-158) 設(shè)計(jì)合成引物FBN4(5’CGGGATCCATCGGTGACCATCAATCAATAC 3’)和FBN2(5’GATATCTTAGACGTGAACCTGGCTG 3’)，PCR擴(kuò)增克隆了蠶絲心蛋白基因，其核苷酸序列見SEQ ID No.2，并亞克隆至pGEM-T載體(購(gòu)自Promega公司)中構(gòu)建了質(zhì)粒TFBN。序列測(cè)定表明所克隆的蠶絲心蛋白基因FBN核苷酸序列與已發(fā)表的蠶絲心蛋白基因同源性達(dá)99％，并將其克隆到原核表達(dá)載體中以檢測(cè)其表達(dá)。
3、蠶絲心蛋白抗體的制備割取聚丙烯酰胺凝膠電泳中蠶絲心蛋白特異表達(dá)條帶免疫兔(蠶絲心蛋白量為100-200μg)，每3周加強(qiáng)一次，免疫4次，一周后取血清作為蠶絲心蛋白抗體以用于Western-blot檢測(cè)。
4、轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體HAN的構(gòu)建(由北京中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，2002年3月11日，保藏編號(hào)為CGMCC NO.0726)使用中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的BKT質(zhì)粒(Yu Xiao-hong，Zhu Yong-qing等，ActaPhytophysiologica Sinica，2000，26(2)143-147)，BKT質(zhì)粒經(jīng)SacI/BamHI雙酶切后與TFBN經(jīng)BamHI/EcoRV雙酶切后連接。后用HindIII/SacI雙酶切后與2301質(zhì)粒經(jīng)HindIII/Sac I雙酶切后連接，構(gòu)建了由GAE6-3A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物轉(zhuǎn)基因二元載體HAN(含有35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的含有內(nèi)含子的GUS基因)-KAN-E6-FBN-35S-GUS-KAN-。
5、棉花轉(zhuǎn)化電擊法將構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，應(yīng)用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化棉花。同時(shí)大量提取質(zhì)粒，于棉花開花當(dāng)天經(jīng)花粉管途徑注射入子房中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化棉花蘇抗103、蘇抗310、蘇8、蘇12、中20、石遠(yuǎn)321、渝棉等多個(gè)品種。共獲得棉花種子1000粒。
6、轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的分子驗(yàn)證，包括組織化學(xué)染色、PCR、Southern雜交，棉纖維中蠶絲心蛋白的Western分析等。
取棉花種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)，待萌發(fā)3天后取根尖進(jìn)行組織化學(xué)染色植物組織浸泡于GUS染色液中，37℃溫浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脫色一次。在解剖鏡下觀察并照相。共獲得GUS陽性植株(根尖染成藍(lán)色)55棵。
選取GUS活性強(qiáng)的51棵植株，提取DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)，應(yīng)用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和引物FBNR(5’GTTGTTGCTTTGGCTGTTGC 3’)進(jìn)行PCR，復(fù)性溫度為54℃，25個(gè)循環(huán)后，取1μl反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用引物P3(5’GCTCCTAATTGAGTTGAAATCTTT3’)和FBNP(5’TTCCGGCGGTTTGGGCCACC 3’)再擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其中22棵棉花擴(kuò)增出特異條帶。
7、轉(zhuǎn)基因植物的Western檢測(cè)取轉(zhuǎn)基因棉花的棉纖維，用液氮充分研磨后，加入適量的蛋白提取緩沖液(50mM Tris/Hcl，10mM EDTA，pH8.0；1％巰基乙醇)，4℃，15,000rpm，離心10分鐘后，取上清液，按卡馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。各取5μg總蛋白進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳，然后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(50mA電流轉(zhuǎn)移2hr，4℃)，按Sambrook方法(1989)進(jìn)行雜交以檢測(cè)蠶絲心蛋白基因的表達(dá)。兔抗蠶絲心蛋白基因多克隆抗體以1∶300、第二抗體羊抗兔IgG抗體(購(gòu)自Promega公司)以1∶2500稀釋使用。顯色劑為BCIP和NBT(購(gòu)自Promega公司)。
