一種利用重組大腸桿菌合成d-苯基乳酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組乳酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，是在序列的第52位由酪氨酸突變成丙氨酸、纈氨酸或亮氨酸中的任意一種。本發(fā)明還涉及含有上述的重組乳酸脫氫酶基因的重組大腸桿菌以及利用重組大腸桿菌合成D-苯基乳酸的方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)D-LDH的底物識(shí)別位點(diǎn)處的酪氨酸通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)替換成較小的疏水氨基酸殘基-纈氨酸，提高D-LDH對(duì)底物苯丙酮酸的親和力及催化效率，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主后，苯乳酸產(chǎn)量相比未突變菌株均有顯著提高，經(jīng)6h全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，苯乳酸產(chǎn)量從18g/L提高到24.6g/L。
【專利說(shuō)明】一種利用重組大腸桿菌合成D-苯基乳酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種利用重組大腸桿菌合成D-苯基乳酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 苯基乳酸（phenyllactic acid, PLA)，也稱3-苯基乳酸或2-輕基-3-苯基丙酸， 因其對(duì)細(xì)菌，真菌和霉菌都有很好的抑制效果，可以作為理想的食品防腐劑而獲得廣泛的 關(guān)注。目前，苯乳酸主要由化學(xué)合成或微生物轉(zhuǎn)化兩種方式獲得，化學(xué)合成因其生產(chǎn)條件要 求高，反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，副產(chǎn)物且工業(yè)染污嚴(yán)重等缺點(diǎn)使得微生物轉(zhuǎn)化合成有價(jià)值的化合物 更有利于建設(shè)綠色可持續(xù)發(fā)展經(jīng)濟(jì)。用于苯乳酸研究的微生物主要有白地霉、丙酸菌、乳酸 菌、芽孢桿菌等，目前報(bào)道主要集中在利用這些野生菌轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成苯乳酸，其產(chǎn)量從 數(shù)毫摩爾到約200mM。自然界的微生物胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯乳酸的乳酸脫氫酶含量 是受到基因調(diào)控的，低水平的酶含量和活力限制了微生物的催化活力。乳酸脫氫酶催化苯 丙酮酸轉(zhuǎn)化生成苯乳酸的化學(xué)反應(yīng)式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種重組乳酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，該核苷酸序列編碼的 氨基酸序列的第52位由酪氨酸突變成丙氨酸、纈氨酸或亮氨酸中的任意一種。
2. 含有權(quán)利要求1所述的重組乳酸脫氫酶基因的重組大腸桿菌。
3. -種利用權(quán)利要求2所述的重組大腸桿菌合成D-苯基乳酸的方法，其特征在于：該 方法包括以下步驟： (1) 乳酸脫氫酶基因的獲取； (2) 乳酸脫氫酶基因構(gòu)建入表達(dá)載體pET-28a得到重組質(zhì)粒pET-28a-ldh ; (3) 以重組質(zhì)粒pET-28a-ldh為模板，P1/P2、P3/P4、P5/P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 將乳酸脫氫酶的底物識(shí)別位點(diǎn)處的酪氨酸突變成丙氨酸、纈氨酸或亮氨酸，獲得帶有 突變位點(diǎn)的目的片段，并將目的片段構(gòu)建入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒pET-28a-ldhY52A、 pET-28a-ldhY52V、pET-28a-ldhY52L，P1/P2、P3/P4、P5/P6 引物序列如下： PI.5-CCTTTTGTTGAACTACATCGGCACCGTCGAAGC (SEQ ID N0:3) P2 ：5-TGCCGATGTAGTTCAACAAAAGGACTATACTGC (SEQ ID NO:4) P3 ：5-CCTTTTGTTGAAGTACATCGGCACCGTCGAAGC (SEQ ID NO:5) P4 ：5-TGCCGATGTACTTCAACAAAAGGACTATACTGC (SEQ ID NO:6) P5 ：5-CCTTTTGTTGAGCTACATCGGCACCGTCGAAGC (SEQ ID NO:7) P6 ：5-TGCCGATGTAGCTCAACAAAAGGACTATACTGC (SEQ ID NO:8) (4) 重組質(zhì)粒pET-28a-ldhY52V轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； (5) 以苯丙酮酸為反應(yīng)底物，重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生苯基乳酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求書3所述的方法，其特征在于：步驟（5)中起始底物濃度為9g/L，重組 大腸桿菌干重為20 g/L，pH為7. 0,反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為6h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求書4所述的方法，其特征在于：在反應(yīng)的前2小時(shí)，每20 min添加一 次底物，每次添加〇. 4 g。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104099350SQ201410327630
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】朱益波, 王立梅, 齊斌, 胡發(fā)根, 朱穎越, 朱義榮 申請(qǐng)人:常熟理工學(xué)院