專(zhuān)利名稱(chēng)：使用含有病毒和細(xì)胞結(jié)合區(qū)域的分子增強(qiáng)病毒介導(dǎo)的dna轉(zhuǎn)移的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1996年9月30日，申請(qǐng)?zhí)枮?6198553.4的、發(fā)明名稱(chēng)和本發(fā)明相同的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般地說(shuō)是涉及提高病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞效率的方法，更具體地說(shuō)是涉及利用含有一個(gè)病毒結(jié)合區(qū)域和一個(gè)細(xì)胞結(jié)合區(qū)域的分子如多肽來(lái)增強(qiáng)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：
對(duì)于許多人類(lèi)疾病分子基礎(chǔ)理解的進(jìn)展和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的進(jìn)步，導(dǎo)致了最近發(fā)展針對(duì)嚴(yán)重遺傳疾病的體細(xì)胞基因治療方案的努力。目前，有希望用于人基因治療的候選疾病包括那些有一種酶或其它蛋白損傷或缺失而酶或蛋白的水平又不需要精確調(diào)節(jié)的疾病，特別是那些是組成調(diào)節(jié)的疾病以及損傷見(jiàn)于病人骨髓中的疾病。
例如，基因治療的一個(gè)候選疾病是腺苷脫氨酶(ADA)缺陷，它會(huì)導(dǎo)致惡性復(fù)合免疫缺陷癥(SCID)。在ADA缺陷病人的骨髓細(xì)胞中酶很少或檢測(cè)不到。但是，ADA缺陷已用匹配骨髓移植得到了治愈。ADA正常細(xì)胞對(duì)ADA缺陷細(xì)胞有選擇優(yōu)勢(shì)，一般能使病人的骨髓種群恢復(fù)。
骨髓細(xì)胞是體細(xì)胞基因治療的很好目標(biāo)，因?yàn)楣撬杞M織易于在體外操作并含有種群恢復(fù)細(xì)胞。另外，人臍帶血也已被證明含有大量的初級(jí)祖細(xì)胞?；虺晒Φ剞D(zhuǎn)移進(jìn)造血干細(xì)胞(長(zhǎng)期種群恢復(fù)細(xì)胞)可導(dǎo)致在這些細(xì)胞的后代中所顯示的多種疾病的終身治愈。
基因轉(zhuǎn)移進(jìn)種群恢復(fù)干細(xì)胞和在其中的基因長(zhǎng)期表達(dá)已由許多研究者在鼠模型中獲得了成功。但是，在大型動(dòng)物如狗和靈長(zhǎng)動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，只獲得有限的成功，這很大程度上是因?yàn)槌跫?jí)造血干細(xì)胞感染的低效率。目前的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在用于人體方案時(shí)由于幾個(gè)因素其局限性被進(jìn)一步復(fù)雜化，這些因素包括存在于成人骨髓(ABM)中的干細(xì)胞的低數(shù)目、缺乏純化這些細(xì)胞的合適方法和這種初級(jí)細(xì)胞在細(xì)胞循環(huán)中的低份額。
在使用骨髓細(xì)胞的鼠和大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩組中，人們已經(jīng)注意到最成功的方案使用靶細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系的協(xié)同培養(yǎng)。而且，多數(shù)FDA批準(zhǔn)的人體基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)靠重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)基因治療是理想的，因?yàn)樗鼈兡軐⑼庠碊NA有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)并精確而穩(wěn)定地整合到細(xì)胞DNA中。這類(lèi)載體含有用于基因轉(zhuǎn)移的外源DNA，并被進(jìn)一步修飾以去除病毒的病原性。由于這些修飾，病毒生產(chǎn)一般使用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞來(lái)完成。但是，對(duì)于臨床基因治療來(lái)說(shuō)，因?yàn)榭紤]到生物安全性和質(zhì)量控制，更需要的是無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。不幸的是，基因有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)造血細(xì)胞如干細(xì)胞在不與病毒生產(chǎn)細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)時(shí)一般是不可能的。
最近，實(shí)驗(yàn)顯示通過(guò)在感染時(shí)將靶細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞接觸能提高基因轉(zhuǎn)移效率?；|(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境(HM)中的一種主要成分。HM包括巨噬細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和由多種特定的粘附分子組成的復(fù)雜的胞外基質(zhì)(ECM)所形成的有機(jī)網(wǎng)絡(luò)。ECM分子如層粘連蛋白、膠原蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和纖連蛋白為造血細(xì)胞和生長(zhǎng)因子兩者提供錨定位點(diǎn)?；|(zhì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的促進(jìn)作用的機(jī)制還不清楚，但已知有時(shí)當(dāng)造血細(xì)胞與HM的細(xì)胞直接接觸時(shí)，會(huì)發(fā)生造血細(xì)胞的增殖和分化的生理調(diào)節(jié)。
將基因有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)長(zhǎng)期種群恢復(fù)造血干細(xì)胞和其它細(xì)胞仍存在問(wèn)題，目前這阻礙了基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在造血性和其它疾病的治愈治療中的廣泛應(yīng)用。這就迫切需要一種能有效地將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞但卻沒(méi)有過(guò)去方法的危險(xiǎn)性和局限性的方法，本發(fā)明滿足了這些需求。