8、轉(zhuǎn)基因棉纖維的品質(zhì)分析轉(zhuǎn)基因棉花纖維的顯微結(jié)構(gòu)分析，強(qiáng)度、長(zhǎng)度等品質(zhì)特征分析。發(fā)現(xiàn)強(qiáng)度、長(zhǎng)度、光澤等指標(biāo)都有改良。
與棉纖維相比，蠶絲心蛋白在光澤、強(qiáng)度、長(zhǎng)度、手感等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明最大的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)，是用基因工程的方法將蠶絲心蛋白基因引入棉纖維，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因棉纖維便遺傳性地具有蠶絲的某些性狀而無需混紡，從而為棉纖維家族提供了新的成員，為棉纖維改良提供了一條新的途徑。將絲心蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花中并使其在棉纖維中特異表達(dá)，可使轉(zhuǎn)基因棉纖維含有蠶絲的成分，使轉(zhuǎn)基因纖維具有新的特性，強(qiáng)度改善，手感等更好。
盡管以品種間雜交為主的傳統(tǒng)育種培育了一些具有較好纖維性狀的棉花品種，但是受到遠(yuǎn)緣雜交不親和的局限，而且也不可能將動(dòng)物毛、絲的性狀引入棉花。通過基因工程提高纖維品質(zhì)是棉花育種研究的新領(lǐng)域，這使所有生物的基因、甚至合成基因都成為可供利用的外源基因。通過遺傳轉(zhuǎn)化等方法將特定的外源基因?qū)朊藁ú⑹蛊浞€(wěn)定地遺傳表達(dá)，以改良特定的性狀。應(yīng)用棉纖維特異表達(dá)的啟動(dòng)子可使蠶絲心蛋白基因在棉纖維中特異表達(dá)而不在其它部位表達(dá)，避免影響棉花植株的性狀。


圖1為GAE6基因克隆的酶切分析圖。
其中泳道1為1kb Ladder Marker DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物，泳道2-6分別為GAE6-3A克隆經(jīng)EcoRI，EcoRI+HindIII，NcoI+EcoRI，HindIII，BamHI酶切產(chǎn)物。
圖2為蠶絲心蛋白基因植物轉(zhuǎn)基因載體HAN的構(gòu)建圖。
TFBN蠶絲心蛋白基因的中間載體；BKT中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的菌種；BFN蠶絲心蛋白基因的中間載體；2301中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供基因表達(dá)載體；HAN蠶絲心蛋白基因的植物表達(dá)載體；Fibroin蠶絲心蛋白基因；GAE6-3A promoter/E6 promoterE6啟動(dòng)子(棉纖維特異表達(dá)的啟動(dòng)子)；Keratin角蛋白基因；35S promoter35S啟動(dòng)子；AMP氨芐青霉素抗性基因；Kanamycin(R)卡那霉素抗性基因；NOS-T終止子；GUSβ-葡萄糖苷酸酶基因。
圖3為轉(zhuǎn)基因植物PCR陽性鑒定電泳圖。
泳道1為轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒正對(duì)照，泳道2-5為轉(zhuǎn)絲心蛋白基因轉(zhuǎn)基因棉花，泳道6為未轉(zhuǎn)基因棉花，泳道7為體系負(fù)對(duì)照。
圖4為基因同源性比較圖。
其中QueryFibroin，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室克隆得到的蠶絲心蛋白輕鏈基因。
Sbjctfibroin light chain precursor(已發(fā)表蠶絲心蛋白輕鏈基因)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 棉纖維特異表達(dá)的GAE6基因的克隆(1)亞洲棉葉片DNA的少量提取取約100毫克葉片加液氮迅速研磨成粉末，加入500μl抽提緩沖液(500mmol/L NaCl；50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/L EDTA(pH8.0)；1％β-巰基乙醇)；加入60μl 20％的PVP及100μl10％的SDS，混勻；65℃水浴20分鐘，加入160μl 3M的KAc(pH4.8)，冰浴30分鐘；4℃，15,000rpm離心10分鐘，上清移入新管，加0.6倍體積的異丙醇，混勻；冰浴10分鐘；4℃，12,000rpm離心5分鐘，棄去上清，75％乙醇洗滌后抽干，加入500μlTE溶解；加入等體積的酚∶氯仿∶異丙醇(25∶24∶1)抽提1-2次；12,000rpm室溫離心10分鐘，吸上清至新管，加入等體積的異丙醇，1/10體積3N的NaAc(pH5.2)，-20℃放置5分鐘；4℃，15,000rpm離心10分鐘，75％乙醇洗滌沉淀，抽干后獲得DNA，溶于100μlTE中。
