一種牛支原體抗體檢測試劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物檢測試劑，以及這種檢測試劑的制備方法，確切講本發(fā)明涉及一種牛支原體抗體檢測試劑及其制備方法。本發(fā)明的牛支原體抗體檢測試劑由混合均勻的1份牛支原體P48重組表達(dá)的融合蛋白抗原和1份10%醛化-鞣酸化綿羊紅細(xì)胞（v/v）構(gòu)成。本發(fā)明的牛支原體抗體檢測試劑所用的P48重組表達(dá)的融合蛋白抗原基因序列為SEQID№1。本發(fā)明可真實(shí)地檢測牛支原體抗體；具有保存時間長、致敏效價高、易于長時間保存，血凝效價高，以及操作簡單、方便快速，且價格低廉，安全穩(wěn)定，無毒性，無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種牛支原體抗體檢測試劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物檢測試劑，以及這種檢測試劑的制備方法，確切講本發(fā)明涉 及一種牛支原體抗體檢測試劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛支原體是感染牛的一種重要的致病性病原體，1961年Hale在美國首次從患乳 腺炎的牛乳中分離到該病原，1976年首次報道與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。目前已證實(shí)牛支 原體除導(dǎo)致牛肺炎、乳腺炎外，還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不 孕等多種疾病。自2008年以來，我國部分地區(qū)新從外地引進(jìn)肉牛暴發(fā)了以壞死性肺炎為 主要特征的"傳染性牛支原體肺炎"疫情，發(fā)病率為50%-100%，病死率高達(dá)10%-50%，給 我國養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此后相繼在我國甘肅、寧夏、青海、貴州、內(nèi)蒙、湖北、重 慶、山東等省市均有臨床診斷報道，危害嚴(yán)重。但遺憾的是，迄今這些報道大多為根據(jù)臨床 表現(xiàn)和剖檢變化做出的臨診報告，鮮見應(yīng)用準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。因此，本病在我國的實(shí) 際流行情況和準(zhǔn)確的流行病學(xué)信息仍較為匱乏，造成這種現(xiàn)象的原因，主要是我國目前缺 乏有效的牛支原體檢測的相關(guān)技術(shù)。
[0003] 目前存在的檢測牛支原體的技術(shù)有：1.病原分離鑒定，但是牛支原體分離往往受 到臨床應(yīng)用抗生素的影響，分離困難，且分離用培養(yǎng)基營養(yǎng)要求高、分離物鑒定難度大、靈 敏度低，不能作為早期快速診斷牛支原體感染的方法，也難以作為常規(guī)檢測方法普及推 廣（參見Caswell J L, Archambault M. Mycoplasma bovis pneumonia in cai:tle);2. PCR檢測 方法（參見Thomas A, Dizier I, Linden A, et al . Conservation of the uvrC gene sequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis),該檢測方法需要對病料樣品 進(jìn)行較復(fù)雜的處理(研磨、離心、提取DNA等)，檢測方法雖靈敏，但容易因污染和處理不當(dāng)比 較容易出現(xiàn)假陽性，影響判定結(jié)果的準(zhǔn)確性，此外也需要一定的實(shí)驗(yàn)室條件和儀器設(shè)備，以 及較高成本，不適合臨床或基層使用。3.間接ELISA是目前應(yīng)用最主要的血清學(xué)檢測方法， 國際上先后有用全菌蛋白包被和表達(dá)蛋白作為包被抗原的方法（出自Grand D L, Calavas D, Brank M, et al. Serological prevalence of Mycoplasma bovis infection in suckling beef cattle in France),全菌蛋白的方法特異性不足現(xiàn)已很少應(yīng)用，表達(dá)蛋白抗原ELISA 方法目前已有商業(yè)化產(chǎn)品，但其所用哪一個抗原蛋白并未公布。