發(fā)明簡(jiǎn)述 簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的頻率的方法。該方法包括，用復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在存在基本上純的纖連蛋白和/或纖連蛋白片段的條件下感染活的造血細(xì)胞，所用的纖連蛋白或纖連蛋白片段能有效地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率。纖連蛋白和/或纖連蛋白片段可從自然產(chǎn)生的物質(zhì)中獲得，或合成獲得(如通過(guò)重組遺傳工程技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù))，或從自然產(chǎn)生物質(zhì)和合成物質(zhì)的組合中獲得。另外，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明中使用的纖連蛋白多肽或多肽組可包括自然產(chǎn)生的纖連蛋白氨基酸序列的突變，但按照本發(fā)明這種突變應(yīng)提供具有完成增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的粘附特性的功能多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供生產(chǎn)已被轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞的方法，包括用攜帶外源DNA的復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒在存在固定的纖連蛋白、固定的纖連蛋白片段或它們的固定的混合物的條件下感染活的造血細(xì)胞，其中所用固定物的量足以有效地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的頻率。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供改進(jìn)的細(xì)胞移植方法。該方法包括以下步驟從動(dòng)物供體獲得活的造血細(xì)胞；用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染造血細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生被轉(zhuǎn)導(dǎo)的活的造血細(xì)胞，感染在存在固定形式的并且能有效提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的纖連蛋白和/或其片段時(shí)進(jìn)行；將轉(zhuǎn)導(dǎo)的活造血細(xì)胞移植物引入動(dòng)物受體。在一種優(yōu)選模式中感染細(xì)胞可被導(dǎo)入供體自身。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供適用于細(xì)胞移植方案的已被轉(zhuǎn)導(dǎo)的臍帶血細(xì)胞的獲得方法。該方法包括用復(fù)制缺陷型重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在存在有效量的固定的纖連蛋白和/或纖連蛋白片段的條件下感染來(lái)自臍帶血的造血細(xì)胞，纖連蛋白和纖連蛋白片段用來(lái)提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的頻率。本發(fā)明還包括用此方法可獲得的來(lái)自臍帶血的活的已被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群體，以及細(xì)胞移植方法，該方法包括將被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群體用作細(xì)胞移植物導(dǎo)入動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的上述實(shí)施方案更具體的方面，所用的纖連蛋白或纖連蛋白片段應(yīng)含有提供纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的第一氨基酸序列，和提供纖連蛋白CS-1區(qū)域的細(xì)胞結(jié)合活性的第二氨基酸序列。同時(shí)使用這兩個(gè)纖連蛋白的結(jié)合區(qū)域已被證明能夠非常明顯地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞的效率。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供生產(chǎn)一種構(gòu)建體的方法，該構(gòu)建體用于提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)預(yù)先確定的靶細(xì)胞的效率。該方法包括將一個(gè)能與所說(shuō)靶細(xì)胞結(jié)合的配體同含有提供纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的氨基酸序列的多肽共價(jià)偶聯(lián)的步驟。本發(fā)明還包括涉及使用這些構(gòu)建體來(lái)提高逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)預(yù)先確定的靶細(xì)胞的頻率和將其用于利用被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的移植方案的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供使一定量的病毒定位的方法，包括在存在有效量的固定纖連蛋白或含有纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的病毒結(jié)合活性的纖連蛋白片段時(shí)，將含有病毒培養(yǎng)基溫育來(lái)使一定量的病毒定位。
本發(fā)明的另外的優(yōu)選實(shí)施方案一般提供含有基本上純的和/或固定的纖連蛋白或其片段的已被轉(zhuǎn)導(dǎo)的活造血細(xì)胞和其它細(xì)胞培養(yǎng)物，以及用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的試劑盒，見(jiàn)下文的進(jìn)一步介紹。
本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案提供獲得已被逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的活細(xì)胞群體的方法，包括在存在有效量的固定物質(zhì)如多肽時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞，其中固定物質(zhì)包括 與細(xì)胞結(jié)合的配體和 與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的配體，以此將逆轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)胞協(xié)同定位并提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。我們更奇怪地發(fā)現(xiàn)這種過(guò)程在缺少或至少基本上缺少溴化己二甲銨(也稱(chēng)為1，5-二甲基-二氨雜十一亞甲基多N-甲溴化物)時(shí)可以更好地進(jìn)行，溴化己二甲銨在此以前是為了提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率而用于基因轉(zhuǎn)移程序。但是，奇怪的是，在本發(fā)明的協(xié)同定位介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中溴化己二甲銨的存在被發(fā)現(xiàn)降低而不是提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，本發(fā)明更優(yōu)選的方法是在缺少溴化己二甲銨或其它能在不含協(xié)同定位物質(zhì)的相似過(guò)程如相應(yīng)協(xié)同培養(yǎng)過(guò)程中提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的試劑時(shí)進(jìn)行。所產(chǎn)生的改良的細(xì)胞群體和細(xì)胞移植方法也是本發(fā)明的一個(gè)部分。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的活細(xì)胞群體的方法，包括在存在包含與細(xì)胞結(jié)合的氨基酸序列和來(lái)自膠原蛋白V或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的氨基酸序列的多肽時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的方法，包括在存在一種含有與T細(xì)胞結(jié)合的配體和與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的配體的物質(zhì)時(shí)，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞，以此來(lái)使逆轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)胞協(xié)同定位并提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。