一種鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光pcr引物、探針和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針和試劑盒。所述引物如序列SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：2所示，所述探針如序列SEQ?ID?NO：3至SEQ?ID?NO：5所示。本發(fā)明試劑盒靈敏、快速、準(zhǔn)確，能同時(shí)對(duì)13種蛙病毒屬病毒進(jìn)行檢測(cè)，這項(xiàng)技術(shù)在外來(lái)重大水生疫病蛙病毒屬病毒的監(jiān)控中具有非常大的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】-種鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針和 試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針和試劑盒，可 同時(shí)篩查13種娃病毒屬病毒，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，由虹彩病毒科蛙病毒屬引起的魚類、兩棲類和爬行類的疾病遍布全球，涉 及許多組織系統(tǒng)性感染疾病，出現(xiàn)病癥后的宿主動(dòng)物死亡率高達(dá)100%,給水產(chǎn)業(yè)造成了非 常大的經(jīng)濟(jì)損失。在亞洲、大洋洲、歐洲、北美洲和南美洲等地區(qū)從自然生存、養(yǎng)殖、健康以 及死亡的蛙中均分離到了蛙病毒屬病毒，蛙病毒屬已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（0ΙΕ)規(guī)定為必 須申報(bào)的水生動(dòng)物疫病之一。
[0003] 蛙病毒屬屬于虹彩病毒科，為裸露或有囊膜的二十面體病毒粒子，病毒直徑約 150?170nm，基因組是單一線狀雙鏈DNA，全長(zhǎng)為150?170kb，GC含量為49%?55%，在 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都能復(fù)制。其結(jié)構(gòu)蛋白主衣殼蛋白（major capsid protein, MCP)占整 個(gè)病毒粒子多肽的40?45%，具有高度的保守性，又具有足夠的變異性，氨基酸同源性達(dá) 65. 9%，是虹彩病毒進(jìn)化和分類的重要依據(jù)，所以本發(fā)明利用MCP的同源性差異進(jìn)行蛙病 毒屬病毒的鑒別和區(qū)分，該方法是可靠的。
[0004] 由于蛙病毒屬病毒的基因序列相似性達(dá)90%以上，所以設(shè)計(jì)特異的引物和探針對(duì) 于區(qū)分和鑒別娃病毒屬病毒非常關(guān)鍵。目前，研究者們建立了虹彩病毒娃病毒屬實(shí)時(shí)突光 PCR的檢測(cè)方法、虎紋蛙病毒（tiger frog virus，TFV)的普通PCR方法、大口黑鱸虹彩病 毒（Largemouth bass virus，LMBV)的雙重PCR檢測(cè)方法以及大銳虹彩病毒ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)TaqMan實(shí)時(shí)突光定量PCR的檢測(cè)方法，上述方法，對(duì)于同一個(gè)檢 測(cè)樣本，最多能鑒別和區(qū)分2種蛙病毒屬病毒，而本發(fā)明第一次建立了蛙病毒屬病毒的三 重實(shí)時(shí)突光PCR方法，對(duì)于同一個(gè)檢測(cè)樣本，可同時(shí)鑒別和區(qū)分13種娃病毒屬病毒，降低了 檢測(cè)成本，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了高通量處理樣本的簡(jiǎn)便性，該方法具有快速性、準(zhǔn)確性 和高靈敏性的特點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異和高效的鑒別蛙病毒屬病毒的 三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針和試劑盒。該方法檢測(cè)覆蓋蛙病毒屬病毒種類多，是一種特異 性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高、靈敏性高的檢測(cè)方法。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供一組鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，其中，采 用一對(duì)通用引物，正向引物為V -ATGGTGCARAACGTCA-3' (SEQIDN0:1)，反向引物為 5' -GCTCCAKSACSGTGTT-3; (SEQ ID N0 ：2)〇
[0008] 所述探針如下所示：
[0009] 探針 1 :5' -CTTCCGTCGGCTCCAATTACACC-3，（SEQ ID NO :3)
[0010] 探針 2 :5，-CCAACAACAGGAGTGACGCAAGTG-3，（SEQ ID NO :4)
[0011] 探針 3 :5，-CTGTGGGTTCAAATTATACGTGTGT-3，（SEQ ID NO :5)
[0012] 其中，所述序列SEQ ID NO :3為鑒別沼澤綠牛蛙虹彩病毒RGV(Rana grylio virus)、中華鳘虹彩病毒 STIV(Soft-shelled Turtle iridovirus)、虹彩病毒 3 型 FV3 (frog virus3)、飾紋汀蟾（穴居娃）虹彩病毒 BIV (Limnodynastes ornatus or bohel iridovirus)、虎紋娃病毒 TFV (tiger frog virus)、大銳虹彩病毒 ADIV(Andrias davidiamus iridovirus)、流行性造血器官壞死癥病毒 EHNV(Epizootie hematopoietie necrosis virus)、歐洲鮰魚病毒 ECV(European catfish iridovirus)和歐 It 病毒 ESV(European sheetfish iridovirus)的探針，并且Y端標(biāo)記FAM突光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo) 記BHQ1淬滅基團(tuán)。