(2)GAE6基因片段的擴(kuò)增及序列分析以亞洲棉D(zhuǎn)NA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。兩個(gè)引物分別為E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。PCR反應(yīng)體系MgCl2(10×)3μl，PCR反應(yīng)緩沖液(10×)3μl，dNTPs(2.5μMeach)3μl，E61(25μM)0.5μl，E62(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性10分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復(fù)性30秒，延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸7分鐘。PCR反應(yīng)后獲得一特異擴(kuò)增產(chǎn)物GAE6基因片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)Wizard柱(Promega公司)純化后，采用TA克隆方法將擴(kuò)增片段裝入pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化XL1-Blue，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。DNA序列由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)組用Applied biosystem373型全自動(dòng)熒光序列分析儀測(cè)定。結(jié)果表明所克隆片段與已發(fā)表海島棉的E6基因高度同源(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)。
(3)從亞洲棉基因組文庫(kù)中篩選GAE6基因根據(jù)上述(2)中所得片段順序合成兩個(gè)引物，正向引物為E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物為E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。以PCR-96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫(kù)，取1μl基因組文庫(kù)(λ-ZAP)溶液(約108pfu)與400μl XL1-Blue菌液共培養(yǎng)30分鐘后，分置于96孔板各孔中37℃培養(yǎng)8～9小時(shí)。每列8孔各取5μl混勻，各取1μl作PCR。選取陽性列的各孔分別作PCR。取陽性孔混合物進(jìn)行倍比稀釋作PCR，以能擴(kuò)增出條帶的最大稀釋度進(jìn)行稀釋，再鋪96孔板。經(jīng)7輪篩選，獲得一陽性克隆。
該陽性克隆依照Stratagene的實(shí)驗(yàn)指南釋放質(zhì)粒。在1.5ml離心管中加入200μl XL1-BLUE細(xì)胞，200μl陽性噬菌斑SM溶液，1μl ExAssit helper噬菌體(Stratagen公司)，混勻，37℃溫育15分鐘。將混合液轉(zhuǎn)至3ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5小時(shí)。2,000g離心15分鐘，吸出上清液。70℃溫育15分鐘，4,000g離心15分鐘，吸出上清液。兩個(gè)1.5ml離心管中各加入200μl新鮮的SOLR細(xì)胞，并分別加入上述上清液100、10μl，37℃溫育15分鐘，各取10-50μl鋪LB(含100μg/ml Amp)平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑單克隆鑒定。經(jīng)限制性酶切結(jié)果顯示該克隆PCR擴(kuò)增片段約為8.0kb(參見圖1)。DNA測(cè)序表明該基因?yàn)閬喼廾薜腅6基因，上游啟動(dòng)子長(zhǎng)1457個(gè)堿基對(duì)，命名為GAE6-3A，見SEQ ID No.1。
實(shí)施例2 GAE6-3A啟動(dòng)子的表達(dá)特異性從棉花基因組文庫(kù)中分離出棉纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子，并將該啟動(dòng)子克隆于含有內(nèi)含子的GUS基因前，基因槍法轉(zhuǎn)化了正常的棉花胚珠和突變體無絮棉胚珠，培養(yǎng)2天后進(jìn)行組織化學(xué)染色檢查GUS的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常胚珠中染色為多為深藍(lán)色并且GUS陽性比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于突變體，初步說明該啟動(dòng)子具有棉纖維特異性。
實(shí)施例3 蠶絲心蛋白基因的克隆(1)蠶絲心蛋白基因RNA的提取取0.1-3g即將成熟的蠶，用液氮研磨成粉末后，轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，加入3ml預(yù)冷的提取緩沖液(1M Tris/HCl，50mM EDTA，1.4％SDS(w/v)，0.1％DEPC，Ph9.5)混勻，再加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻稱。冰上放置1小時(shí)，不時(shí)顛倒混勻。12,000rpm，4℃離心10分鐘。將水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻后，12,000rpm，4℃離心10分鐘。取水相，加入1/2體積的高鹽溶液和1/2體積的異丙醇，混勻后-70℃放置30分鐘。10,000rpm，4℃離心5分鐘，棄去上清，沉淀溶于2ml的DEPC水中。加入1/3體積的8M的LiCl溶液，混勻后，-20℃放置過夜。10,000rpm，4℃離心5分鐘，棄去上清，沉淀用70％的乙醇洗滌后，晾干，用DEPC水溶解。