用于此方法的物質(zhì)的優(yōu)選形式是含有與T細(xì)胞結(jié)合的第一氨基酸序列和與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的第二氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供使一種逆轉(zhuǎn)錄病毒定位的方法，包括將逆轉(zhuǎn)錄病毒與有效量的含有來(lái)自膠原蛋白V或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的分離多肽接觸。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞的有效逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供無(wú)需協(xié)同培養(yǎng)的使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因轉(zhuǎn)移方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于自體和/或異體細(xì)胞移植的改進(jìn)方法和細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明的這些和其它目的、優(yōu)點(diǎn)和特征對(duì)于熟練的技術(shù)人員可以很容易地從下面的介紹中看出。
附圖簡(jiǎn)述

圖1提供了纖連蛋白分子包括胰凝乳蛋白酶樣片段的圖形描述。
圖2顯示了在存在纖連蛋白片段的情況下使用TKNEO載體感染人定向祖細(xì)胞的效率，見(jiàn)下文實(shí)施例1中的進(jìn)一步介紹。
圖3比較了不同的人定向造血祖細(xì)胞在存在纖連蛋白或其片段的情況下使用TKNEO載體的感染效率，見(jiàn)下文實(shí)施例1中的進(jìn)一步介紹。
圖4比較了使用按(i)協(xié)同培養(yǎng)方法(條帶2-4)、(ii)存在固定的纖連蛋白片段時(shí)的上清液感染(條帶5-7)，和在BSA上的上清液感染(條帶8-10)轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細(xì)胞移植的小鼠中hADA的存在，見(jiàn)下文實(shí)施例7中的進(jìn)一步介紹。hADA的對(duì)照顯示于條帶1和12，鼠hADA的對(duì)照顯示于條帶11。
圖5證明了逆轉(zhuǎn)錄病毒與纖連蛋白片段結(jié)合，見(jiàn)下文實(shí)施例8中的進(jìn)一步介紹。
圖6證明了逆轉(zhuǎn)錄病毒與纖連蛋白片段的結(jié)合是劑量依賴的，見(jiàn)下文實(shí)施例8中的進(jìn)一步介紹。
圖7提供了描述下文實(shí)施例9-11中所用的不同重組纖連蛋白片段的圖解。
圖8顯示了逆轉(zhuǎn)錄病毒與不同的纖連蛋白片段包括幾種重組片段結(jié)合，見(jiàn)下文實(shí)施例9的介紹。
圖9證明肝素阻斷逆轉(zhuǎn)錄病毒與纖連蛋白片段結(jié)合，見(jiàn)下文實(shí)施例9中的介紹。
圖10顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒在存在不同纖連蛋白片段時(shí)感染鼠造血細(xì)胞的效率，見(jiàn)下文實(shí)施例10中的進(jìn)一步介紹。
圖11和12比較了使用按(i)協(xié)同培養(yǎng)方法、(ii)在不同的纖連蛋白片段上的上清液感染、(iii)在BSA上的上清液感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細(xì)胞移植的小鼠中hADA的存在，見(jiàn)下文實(shí)施例11中的進(jìn)一步介紹。
圖13顯示了纖連蛋白α鏈的結(jié)構(gòu)及其與實(shí)施例中所用的重組片段的關(guān)系。標(biāo)明了纖連蛋白的I、II和III型重復(fù)，III型重復(fù)的編號(hào)從1到14。三個(gè)細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)記為，CELL為細(xì)胞結(jié)合區(qū)域(CBD)，HEPARIN為肝素結(jié)合區(qū)域(HBD)，CS1為VLA-4結(jié)合位點(diǎn)CS1，CS1結(jié)合位點(diǎn)由可變剪接IIICS區(qū)域的前25個(gè)氨基酸形成。
圖14顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒在存在不同纖連蛋白片段時(shí)感染NIH/3T3細(xì)胞的效率，見(jiàn)下文實(shí)施例12中的進(jìn)一步介紹。
圖15顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒在存在不同纖連蛋白片段時(shí)感染非粘附性的HL60細(xì)胞的效率，見(jiàn)下文實(shí)施例12中的進(jìn)一步介紹。
圖16顯示了高和低分子量肝素對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒與纖連蛋白結(jié)合的影響。
圖17顯示了逆轉(zhuǎn)錄病毒在存在重組纖連蛋白片段時(shí)感染CD34+細(xì)胞群體中不同類(lèi)型祖細(xì)胞的效率，見(jiàn)下文實(shí)施例13中的介紹。
圖18顯示了逆轉(zhuǎn)錄病毒在存在重組纖連蛋白片段時(shí)感染c-KIT+細(xì)胞群體中HPP-CFC細(xì)胞的效率，見(jiàn)下文實(shí)施例14中的介紹。
圖19證明逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH/3T3細(xì)胞的效率隨著溴化己二甲銨濃度的增加而降低，見(jiàn)下文實(shí)施例15中的討論。
圖20證明逆轉(zhuǎn)錄病毒感染克隆形成骨髓細(xì)胞的效率隨著溴化己二甲銨濃度的增加而降低，見(jiàn)下文實(shí)施例15的討論。
圖21顯示了證明T細(xì)胞表達(dá)纖連蛋白受體的流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果。
圖22顯示了證明人T細(xì)胞預(yù)刺激的流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果。
圖23顯示了用ADA同工酶試驗(yàn)分析基因轉(zhuǎn)移進(jìn)人T細(xì)胞效率的結(jié)果。
圖24提供了描述用于感染方案的多肽的圖解，進(jìn)一步介紹見(jiàn)實(shí)施例16。
圖25是一個(gè)顯示在存在圖24中介紹的肽C-FGF、C-COL和bFGF時(shí)NIH/3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的統(tǒng)計(jì)圖。
圖26顯示在存在圖24中介紹的肽時(shí)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移進(jìn)HEL細(xì)胞的效率，它是通過(guò)流式細(xì)胞分析進(jìn)行分析的。
圖27是一個(gè)顯示在存在圖24中介紹的多肽時(shí)CD34+骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的統(tǒng)計(jì)圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明 為了促進(jìn)對(duì)本發(fā)明原則的理解，現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的某些實(shí)施方案進(jìn)行介紹，特定的用語(yǔ)所指均相同。但是應(yīng)當(dāng)理解，這并不意味著對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制，本文所述的這些改變、進(jìn)一步調(diào)整和本發(fā)明原則的這些應(yīng)用被認(rèn)為對(duì)本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)的。