此外，ELISA方法僅適合在 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，操作步驟相對復(fù)雜，需要專業(yè)人員進(jìn)行操作，且需要一定的實(shí)驗(yàn)室條件和 儀器設(shè)備進(jìn)行檢測和分析結(jié)果。我們利用P48重組表達(dá)蛋白包被綿羊紅細(xì)胞建立的間接血 凝檢測方法，操作簡單，無需特定的儀器設(shè)備，2~3小時即可判定結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室檢測和基層臨 床均可應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決當(dāng)前我國缺乏牛支原體抗體檢測技術(shù)難題，提供一種牛 支原體抗體檢測試劑及其制備方法，本發(fā)明同時提供用這種抗原制備間接血凝診斷試劑的 方法。
[0005] 本發(fā)明的牛支原體抗體檢測試劑由混合均勻的1份牛支原體P48重組表達(dá)的融合 蛋白抗原和1份10%醒化-縣酸化綿羊紅細(xì)胞（v/v)構(gòu)成。
[0006] 本發(fā)明的牛支原體抗體檢測試劑制備方法是： a. 將牛支原體p48基因合成到pet32a表達(dá)載體質(zhì)粒中，得到陽性重組質(zhì)粒 Pet32_a(+)_p48 ; b. 用重組質(zhì)粒pet32a⑴-p48轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，挑取已轉(zhuǎn)化到 BL21 (DE3)的單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D值至0. 6左右，然后 吸取一定量的該菌液接種到的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體后過柱 純化，得牛支原體P48融合蛋白； c. 用1份純化的P48融合蛋白抗原與1份10%醒化-縣酸化綿羊紅細(xì)胞（v/v)混合均 勻得到檢測試劑。
[0007] 本發(fā)明的牛支原體抗體檢測試劑中使用的牛支原體P48重組表達(dá)的融合蛋白抗 原基因序列為SEQ ID Ns 1。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括以下方面：（1)本發(fā)明中抗原P48為牛支原體膜蛋白，具有很強(qiáng) 的特異性，能真實(shí)地檢測牛支原體抗體；（2)用蛋白致敏醛化-鞣酸化綿羊紅細(xì)胞，避免了 新鮮綿羊紅細(xì)胞保存時間短、致敏效價低的缺點(diǎn)，易于長時間保存，血凝效價高。（3)操作簡 單、方便快速，無需特殊設(shè)備和儀器，全程在2?3小時內(nèi)完成，適合在基層推廣應(yīng)用，可廣 泛應(yīng)用于牛支原體病流行病學(xué)的調(diào)查研究。（4)結(jié)果的重復(fù)性好，穩(wěn)定，可靠，能夠準(zhǔn)確的檢 測牛支原體的抗體。（5)本發(fā)明的檢測牛支原體抗體的診斷試劑，且價格低廉，安全穩(wěn)定，無 毒性，無環(huán)境污染。（6)由于本發(fā)明中對P48基因進(jìn)行了優(yōu)化改造，使其可在感受態(tài)細(xì)胞中 高效表達(dá)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1誘導(dǎo)溫度37°C，lmmol/LIPTG濃度，重組菌(將陽性重組質(zhì)粒pet32a⑴-p48 轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21 (DE3)的陽性菌命名為重組菌)誘導(dǎo)表達(dá)6h，蛋白表達(dá)的電泳圖，試驗(yàn)中 每孔上樣均7uL，圖中：泳道1為蛋白marker ;泳道2為未誘導(dǎo)表達(dá)菌；泳道3為誘導(dǎo)表達(dá) 菌；泳道4為誘導(dǎo)表達(dá)菌超聲沉淀；泳道5為誘導(dǎo)表達(dá)菌誘導(dǎo)上清。
[0010] 圖2優(yōu)化表達(dá)條件：誘導(dǎo)溫度16°C，0. lmmol/LIPTG濃度，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)16h，蛋 白表達(dá)的電泳圖，試驗(yàn)中每孔上樣量均為7uL，圖中：泳道1.誘導(dǎo)菌超聲沉淀；泳道2.誘導(dǎo) 菌超聲上清；泳道3.誘導(dǎo)表達(dá)菌；泳道4.未誘導(dǎo)表達(dá)菌；泳道5.蛋白maker。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)解說。