(2)蠶絲心蛋白基因的擴(kuò)增提取蠶的RNA后，用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。20μl體系，42℃反應(yīng)30分鐘，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在沸水中煮5分鐘。
反轉(zhuǎn)錄體系MgCl2(25mM)4μl，10xRNA PCR Buffer2μlRnase Free dH2O8.5μldNTP Mixture(10mM)2μlRnase Inhibitor(40U/μl)0.5μlReverse Transcriptase(5U/μl)1μlOligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/μl)1μl
蠶RNA(1μg/μl)1μl取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，應(yīng)用引物FBN2(5’GATATCTTAGACGTGAACCTGGCTG 3’)和FBN4(5’CGGGATCCATCGGTGACCATCAATCAATAC 3’)擴(kuò)增克隆了蠶絲心蛋白基因并測(cè)定了其序列。
PCR反應(yīng)體系10x PCR Buffer 10μldNTP Mixture(2.5μM each) 8μlFBN2(25μM) 3μlFBN4(25μM) 3μl蠶的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1μlExTaq DNA polymerase(5U/μl)0.5μlddH2O 74.5μlPCR條件94℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復(fù)性30秒，延伸50秒，共35個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸7分鐘。反應(yīng)后獲得特異的長(zhǎng)789bp的擴(kuò)增片段，克隆至pGEM-T載體中獲得TFBN。DNA測(cè)序及序列分析表明其為蠶絲心蛋白基因，其核苷酸序列見SEQ ID No.2，與已發(fā)表的蠶絲心蛋白基因的同源性達(dá)99.2％。
實(shí)施例4 蠶絲心蛋白基因的原核表達(dá)及抗體的制備應(yīng)用BamHI和SacI酶切下蠶絲心蛋白基因，克隆至原核表達(dá)載體PET-32b(+)中，獲得高效表達(dá)。從聚丙烯酰胺凝膠中割取蠶絲心蛋白特異表達(dá)條帶免疫兔(蠶絲心蛋白量為100-200μg)，隔4周加強(qiáng)一次，后隔1周加強(qiáng)一次，共免疫4次，一周后取血清測(cè)定效價(jià)，作為蠶絲心蛋白抗體。加入0.02％的疊氮鈉保存于4℃或直接保存于-70℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例5 植物轉(zhuǎn)基因載體HAN的構(gòu)建使用中科院上海植物生理研究所開放實(shí)驗(yàn)室提供的已構(gòu)建好的BKT(YuXiao-hong，Zhu Yong-qing等，Acta Phytophysiologica Sinica，2000，26(2)143-147)質(zhì)粒，BKT質(zhì)粒經(jīng)SacI/BamHI雙酶切后與TFBN經(jīng)BamHI/EcoRV雙酶切后連接。后用HindIII/SacI雙酶切后與2301(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)質(zhì)粒經(jīng)HindIII/SacI雙酶切后連接，構(gòu)建了由GAE6-3A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物轉(zhuǎn)基因二元載體HAN(含有35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的含有內(nèi)含子的GUS基因)-KAN-E6-FBN-35S-GUS-KAN-，參見圖2。以上所用酶均購(gòu)自PROMEGA公司，反應(yīng)溫度條件為37℃溫育2小時(shí)。
實(shí)施例6 棉花的轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化棉花首先培養(yǎng)細(xì)菌農(nóng)桿菌LBA4404(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)培養(yǎng)于附加100μg/μl利福平和300μg/μl鏈霉素的LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩過夜。HB101(含pRK2013，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)菌株培養(yǎng)于含卡那霉素50μg/μl的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。