如上所述，本發(fā)明提供提高病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)活細(xì)胞效率的方法。本發(fā)明還提供利用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因有效轉(zhuǎn)移進(jìn)活細(xì)胞的方法、獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法、以及獲得自體和其它細(xì)胞移植的方法和材料。
本發(fā)明的一個(gè)特征是發(fā)現(xiàn)纖連蛋白(FN)和含有FN的CS-1細(xì)胞粘附區(qū)域的纖連蛋白片段能明顯提高逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)帶有纖連蛋白受體并因此表現(xiàn)出纖連蛋白或其片段結(jié)合能力的細(xì)胞，例如定向祖細(xì)胞、初級(jí)造血干細(xì)胞等造血細(xì)胞或長(zhǎng)期培養(yǎng)的原始細(xì)胞(LTC-IC)。其優(yōu)點(diǎn)在于，這種效率的提高使與病毒生產(chǎn)細(xì)胞的協(xié)同培養(yǎng)變得沒(méi)有必要。本發(fā)明的其它特征基于以下發(fā)現(xiàn)，纖連蛋白的病毒結(jié)合區(qū)域位于肝素II結(jié)合區(qū)域內(nèi)。這個(gè)病毒結(jié)合區(qū)域在許多應(yīng)用中可用來(lái)使病毒顆粒定位，包括如在多種用來(lái)將病毒傳遞進(jìn)靶細(xì)胞的構(gòu)建體中。
根據(jù)本發(fā)明的特定優(yōu)選方面的重組病毒載體含有外源DNA，并且是非病原性的，即復(fù)制缺陷型。這些載體能有效地將外源DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)并精確而穩(wěn)定地整合于宿主細(xì)胞如動(dòng)物細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞DNA中。例如，在本發(fā)明中，含有來(lái)自目的基因編碼序列的連續(xù)堿基的核苷酸序列可以整合到一個(gè)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，并置于一個(gè)適于驅(qū)動(dòng)該基因的啟動(dòng)子控制之下，典型的啟動(dòng)子為外源啟動(dòng)子。在這點(diǎn)上，外源DNA可以含有自然或人工生產(chǎn)的DNA，并可來(lái)自由不同來(lái)源衍生的部分，這些部分可以是自然產(chǎn)生的或人工合成的分子，并且這些部分已經(jīng)通過(guò)連接或其它本領(lǐng)域熟知的方法結(jié)合在一起。
整合在病毒中的外源DNA可以是任何想用來(lái)導(dǎo)入細(xì)胞的DNA。例如，外源DNA可以編碼一種蛋白質(zhì)，如ADA，它與一種眾所周知的失調(diào)有關(guān)；或編碼一種反義RNA、核酶或假引物(見(jiàn)例如1990年11月15日公開(kāi)的WO90/13641)；編碼一種胞內(nèi)抗體(見(jiàn)例如1994年2月3日公開(kāi)的WO94/02610)；編碼一種生長(zhǎng)因子等等。
如上所述，導(dǎo)入的核酸序列被置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下，因此一般在啟動(dòng)子的下游。換句話說(shuō)，啟動(dòng)子序列一般在編碼序列的上游(即在5’端)。同樣，眾所周知可以有或沒(méi)有與啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始密碼子共同起作用的用來(lái)成功轉(zhuǎn)錄外源編碼序列的其它調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子序列)。短語(yǔ)“置于…的控制之下”是指這種其它元件的存在是成功轉(zhuǎn)錄導(dǎo)入基因所必需的。重組DNA還優(yōu)選在所導(dǎo)入的編碼序列下游包含一個(gè)終止序列。
可以使用含有能提供選擇性標(biāo)記或其它選擇優(yōu)勢(shì)的外源DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。例如，載體可以含有一個(gè)或多個(gè)能提供對(duì)不同的選擇試劑包括抗生素如新霉素具有抗性的外源基因。可以在本發(fā)明中使用的代表性的載體包括如N2/ZipTKNEO載體(TKNEO)(滴度在NIH/3T3細(xì)胞上為1×105 G418r cfu/ml)、ZipPGK-hADA載體和ZipPGK-mADA載體，均如Moritz等以前的報(bào)道(1993)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》178卷，529頁(yè)。在TKNEO載體中，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶序列通過(guò)單純皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子以有義方向表達(dá)(相對(duì)于5’長(zhǎng)末端重復(fù)-LTR)。此載體含有一個(gè)提供新霉素抗性的選擇性標(biāo)記基因以便于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的鑒定。在ZipPGK-hADA載體中，人ADA(“hADA”)c DNA通過(guò)人磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子以相對(duì)于5’LTR的有義方向表達(dá)。它僅含有一個(gè)可表達(dá)的基因序列并缺少顯性選擇標(biāo)記。ZipPGK-mADA(PGK-mADA)載體除用鼠ADA(“mADA”)DNA代替人ADAcDNA外與ZipPGK-hADA相同。這些載體及其它病毒載體以及它們的生產(chǎn)技術(shù)是眾所周知的，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以根據(jù)在此公開(kāi)的內(nèi)容很好地在本發(fā)明中提供和使用它們。
本發(fā)明中所使用的病毒載體顯示能夠與纖連蛋白包括人纖連蛋白的肝素II結(jié)合區(qū)域的 氨基酸序列結(jié)合。如下文所討論的，雖然本發(fā)明不為任何理論所限制，但據(jù)信通過(guò)病毒與細(xì)胞與各自的功能區(qū)域結(jié)合的病毒與靶細(xì)胞的協(xié)同定位有利于增強(qiáng)病毒對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在這點(diǎn)上，一種病毒與肝素II結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列結(jié)合的能力以及因此在本發(fā)明中的有效作用的能力可以用傳統(tǒng)的方案如下文實(shí)施例8和9中所介紹的方案方便地進(jìn)行確定。一般說(shuō)來(lái)，這些實(shí)驗(yàn)確定病毒顆粒與含有肝素II結(jié)合區(qū)域的固定多肽結(jié)合(以此抵抗固定多肽基質(zhì)洗滌)的程度。簡(jiǎn)而言之，例如，可以將含有病毒的上清液在含有固定的包含纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的多肽的小孔中溫育。然后用生理鹽水緩沖液充分洗滌小孔，然后將病毒的靶細(xì)胞在小孔中溫育來(lái)確定孔中保留的感染活性的水平。評(píng)價(jià)相對(duì)于原來(lái)病毒上清液的感染活性或滴度的降低，并與相同操作的對(duì)照(例如使用BSA包被的小孔)進(jìn)行比較。與對(duì)照孔相比含有肝素II區(qū)域的孔中保留的明顯較高的滴度表明試驗(yàn)病毒適用于本發(fā)明的范圍。為了使這種篩選方案更方便，病毒載體可以如上文所討論的，含有一個(gè)選擇性標(biāo)記基因。