[0012] 一、牛支原體P48重組表達(dá)的融合蛋白抗原的制備 a.牛支原體p48基因的合成及重組質(zhì)粒鑒定 對已公開的牛支原體p48基因（Genebank: NC_014760. 1)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，按照密碼子 在大腸桿菌的嗜好進(jìn)行優(yōu)化，同時將在牛支原體該序列中的4個表達(dá)色氨酸的TGA (UGA) 優(yōu)化成TGG (UGG)，因?yàn)樵撁艽a子在大腸桿菌中為終止密碼子，同時在其兩端加上了酶切位 點(diǎn)BamH I和Xho I，經(jīng)優(yōu)化后的基因序列為SEQ ID Ns 1 ; 將優(yōu)化后的p48基因序列交由Invitrogen公司合成到pet32a表達(dá)載體質(zhì)粒中，合成 后，進(jìn)行測序鑒定，酶切鑒定，將鑒定成功后的陽性重組質(zhì)粒命名為Pet32_a (+) -p48。
[0013] b.牛支原體P48融合蛋白的可溶性表達(dá) 1. 1培養(yǎng)基配制 配制含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基2000ml。胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，氯化鈉 200g，加入約1600ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴?N NaOH(約0. 4ml)，調(diào)節(jié)pH值至 7. 0。加入去離子水將培養(yǎng)基定容至2L，高溫高壓滅菌，待培養(yǎng)基放涼后，加入氨芐青霉素， 使其濃度達(dá)l〇〇ug/mL，放入4度保存?zhèn)溆谩?br> [0014] 1.2P48蛋白的表達(dá) 首先，將帶有目的基因的重組質(zhì)粒pet32a (+) -p48轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，挑 取已轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)的單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，放置于37°C搖床 中，220rpm震蕩培養(yǎng)至0D600至0. 6左右，然后吸取一定量的該菌液接種到新的100倍體積 的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，在37°C時220rpm震蕩培養(yǎng)，使用lmmol/L IPTG (IPTG 全稱Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside，中文名為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷） 濃度，誘導(dǎo)表達(dá)6小時后，收集菌體，將菌液6000rpm離心10min，棄上清，用0. 1倍菌液體積 的pH7. 2PBS將菌體重懸，并進(jìn)行冰上超聲破碎30min。然后將超聲處理的液體置于離心機(jī) 中l(wèi)lOOOrpm離心30min，收集上清，沉淀用0. 1倍菌液體積的pH7. 2PBS重懸。同時設(shè)立不 加 IPTG的表達(dá)菌作為對照。將誘導(dǎo)表達(dá)菌、陰性對照菌的上清、沉淀分別取60uL樣品，再 加入20uL4 X SDS上樣buffer，煮沸8-10min，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖1 :(每孔上樣 量均為7uL) 將帶有目的基因的重組質(zhì)粒pet32a(+)-p48轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，挑取已 轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)的單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，放置于37°C搖床中， 220rpm震蕩培養(yǎng)至0D600至0. 