含中間載體的大腸桿菌(DH5α，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院植物生理生態(tài)研究所分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)于含添加卡那霉素50μg/μl的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜；三種培養(yǎng)物各取100μl于Eppendorf管內(nèi)混合，4000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入1ml LB重新懸浮菌體，短時(shí)離下菌體，棄去上清液；菌體重懸于50μl LB中，點(diǎn)于LB平板上，28℃培養(yǎng)過夜；次日將過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿取出，交叉取2環(huán)培養(yǎng)，重新懸浮于100μl LB；倍比稀釋上述菌懸液；涂板，即取100-200μl菌液涂布于含100μg/μl利福平，300μg/μl鏈霉素和卡那霉素50μg/μl的LB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天；挑單菌落點(diǎn)于含如上三種抗生素的LB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，再篩選一次；挑取數(shù)個(gè)菌落進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，PCR和質(zhì)粒酶切鑒定。三親雜交將構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA440后，應(yīng)用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化棉花?；蛴秒姄舴▽?gòu)建的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。
(2)花粉管微注射法轉(zhuǎn)化棉花大量提取質(zhì)粒，用于花粉管微注射法轉(zhuǎn)化棉花蘇抗103、蘇抗310、蘇8、蘇12、中20、石遠(yuǎn)321、渝棉等多個(gè)品種。
挑單克隆菌落于500ml LB培養(yǎng)基，振搖培養(yǎng)20小時(shí)；5,000rpm離心5分鐘收菌，棄去上清液；加入5ml溶液1(成分見《分子克隆》第19頁)，混勻；加入10ml溶液2(成分見《分子克隆》第20頁)，上下顛倒混勻，室溫靜置5分鐘；加入7.5ml溶液3(成分見《分子克隆》第20頁)，溫和混勻；7,000rpm離心5分鐘，取上清液倒入45ml離心管中，加入7.5ml異丙醇，混勻；7,000rpm離心2分鐘。上清液倒入另一支45ml離心管中，加6ml異丙醇，混勻；7,000rpm離心5分鐘，棄上清液；沉淀用200μl TE懸浮，轉(zhuǎn)入1.5ml小離心管中，再用200μl TE洗一遍含沉淀的離心管，合并于小離心管中，加入2μl RNase(10mg/ml)，37℃，放置30分鐘；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，振蕩30秒。12,000rpm離心5分鐘；吸上層溶液至新的Eppendorf管中，加入1/10體積的3N醋酸鈉，再加總體積2-3倍的無水冷乙醇，-20℃放置10分鐘；10,000rpm離心5分鐘，棄上清；加入1ml 70％乙醇沖洗后，干燥；將沉淀溶于TE，10％PEG純化。
于棉花開花后一天將質(zhì)粒經(jīng)花粉管途徑注射入子房中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，共獲得棉花種子1000粒；實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的分子驗(yàn)證，包括組織化學(xué)染色、PCR、Southern雜交、Northern雜交，棉纖維中蠶絲心蛋白的Western分析等。
(1)組織化學(xué)染色取棉花種子進(jìn)行無菌培養(yǎng)，待萌發(fā)3天后取根尖進(jìn)行組織化學(xué)染色植物組織浸泡于GUS染色液中，37℃溫浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脫色一次。在解剖鏡下觀察并照相。GUS染色液25ml磷酸緩沖液(pH7.0)，0.25ml 0.1M K3[Fe(CN6)]，0.25ml 0.1M K4[Fe(CN6)]，1ml 0.5M Na2EDTA，ddH2O 23.5ml，Gluc 50mg。共獲得GUS陽性植株(根尖GUS染色為藍(lán)色)55棵。
(2)PCR檢測(cè)選取GUS活性強(qiáng)的51棵植株，提取DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)，應(yīng)用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和引物FBNR(5’GTTGTTGCTTTGGCTGTTGC 3’)進(jìn)行PCR，復(fù)性溫度為54℃，25個(gè)循環(huán)后，取1μl反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用引物P3(5’GCTCCTAATTGAGTTGAAATCTTT3’)和FBNP(5‘TTCCGGCGGTTTGGGCCACC 3’)再擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，其中22棵棉花擴(kuò)增出特異條帶(參見圖3)。