本發(fā)明中所用的纖連蛋白片段可以是自然來(lái)源的或人工合成的，并可以由自然來(lái)源的物質(zhì)中以基本的純度制備，例如按照以前Ruoslahti等(1981)《生物與化學(xué)雜志》256卷，7277頁(yè)；Patel和Lodish(1986)《細(xì)胞生物學(xué)雜志》102卷，449頁(yè)；和Bernardi等(1987)《細(xì)胞生物學(xué)雜志》105卷，489頁(yè)的介紹。在這點(diǎn)上，在這里所說(shuō)的基本上純凈的纖連蛋白或纖連蛋白片段的意思是它們基本上不含在自然條件下與纖連蛋白共存的其它蛋白。本發(fā)明所使用的基本上純凈的纖連蛋白或纖連蛋白片段也可以是重組生產(chǎn)的，例如按照1993年3月30日授權(quán)的、轉(zhuǎn)讓給日本，Kyoto，Takara Shuzo Co.，Ltd.，的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,198,423的一般介紹進(jìn)行生產(chǎn)。具體而言，在此‘423專(zhuān)利中詳細(xì)介紹了在下面實(shí)施例中稱(chēng)為H-271、H-296、CH-271、CH-296和C-CS1的重組片段和獲得它們的方法。在下面實(shí)施例中所用的C274片段按照美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,102,988的介紹獲得。這些片段或能夠用來(lái)按常規(guī)方法獲得它們的片段也可以按照美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,198,423中的介紹通過(guò)培養(yǎng)保藏在Fermentation Research Institute of the Agency of IndustrialScience and Technology，Japan的大腸桿菌來(lái)獲得，這些大腸桿菌為FERM P-10721(H-296)、FERM BP-2799(C-277經(jīng)甲硫氨酸與H-271結(jié)合)、FERM BP-2800(C-277經(jīng)甲硫氨酸與H-296結(jié)合)和FERM BP-2264(H-271)。另外，在這里可用的纖連蛋白片段或獲得這些片段的起始物質(zhì)的有用信息可以在下列文獻(xiàn)中找到Kimizuka等，《生物化學(xué)雜志》110卷，284-291頁(yè)(1991)，它進(jìn)一步報(bào)道了上面提到的重組片段；《EMBO雜志》4卷，1755-1759頁(yè)(1985)，它報(bào)道了人纖連蛋白基因的結(jié)構(gòu)；以及《生物化學(xué)》25卷，4936-4941頁(yè)(1986)，它報(bào)道了人纖連蛋白的肝素II結(jié)合區(qū)域。含有CS-1粘附區(qū)域和肝素II結(jié)合區(qū)域兩者的纖連蛋白片段，諸如在約30或35kd(30/35 FN)中和下面實(shí)施例報(bào)道的多種重組片段中包含的片段，在迄今為止的工作中被發(fā)現(xiàn)能明顯提高基因轉(zhuǎn)移進(jìn)造血細(xì)胞的效率，并且在本發(fā)明中優(yōu)選使用。因而應(yīng)當(dāng)理解，廣義地說(shuō)，本發(fā)明中使用的纖連蛋白相關(guān)的多肽或多個(gè)多肽能提供具有纖連蛋白CS-1細(xì)胞粘附區(qū)域的細(xì)胞結(jié)合活性的氨基酸序列和與病毒結(jié)合的纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列。熟練技術(shù)人員應(yīng)知道所需的細(xì)胞和病毒結(jié)合活性可同時(shí)由這些功能性纖連蛋白區(qū)域的天然氨基酸序列和與天然序列不同但足夠相似到顯示細(xì)胞結(jié)合和病毒結(jié)合活性的氨基酸序列提供。這些相似氨基酸序列應(yīng)顯示與它們相應(yīng)的天然序列基本的序列同源性，并可包含那些氨基酸被刪除、取代和/或修飾但能提供具有所需細(xì)胞結(jié)合或病毒結(jié)合特征的氨基酸序列。
在這點(diǎn)上，相關(guān)的生物技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)展到所說(shuō)的功能區(qū)域可以按常規(guī)方法進(jìn)行氨基酸的刪除、取代、添加或其它修飾的地步。然后所獲得的氨基酸序列可按常規(guī)方法篩選所需的細(xì)胞結(jié)合或病毒結(jié)合活性。例如，纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的突變或修飾形式的病毒結(jié)合活性可按上文的一般性討論和下文實(shí)施例8和9更具體的討論進(jìn)行篩選，使用病毒溫育、洗滌和病毒滴度試驗(yàn)來(lái)確定與對(duì)照相比感染能力的保留。根據(jù)在此提供的指導(dǎo)，這些結(jié)合試驗(yàn)對(duì)于本領(lǐng)域的工作人員應(yīng)是代表性的但卻是常規(guī)的試驗(yàn)。
細(xì)胞與纖連蛋白CS-1細(xì)胞粘附區(qū)域的修飾或突變形式的結(jié)合，或細(xì)胞與其它細(xì)胞結(jié)合性多肽的結(jié)合，也可以用傳統(tǒng)方案進(jìn)行分析。例如，這樣的方案包括《自然》352卷，438-441(1991)介紹的方案。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞結(jié)合性多肽包被于塑料皿中，將待測(cè)細(xì)胞群體覆蓋在基質(zhì)上30分鐘至2小時(shí)。溫育后，回收不與蛋白粘附的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并分析存活性。用胰蛋白酶或細(xì)胞解離緩沖液(如Gibco)也回收與多肽粘附的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并檢測(cè)存活性。在某些情況下，例如使用造血細(xì)胞集落形成細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞再另外繼續(xù)培養(yǎng)12-14天以確定細(xì)胞的集落形成特征。然后計(jì)算粘附細(xì)胞的百分比，并與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照如牛血清白蛋白(BSA)包被的塑料皿進(jìn)行比較。靶細(xì)胞與待測(cè)多肽的大量結(jié)合提示多肽/細(xì)胞組合適用于本發(fā)明，并且多肽可與來(lái)自纖連蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合片段偶聯(lián)來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的一種用來(lái)增強(qiáng)病毒載體感染靶細(xì)胞的構(gòu)建體。