6左右，然后吸取一定量的該菌液接種到新的100倍體積的 含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，在16°C，0. lmmol/L IPTG濃度下誘導(dǎo)表達(dá)16h，收集菌體， 6000rpm離心10min，棄上清，用0. 1倍菌液體積的pH7. 2PBS將菌體重懸，并進(jìn)行冰上超聲 破碎30min。然后將超聲處理的液體置于離心機(jī)中l(wèi)lOOOrpm離心30min，收集上清，沉淀用 〇. 1倍菌液體積的pH7. 2PBS重懸。同時設(shè)立不加 IPTG的表達(dá)菌作為對照。將誘導(dǎo)表達(dá)菌、 陰性對照菌的上清、沉淀分別取60uL樣品，再加入20uL4X SDS上樣buffer，煮沸8-10min， 進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖2 :(每孔上樣量均為7uL) 圖1的泳道2、圖2的泳道4為不同誘導(dǎo)溫度時不加 IPTG的對照組，由圖可見，無 P48 蛋白的表達(dá)。由圖2泳道3來看，在16°C、0. lmmol/LIPTG濃度、低溫誘導(dǎo)表達(dá)16h時，P48 蛋白的表達(dá)量約占全菌蛋白的50%，而圖1泳道3則顯示在37°C、lmmol/LIPTG濃度、6小 時誘導(dǎo)表達(dá)，P48蛋白的表達(dá)量僅約占全菌蛋白的5% ;由超聲破碎后蛋白電泳來看，即由圖 1的泳道4、5以及圖2的泳道1、2,可得結(jié)論在16°C、0. lmmol/LIPTG濃度、16h誘導(dǎo)表達(dá)， P48基本是以可溶性蛋白表達(dá)，可溶性表達(dá)量約占全菌可溶性蛋白的70%。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，在 16°C，0. lmmol/LIPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)16h時可以獲得可溶性P48蛋白高效表達(dá)。
[0015] 因此，本發(fā)明具體實(shí)施時選用優(yōu)化后的條件，即16°C，0. lmmol/LIPTG濃度誘導(dǎo)表 達(dá)16h以獲得大量的可溶性P48蛋白。將帶有目的基因的重組質(zhì)粒pet32a(+)-p48轉(zhuǎn)化到 感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，挑取已轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)的單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液 體培養(yǎng)基中，放置于37°C搖床中，220rpm震蕩培養(yǎng)至0D600至0. 6左右，然后吸取10ml的該 菌液接種到新的1000ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，在16°C，0. lmmol/L IPTG濃度下誘 導(dǎo)表達(dá)16h，收集菌體，6000rpm離心lOmin，棄上清，用100ml體積的pH7. 2PBS將菌體重懸， 并進(jìn)行冰上超聲破碎30min。然后將超聲處理的液體置于離心機(jī)中l(wèi)lOOOrpm離心30min， 棄去沉淀，收集上清液l〇〇ml。
[0016] c.牛支原體P48融合蛋白的純化 柱子的制備：固定柱子，將顛倒混勻過的樹脂懸濁液吸取5ml加入到固定好的空柱 子里，待樹脂完全固定以后，取下塞子，流完里面的保存液以后向柱子中加入50ml的LE buffer平衡柱子； 將16°C誘導(dǎo)表達(dá)菌進(jìn)行超聲處理后制備好的100ml上清液用0. 45nm的濾膜過濾，將該 樣品加入到已經(jīng)平衡的柱子內(nèi)； 用100ml的LE buffer沖洗柱子直到280nm處的吸光度為0 ; 用100ml (20倍體積）的wash buffer沖洗柱子； 用20ml的Elution buffer洗脫與樹脂結(jié)合的蛋白，收集洗脫液，測其蛋白濃度為 1. 