(3)DNA分子雜交a棉花基因組DNA提取方法取1g棉花葉片加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加入5ml抽提緩沖液(500mM NaCl；50mM Tris/Hcl，pH8.0；50mM EDTA，pH8.0；1％β-巰基乙醇)，0.6ml 20％PVP及1ml 10％SDS，輕輕混勻。65℃溫育20分鐘后，加入1/10體積的5M KAC，冰浴30分鐘。4℃，15,000rpm離心10分鐘，吸出上清液。加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，冰浴10分鐘，4℃，10,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。沉淀用75％乙醇洗滌后晾干，加入500μl TE溶解。加入適量的RNase，37℃溫育30分鐘后，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次。將上層液轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3N NaAC(pH5.2)，冰浴10分鐘。4℃，12,000rpm離心5分鐘后，沉淀用75％乙醇洗滌抽干，溶于100μl TE中。
b DNA雜交任意選取陽性植株，提取基因組DNA，分別以質(zhì)粒HAN和未轉(zhuǎn)化棉花的基因組DNA為正、負(fù)對(duì)照進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定(Southern)。
(4)轉(zhuǎn)基因植物的Western檢測(cè)取轉(zhuǎn)基因棉花的棉纖維，用液氮充分研磨后，加入適量的蛋白提取緩沖液(50mM Tris/Hcl，10mM EDTA，pH8.0；1％巰基乙醇)，4℃，15,000rpm，離心10分鐘后，取上清液，按卡馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。各取5μg總蛋白進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳，然后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(50mA電流轉(zhuǎn)移過夜，4℃)，按Sambrook方法(1989)進(jìn)行雜交以證明轉(zhuǎn)基因棉纖維中蠶絲心蛋白的表達(dá)。兔抗絲心蛋白基因多克隆抗體以1∶300、第二抗體羊抗兔IgG抗體(購(gòu)自Promega公司)以1∶2500稀釋使用。顯色劑為BCIP和NBT(購(gòu)自Promega公司)。
xuliebiao.ST25SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所<120>蠶絲心蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其基因工程生產(chǎn)方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1457<212>DNA<213>Gossypium arboreum Linn<400>1aattcatagg tataggaaga agccctgtca aatagagatt ttttctttcg accatatttc 60gattgttaat acgatatata aggaccgcta ctacaaatag tactacaccc ttgatcgtga120aatatcgatt gcttgttgaa ccctgtgaat tgcgtgaaag taggatactc caaattcggg180ggtccaagag ttttataaaa cgttcttggt ggaaaaaaat gtgaatgaaa gatcccactg240aattgaattg ggtccatgaa tctaagaaat agtgagaatt ctcctatttt tatttattta300tttgcttagg aagttttact gacactgctt ttatttttcc atcaatcaaa tttaagagac360aattcacttt ttataattaa caaaaaaaaa caaaaagaaa ataaaagaaa ttactttttt420ctttttcgtg ttcgatacaa gatagatgaa atatgaaaaa taaaatgaaa tgaaaatata480ttactagtga tatatcacct ccattatgta ggggaaagaa ataaaaataa tattaattta540tgatacttcc ataatgtggt taaaaataat tatctagtat ttttttgtaa aaaaaaaaag600ttgatatcta tgctactaat gaggtttctt agtgagtttg ttactactaa taaagtttat660
xuliebiao.ST25ttgcatggtt gagaccttat gcttttcaaa tacccatttt tgaattttaa aaattgtgaa720tttttattat atttaaaaaa caagttattt atataactag taatgtatta ttttgacttt780tttttaatcg agttaatgtt ggttatttcg ttataccaat tcaataaaat attttattta840tattaaatta tagcatactc acgatgtggg tgaagtaaaa ttatttaaca aatatatttt900gaaaaattga taaaaatact aaatgaggtt ttggttgaat agtaagatat aattattaca960aattataaat atgtaggttc aaaatctatc atgtgtatat ttgtactatt attctatata1020aattgataac cttataaaag tatctaattt agtttatggt tgattgatcg ataataccaa1080atttattaaa aattaatatt agtaaagata tatagtacaa aactaaacat aaaattttat1140atgttaagga aatagcggaa