根據(jù)本發(fā)明更具體的方面，用來(lái)增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒結(jié)合多肽應(yīng)包含(i)對(duì)應(yīng)于人纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的Ala1690-Thr1960的第一氨基酸序列，其代表為通式(Seq.I.D.#1) Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln TrpThr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr GlyPro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met ValAla Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala GlnGly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala ThrGlu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp AlaVal Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Sys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr IleThr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala ArgSer Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu AlaThr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile IleLys Tyr Glu Sys Pro Gly Sev Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val ThrGlu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys AsnAsn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr， 或能顯示與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合能力的足夠相似的氨基酸序列； 和(ii)對(duì)應(yīng)于人纖連蛋白IIICS結(jié)合區(qū)域的一個(gè)部分(CS-1細(xì)胞結(jié)合區(qū)域)的第二氨基酸序列；其代表為通式(Seq.I.D.#2) Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu HisGly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr； 或能顯示與造血細(xì)胞如初級(jí)祖細(xì)胞和/或長(zhǎng)期種群恢復(fù)(干)細(xì)胞結(jié)合能力的足夠相似的氨基酸序列； 正如前面提到的，應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的實(shí)踐中這些天然序列的某些修飾和/或突變是可能的，只要所產(chǎn)生的氨基酸序列與天然序列足夠相似，可以顯示與病毒結(jié)合的能力(在肝素II結(jié)合區(qū)域時(shí))和與靶細(xì)胞結(jié)合的能力(在CS-1區(qū)域時(shí))。
例如，含有與肝素結(jié)合并顯示與纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域具有基本的序列同源性的序列的已知多肽包括，例如膠原蛋白V和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。如下面實(shí)施例16具體證明的，含有這些序列與細(xì)胞結(jié)合序列如VLA-4和/或VLA-5結(jié)合位點(diǎn)相連接的多肽，可以用來(lái)增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)與這些細(xì)胞結(jié)合序列結(jié)合的細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種體細(xì)胞基因治療的方法，它包括體外的細(xì)胞治療和隨后將靶細(xì)胞移植進(jìn)宿主，后者也稱(chēng)為用轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞對(duì)宿主進(jìn)行移植。造血細(xì)胞或其它細(xì)胞，例如分離自骨髓或外周血的干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、或其它特征為CD34+和/或C-kit+的細(xì)胞，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方案從人或其它哺乳動(dòng)物來(lái)源收集。例如，造血細(xì)胞可以從人供者的骨髓或外周血或人胎兒臍帶血中收集。收集以后，造血細(xì)胞可用標(biāo)準(zhǔn)方法選擇性地進(jìn)行處理以從它們中富集干細(xì)胞和/或初級(jí)祖細(xì)胞。然后將造血細(xì)胞適當(dāng)溫育，例如在組織培養(yǎng)板上。可任選在此階段，在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染前對(duì)粘附陰性的低密度單核細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激。本領(lǐng)域所熟知的并在此使用的預(yù)刺激指將細(xì)胞在接觸逆轉(zhuǎn)錄病毒前與生長(zhǎng)刺激因子接觸的過(guò)程。這種預(yù)刺激已被證明能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
預(yù)刺激之后，收集細(xì)胞，并按照這里的介紹將其與能提高逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的纖連蛋白或其片段一起溫育。優(yōu)選細(xì)胞與純化的和/或非溶解的如固定的纖連蛋白或纖連蛋白片段一起溫育。然后用重組病毒例如含有一個(gè)用于在細(xì)胞中糾正一個(gè)酶或其它蛋白缺失或異常的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，在存在有效量的能提高病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞頻率的纖連蛋白或纖連蛋白片段的情況下，感染細(xì)胞。然后將所獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞用傳統(tǒng)方法如經(jīng)靜脈導(dǎo)入一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞移植受體，優(yōu)選導(dǎo)入一個(gè)自身供體，但同時(shí)也包括異源移植者，如下面所討論的，后者特別是在移植使用臍帶血細(xì)胞的情況下。
本發(fā)明的方法可用于包括骨髓紊亂等多種疾病的基因標(biāo)記或基因治療方案，骨髓紊亂的疾病包括例如癌癥、白血病、涉及蛋白缺失或異常的紊亂，本發(fā)明的方法還可用于修飾造血細(xì)胞以提高其對(duì)其它治療方案如化療的抵抗能力的治療。因而可以利用本發(fā)明的代表性的紊亂包括ADA缺失，如ADA缺失性SCID，兒科急性骨髓性白血病(AML)，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，和成人AML以及急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于細(xì)胞移植的細(xì)胞獲自人臍帶血。因此，可以收集人臍帶血，富集活的初級(jí)造血祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞，例如通過(guò)獲得一種粘附陰性、低密度、單核的細(xì)胞群體的方法來(lái)富集。然后可以將這一細(xì)胞群體預(yù)刺激，并在存在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及固定的和/或純化的纖連蛋白或纖連蛋白片段的條件下溫育，來(lái)提高載體對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在這點(diǎn)上，我們發(fā)現(xiàn)雖然纖連蛋白并不是臍帶血中ECM的組成成分，并且雖然來(lái)自臍帶血的初級(jí)祖細(xì)胞和干細(xì)胞的特征不同于來(lái)自骨髓的細(xì)胞，但來(lái)自臍帶血的初級(jí)造血細(xì)胞和/或干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)在存在纖連蛋白或纖連蛋白的情況下有很大提高。具體而言，臍帶血干細(xì)胞的特征是CD34+、HLA-DR+，而來(lái)自骨髓的干細(xì)胞的特征是CD34+、HLA-DR-。來(lái)自臍帶血的初級(jí)祖細(xì)胞在存在纖連蛋白或纖連蛋白片段時(shí)能以提高的方式被轉(zhuǎn)導(dǎo)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)使我們能夠使用造血細(xì)胞的方便和高度干細(xì)胞富集的來(lái)源。而且，采用初級(jí)祖細(xì)胞和干細(xì)胞富集的同種異體臍血移植物已對(duì)大量病人進(jìn)行了成功的移植，這些證據(jù)使臍帶血成為造血細(xì)胞的非常優(yōu)選的來(lái)源。見(jiàn)Kohli-Kummer等，《BritHeaematol.》85卷，419-422頁(yè)(1993)；Broxmeyer等，《血細(xì)胞》17卷，313-329頁(yè)(1991)；Gluckman等，《Br.J.Heaematol.》45卷557頁(yè)(1980)；HeidelbergSpringer-Verlag，60-68頁(yè)(1989)；Wagner等，《血液》79卷1874-1881(1992)；以及Wagner等，《血液》82-86a(摘要)。