56ug/ul，保存?zhèn)溆谩?br> [0017] 二、本發(fā)明檢測試劑的制備 本發(fā)明的檢測試劑是用上述制備的牛支原體P48融合蛋白抗原和致敏醛化-鞣酸化 綿羊紅細(xì)胞制備，經(jīng)相關(guān)的試驗(yàn)，本發(fā)明試劑中的抗原最佳致敏濃度為10 μ g/ml?20 μ g/ ml，其具體制備步驟如下： 取1份純化的P48融合蛋白抗原與1份10%醛化-鞣酸化綿羊紅細(xì)胞混合均勻，在 37°C水浴中作用50 min，其間不斷攪拌；離心沉積紅細(xì)胞，用含1%健康兔血清的0. 15mol/L pH7. 2 PBS洗滌三次后，配成1%致敏紅細(xì)胞懸液，即為間接血凝診斷抗原，與配套試劑組裝 成檢測牛支原體抗體的間接血凝診斷試劑，包括：抗原1瓶，l〇ml/瓶；標(biāo)準(zhǔn)陽性血清1瓶， lml/瓶；標(biāo)準(zhǔn)陰性血清1瓶，lml/瓶；稀釋液3瓶，10ml/瓶。
[0018] 檢測時，先在96孔"V"型聚苯乙烯滴定板8行12列上每孔滴加稀釋液25μ L ; 然后在1~9列每列第1孔分別加入被檢血清25 μ L，每份被檢血清用1列，第10、11列第1 孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各25μ L，第12列為空白對照。用排槍將1?11 列第1孔充分混勻后吸取25 μ L加入第2孔，依次連續(xù)稀釋至第8孔，混勻后從第8孔棄去 25 μ L ;最后每孔滴加1%致敏紅細(xì)胞懸液(診斷抗原）25 μ L，加樣完畢將V型滴定板放在微 量震蕩器上震蕩lmin，蓋上玻璃板，置37°C溫箱2h，判定結(jié)果。
[0019] 判定標(biāo)準(zhǔn)：紅細(xì)胞全部凝集（+ + + +) ;75%紅細(xì)胞凝集（+ + +) ;50%紅 細(xì)胞凝集（+ +) ;25%紅細(xì)胞凝集（+);無凝集（一）。陽性血清對照1?8孔應(yīng)呈現(xiàn) " + + + +?+ + "凝集；陰性血清和空白對照應(yīng)呈現(xiàn)"一"。在對照孔合格的前提下，觀察待 檢血清各孔。以呈現(xiàn)" + + "凝集的最大稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價。效價: 8 ( + + )判為陽性，效價: 4 ( + + )判為陰性。效價介于兩者之間判為可疑，需重新測 定，仍為可疑判為陽性。
[0020] 三、檢測與試驗(yàn) 1.特異性試驗(yàn) 用本發(fā)明中的牛支原體抗體檢測間接血凝診斷試劑，對健康牛血清、牛生殖道支原體 陽性血清、豬肺炎支原體陽性血清、牛肺疫陽性血清、無乳支原體陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果 均為陰性(參見表1 )，說明該抗原具有極高的特異性。 表1牛支ilftfi]接血S診試茍?zhí)乇仔栽囼?yàn)結(jié)果·

【權(quán)利要求】
1. 一種由混合均勻的1份牛支原體P48融合蛋白抗原和1份10%醛化-鞣酸化綿羊紅 細(xì)胞（v/v)構(gòu)成。
2. 權(quán)利要求1所述的牛支原體抗體檢測試劑制備方法，其特征在于： a. 將牛支原體p48基因合成到pet32a表達(dá)載體質(zhì)粒中，得到陽性重組質(zhì)粒 Pet32_a(+)_p48 ; b. 用重組質(zhì)粒pet32a⑴-p48轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)，挑取已轉(zhuǎn)化到 BL21 (DE3)的單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值至0. 6左右，然后 吸取一定量的該菌液接種到的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體后過柱 純化，得牛支原體P48融合蛋白； c. 用1份純化的P48融合蛋白抗原與1份10%醒化-縣酸化綿羊紅細(xì)胞（v/v)混合均 勻得到檢測試劑。
3. 權(quán)利要求1所述的牛支原體抗體檢測試劑中使用的牛支原體P48重組表達(dá)的融合 蛋白抗原基因序列為SEQ ID Ns 1。
【文檔編號】C12N15/31GK104062439SQ201410327648
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】儲岳峰, 逯忠新, 簡瑩娜, 趙萍, 賀英, 陳勝利, 劉永生 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所