aaaatatcat atttgtagaa ctgtttagca gtgtgggaga1200atgggatcat tacaaggaaa aatgaaatat atatcattaa taacaaacat aaaagaaagc1260gtcttttgat aaagttgtta ttggtgtaat gtgaagggac cacaatcatc accattcacc1320acttgctcct aattgagttg aaatcttttt acaacataga aaactagaag atcgcccttt1380cttgcttcat atatatagat tttgtatcat cgcaatttca catcacacac acaagtaaag1440cattagcaac catagcc 1457<210>2<211>789<212>DNA<213>Bombyx mori<220><221>CDS
xuliebiao.ST25<222>(1)..(789)<223><400>2atg aag cct ata ttt ttg gta tta ctc gtc gct aca agc gcc tac gct48Met Lys Pro Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Ala Thr Ser Ala Tyr Ala1 5 10 15gca cca tcg gtg acc atc aat caa tac agt gat aat gaa att cca cgc96Ala Pro Ser Val Thr Ile Asn Gln Tyr Ser Asp Asn Glu Ile Pro Arg20 25 30gac att gat gat gga aaa gct agt tcc gta ttc tca cgt gca tgg gac 144Asp Ile Asp Asp Gly Lys Ala Ser Ser Val Phe Ser Arg Ala Trp Asp35 40 45tac gtc gat gac acc gac aaa agc atc gcc atc ctc aac gtt caa gag 192Tyr Val Asp Asp Thr Asp Lys Ser Ile Ala Ile Leu Asn Val Gln Glu50 55 60atc ttg aag gac atg gcc agc cag ggc gac tat gca agt caa gca tca 240Ile Leu Lys Asp Met Ala Ser Gln Gly Asp Tyr Ala Ser Gln Ala Ser65 70 75 80gcg gtg gcc caa acc gcc gga att atc gcc cat cta tct gcc ggt atc 288Ala Val Ala Gln Thr Ala Gly Ile Ile Ala His Leu Ser Ala Gly Ile85 90 95ccc ggt gat gcc tgt gca gcc gct aac gtc att aac tct tac aca gac 336Pro Gly Asp Ala Cys Ala Ala Ala Asn Val Ile Asn Ser Tyr Thr Asp100 105 110ggc gtc agg tcc gga aac ttc gcc ggc ttc aga caa tct ctc ggt ccc 384Gly Val Arg Ser Gly Asn Phe Ala Gly Phe Arg Gln Ser Leu Gly Pro115 120 125ttc ttc gga cac gtg gga caa aac ttg aat ctt atc aat caa ctc gtc 432
xuliebiao ST25Phe Phe Gly His Val Gly Gln Asn Leu Asn Leu Ile Asn Gln Leu Val130 135 140acc aac cct ggt caa ctc cga tac tct gtc gga cca gcc ctg ggt tgt 480Thr Asn Pro Gly Gln Leu Arg Tyr Ser Val Gly Pro Ala Leu Gly Cys145 150 155 160gcc gga ggt gga aga atc tat gac ttc gaa gcc gct tgg gat gca atc 528Ala Gly Gly Gly Arg Ile Tyr Asp Phe Glu Ala Ala Trp Asp Ala Ile165 170 175tta gcc agc agt gac tct agt ttc tta aat gaa gag tac tgc atc gtc 576Leu Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Leu Asn Glu Glu Tyr Cys Ile Val180 185 190aag aga ttg tac aac tct cgc aac agc caa agc aac aac atc gct gcc 624Lys Arg Leu Tyr Asn Ser Arg Asn Ser Gln Ser Asn Asn Ile Ala Ala195 200 205tat ata acc gct cac tta ctt cca cca gtt gct caa gtg ttc cac caa 672Tyr Ile Thr Ala His Leu Leu Pro Pro Val Ala Gln Val Phe His Gln210 215 220tca gct gga tca atc aca gac ctc ctg aga ggc gtt ggc aac ggt aat 720Ser Ala Gly Ser Ile Thr Asp Leu Leu Arg Gly Val Gly Asn Gly Asn225 230 235 240gac gcg acc ggt tta gtt gct aat gct caa aga tat att gca caa gca 768Asp Ala Thr Gly Leu Val Ala Asn Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Gln Ala245 250 255gcc agc cag gtt cac gtc taa 789Ala Ser Gln Val His Val260