如果需要，可以對(duì)收集的轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞或其它細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和基因表達(dá)的檢測(cè)。例如，在下面的具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的明顯提高得到了證明，這些實(shí)施例介紹了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)證明在存在纖連蛋白或纖連蛋白的有效片段的條件下逆轉(zhuǎn)錄病毒的高感染和基因轉(zhuǎn)移效率。具體而言，用PGK-hADA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的鼠造血細(xì)胞能表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)移ADA cDNA。相似地，個(gè)別PGK-mADA病毒感染的人祖細(xì)胞集落表達(dá)的鼠ADA的水平高出內(nèi)源人ADA蛋白10倍以上。因此，為了嚴(yán)格地分析基因轉(zhuǎn)移效率，祖細(xì)胞集落僅在轉(zhuǎn)移mADA的表達(dá)等于或大于內(nèi)源人ADA水平時(shí)，才被認(rèn)為是已被轉(zhuǎn)導(dǎo)。來(lái)自TKNEO載體的neo的高水平表達(dá)用G418抗性來(lái)檢測(cè)，如同檢測(cè)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo基因產(chǎn)物)活性的試驗(yàn)。
如上所述，使用本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)在于沒(méi)有在存在逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞下協(xié)同培養(yǎng)的必要。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可以在除了靶造血細(xì)胞或其它細(xì)胞以外基本上沒(méi)有細(xì)胞的情況下進(jìn)行。例如，可以培養(yǎng)含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒的生產(chǎn)細(xì)胞并收集上清液。然后用含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液在存在纖連蛋白和/或纖連蛋白片段的情況下感染造血細(xì)胞，纖連蛋白和其片段優(yōu)選為固定形式，例如包被于進(jìn)行感染的基質(zhì)或其它與感染基質(zhì)接觸的基質(zhì)。在這點(diǎn)上，任何能產(chǎn)生高滴度的不含輔助物的逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)細(xì)胞都可以認(rèn)為適用于本發(fā)明。這些細(xì)胞包括例如包裝細(xì)胞如Psi-2、C2、PA12、PA317和GP+envAM12以及其它本領(lǐng)域熟知的其它包裝細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的其它特征，可以使用與纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域中的氨基酸結(jié)合強(qiáng)的病毒來(lái)構(gòu)建用于在大范圍的細(xì)胞類(lèi)型中進(jìn)行病毒治療的傳遞系統(tǒng)。為此，可將含有來(lái)自纖連蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)域的多肽共價(jià)偶聯(lián)到任何能使構(gòu)建體與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的配體上。這種方法將不再需要像以前一樣為每一種靶細(xì)胞構(gòu)建特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞系(Kasahara，N.，A.M.Dozy，和Y.W.Kan，《科學(xué)》266卷，1373-1376頁(yè)(1994)和Valsesia-Wittmann，S.，A.Drynda，G.Deleage，M.Aumailley，J.M.Heard，0.Danos，G.Verdier，和F.L.Cosset，《病毒學(xué)雜志》68卷，4609-4619頁(yè)(1994))。靶向構(gòu)建物的特異性可以用配體來(lái)提供，這樣的配體包括例如1)細(xì)胞粘附蛋白，2)激素或細(xì)胞因子，3)針對(duì)靶細(xì)胞的單克隆抗體，4)與靶細(xì)胞結(jié)合的碳水化合物(G.Ashwell等，《生物化學(xué)年評(píng)》51卷，531-554頁(yè)(1982))，5)靶細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，或6)與靶細(xì)胞結(jié)合的功能肽。構(gòu)建體基因傳遞的效率可以用包含幾個(gè)肝素II病毒結(jié)合區(qū)域從而增加病毒顆粒傳遞入靶細(xì)胞的量來(lái)提高。例如，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,198,423的介紹，對(duì)應(yīng)于Pro1239-Ser1515的人纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合區(qū)域已顯示與細(xì)胞包括BHK和B16-F10細(xì)胞(Kimizuka等，《生物化學(xué)雜志》110卷，285-291頁(yè)(1991))結(jié)合。此外，肝素II區(qū)域自身已顯示與成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)合。這些多肽序列可與來(lái)自纖連蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)域偶聯(lián)，從而靶向預(yù)先確定的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的細(xì)胞。