[0013] 所述序列 SEQ ID N0 :4 為鑒別大口黑S盧病毒 LMBV(Largemouth bass virus)、 裂唇魚病毒DFV(doctor fish virus)和孔雀魚病毒6型GV6(guppy virus6)的探針， 并且Y端標(biāo)記HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)；LMBV、DFV和GV6統(tǒng)稱為 SCRV(Santee-Cooper ranavirus)〇
[0014] 所述序列SEQ ID NO :5為鑒別新加坡石斑魚虹彩病毒SGIV(Singapore grouper iridovirus)的探針，并且Y端標(biāo)記CY5熒光報(bào)告基團(tuán)A端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)。
[0015] 我們采用TaqMan熒光PCR檢測(cè)技術(shù)建立了鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，對(duì)反應(yīng)的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中包括引物探針的篩選，Mg2+濃度的優(yōu)化，引物和探 針濃度的優(yōu)化，得到以下試劑盒。
[0016] 鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，由以下組分組成：
[0017] 1)DNA提取試劑：可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的提取試劑，也可以采用商業(yè)化的提 取試劑盒，本發(fā)明的DNA提取試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司。
[0018] 2)PCR反應(yīng)液，表1為優(yōu)化后的PCR反應(yīng)液配方。
[0019] 表1PCR反應(yīng)液配方
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一組鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，其特征在于，所述引物如 序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :2所示，所述探針如序列SEQ ID NO :3至SEQ ID NO :5所 /_J、1 〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針，其特征 在于，所述序列SEQ ID NO :3為鑒別沼澤綠牛蛙虹彩病毒、中華鱉虹彩病毒、虹彩病毒3型、 飾紋汀蟾（穴居蛙）虹彩病毒、虎紋蛙病毒、大鯛虹彩病毒、流行性造血器官壞死癥病毒、歐 洲鮰魚病毒和歐鯰病毒的探針，并且5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1淬滅基 團(tuán)； 所述序列SEQ ID NO :4為鑒別大口黑鱸病毒、裂唇魚病毒和孔雀魚病毒6型的探針，并 且Y端標(biāo)記HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)； 所述序列SEQ ID NO :5為鑒別新加坡石斑魚虹彩病毒的探針，并且5'端標(biāo)記CY5熒 光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針在制備 鑒別娃病毒屬病毒的實(shí)時(shí)突光PCR試劑盒中的應(yīng)用。
4. 一種鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，其特征在于，其包括以下組分： (1) DNA提取試劑； (2) PCR反應(yīng)液：包括如序列表SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:2所示的用于鑒別蛙病毒屬 病毒的引物，如序列表SEQ ID NO :3至SEQ ID NO :5所示的探針； (3) Taq DNA 聚合酶； (4) 無(wú)菌雙蒸水； (5) 陰性對(duì)照； (6) 陽(yáng)性對(duì)照。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，其特征在于， 所述序列SEQ ID NO :3為鑒別沼澤綠牛蛙虹彩病毒、中華鱉虹彩病毒、虹彩病毒3型、飾紋 汀蟾（穴居蛙）虹彩病毒、虎紋蛙病毒、大鯛虹彩病毒、流行性造血器官壞死癥病毒、歐洲鮰 魚病毒和歐鯰病毒的探針，并且5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)； 所述序列SEQ ID NO :4為鑒別大口黑鱸病毒、裂唇魚病毒和孔雀魚病毒6型的探針，并 且Y端標(biāo)記HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)； 所述序列SEQ ID NO :5為鑒別新加坡石斑魚虹彩病毒的探針，并且5'端標(biāo)記CY5熒 光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒別蛙病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，其特征在于， 所述PCR反應(yīng)液還包括緩沖液、MgCl 2和dNTP。
7. -種鑒別娃病毒屬病毒的三重實(shí)時(shí)突光PCR檢測(cè)方法，所述方法包括： (1) 用DNA提取試劑同時(shí)提取陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及待測(cè)樣本中的核酸DNA作為PCR 檢測(cè)模板； (2) 進(jìn)行PCR反應(yīng)； (3) 結(jié)果判定。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104099428SQ201410327903
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】張利峰, 李江宇, 凌鳳俊, 任彤, 高志強(qiáng), 谷強(qiáng), 張偉, 王樹云, 劉艷華, 王娜, 景宏麗, 張旻, 賈佩嶠, 江育林 申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 北京海森通生物科技有限公司