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因棉纖維，其特征在于，它是動(dòng)物絲心蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉纖維，其特征在于，所述的動(dòng)物絲心蛋白是蠶絲心蛋白。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因棉纖維的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括如下步驟a.棉纖維特異表達(dá)基因的克?。籦.動(dòng)物絲心蛋白基因的克?。籧.轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的制備；d.棉花轉(zhuǎn)化。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因棉纖維的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的棉纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子為GAE6-3A啟動(dòng)子，其核苷酸序列為SEQIDNo.1，長(zhǎng)1457個(gè)堿基對(duì)。
5.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因棉纖維的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增了蠶絲心蛋白基因，其核苷酸序列見SEQ ID No.2，并亞克隆至pPGEM-T載體中構(gòu)建了質(zhì)粒TFBN。
6.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因棉纖維的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體為HAN，它是由GAE6-3A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物轉(zhuǎn)基因二元載體，含有35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的含有內(nèi)含子的GUS基因，該載體由北京中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNO.0726。
7.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因棉纖維的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于，BKT質(zhì)粒經(jīng)SacI/BamHI雙酶切后與TFBN經(jīng)BamHI/EcoRV雙酶切后連接，后用HindIII/SacI雙酶切后與2301質(zhì)粒經(jīng)HindIII/Sac I雙酶切后連接構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體HAN。
全文摘要
一種含動(dòng)物蠶絲心蛋白基因棉纖維及其基因工程方法。應(yīng)用中棉基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增了E6基因片段,根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物,用PCR－96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫(kù),得到該基因GAE6－3A克隆,其插入片段長(zhǎng)約8kb,上游啟動(dòng)子長(zhǎng)1457bp,該GAE6－3A啟動(dòng)子在棉纖維中特異表達(dá)。提取了蠶的RNA,反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增克隆了編碼蠶絲心蛋白的基因,并將其裝入原核表達(dá)載體中獲得高效表達(dá)后,免疫兔制備蠶絲心蛋白抗體。進(jìn)一步構(gòu)建了由GAE6－3A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的絲心蛋白植物轉(zhuǎn)基因載體,轉(zhuǎn)化棉花,經(jīng)組織化學(xué)染色、PCR及DNA分子雜交驗(yàn)證蠶絲心蛋白基因已轉(zhuǎn)入棉花中。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1369560SQ0211114
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者陳曉亞, 朱勇清, 許可香, 周寶良, 陳松, 林芝萍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所