造血系統(tǒng)中的應(yīng)用舉例還包括紅細(xì)胞生成素或G-CSF與纖連蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)域偶聯(lián)的構(gòu)建體，這兩種構(gòu)建體分別用來(lái)高度特異地靶向紅細(xì)胞和粒細(xì)胞前體細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)普通應(yīng)用是將一個(gè)或多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)域與一個(gè)特異性或優(yōu)先與惡性細(xì)胞結(jié)合的配體組合。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體外甚至體內(nèi)的乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)可用與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合的物質(zhì)如促黃體生成激素釋放因子衍生物進(jìn)行影響，Emons，G.等，《Hum.Reprod》9卷1364-1379(1994)，雌激素，Tolcher，A.W.，《腫瘤學(xué)》8卷，39-43頁(yè)(1994)，或抗雌激素抗體，Howell，A.等，《柳頁(yè)刀》345卷，29-30頁(yè)(1995)，孕激素或抗孕激素抗體，Klijn.F.G.等，《Hum.Reprod》9卷增刊1，181-189頁(yè)(1994)；Griffiths，K.等《Semin.Oncol.》21卷，672-681頁(yè)(1994)，這些物質(zhì)在本發(fā)明的含有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自纖連蛋白的病毒結(jié)合區(qū)域的構(gòu)建體中作為配體。進(jìn)一步的例子是，使用含有Jodid的構(gòu)建體可以高特異性地靶向甲狀腺(癌)細(xì)胞，而使用含有HDL或其部分的構(gòu)建體可以靶向肝(癌)細(xì)胞。最后，含有單克隆抗體和纖連蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)域的構(gòu)建體可以用來(lái)靶向抗體針對(duì)的任何細(xì)胞和器官。因此大范圍的哺乳動(dòng)物細(xì)胞種類(lèi)可以通過(guò)利用纖連蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合區(qū)域的病毒載體結(jié)合和定位能力而被靶向作用。
相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及能用于增強(qiáng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞的構(gòu)建體的制備。纖連蛋白肝素II結(jié)合區(qū)域的病毒結(jié)合氨基酸序列與靶細(xì)胞結(jié)合的配體偶聯(lián)。如上文所討論的，配體可以是，例如，來(lái)自纖連蛋白或其它蛋白(包括細(xì)胞粘附蛋白，如層粘連蛋白、膠原蛋白、玻連蛋白、骨橋蛋白或血小板反應(yīng)蛋白)的一個(gè)多肽、一種激素、一種代謝產(chǎn)物、一種抗體(包括單克隆抗體)、或其它任何顯示與靶細(xì)胞結(jié)合能力優(yōu)選是特異性的結(jié)合能力的配體。所獲得的完整構(gòu)建體可以固定的形式以與下面實(shí)施例中具體列出的纖連蛋白多肽的類(lèi)似方式進(jìn)行使用。
這種構(gòu)建體和細(xì)胞靶向方法可以按上面的討論用于體外，也可以在考慮多種因素如構(gòu)建體的穩(wěn)定性與特異性和在生理?xiàng)l件下逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的相互作用的情況下，用于體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒定向。特異性也可以通過(guò)修飾傳遞系統(tǒng)來(lái)使構(gòu)建體的傳遞定位于靶細(xì)胞來(lái)予以提高，例如用門(mén)靜脈插入導(dǎo)管來(lái)定向肝細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程涉及病毒與細(xì)胞的協(xié)同定位，它在沒(méi)有或基本上沒(méi)有溴化己二甲銨的情況下進(jìn)行時(shí)更有優(yōu)勢(shì)。溴化己二甲銨(商業(yè)名為Polybrene)是聚陽(yáng)離子物質(zhì)，廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方案，其使用目的是提高逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在協(xié)同定位增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)移的方案如這里介紹的方案中，溴化己二甲銨的存在明顯降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，本發(fā)明的改進(jìn)方法在至少基本上沒(méi)有溴化己二甲銨(即含有不超過(guò)1ug/ml的溴化己二甲銨)的基質(zhì)中進(jìn)行，并更優(yōu)選在沒(méi)有溴化己二甲銨的基質(zhì)中進(jìn)行。這樣的方法提供本發(fā)明的優(yōu)選細(xì)胞組合物，此組合物基本上包含逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的活細(xì)胞群體，在此細(xì)胞群體中基本上沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞和溴化己二甲銨。在這點(diǎn)上，這里所用的基本上轉(zhuǎn)導(dǎo)的活細(xì)胞群體的意思是群體中至少約20％的細(xì)胞已被逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。更優(yōu)選的細(xì)胞群體含有至少約50％的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，最優(yōu)選至少75％的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的優(yōu)選細(xì)胞組合物將包括造血細(xì)胞，并更優(yōu)選包括對(duì)初級(jí)祖細(xì)胞和干細(xì)胞進(jìn)行了富集的造血細(xì)胞群體。一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的優(yōu)越方法因此可以在沒(méi)有聚陽(yáng)離子或其它試劑的情況下進(jìn)行，這些試劑在相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方案(如協(xié)同培養(yǎng))中沒(méi)有用來(lái)協(xié)同定位的纖連蛋白片段或其它物質(zhì)時(shí)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的提高，但在存在用來(lái)協(xié)同定位的物質(zhì)時(shí)卻降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
據(jù)信使用特別設(shè)計(jì)來(lái)應(yīng)用本發(fā)明的方法的試劑盒將能很方便地進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供試劑盒，這種試劑盒包括一定量的基本上純凈的上文所討論的能增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞的多肽或構(gòu)建體，以及一種逆轉(zhuǎn)錄病毒在其上進(jìn)行感染的人工基質(zhì)。多肽或其它構(gòu)建體可以單獨(dú)提供或包被于人工基質(zhì)上提供。在用于人造血細(xì)胞的感染方案時(shí)，試劑盒還包括用于細(xì)胞預(yù)刺激的造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子。此外，試劑盒可包含如上文討論的用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。一般說(shuō)來(lái)，試劑盒將包含無(wú)菌的包裝，在包裝中這些不同的試劑盒成分相互之間有足夠的空間以防止在試劑盒操作中打破組分。例如，普通的方法是使用含有多個(gè)使試劑盒組分相互分開(kāi)的小室或空間的塑料鑄型物。
為了進(jìn)一步了解和理解本發(fā)明，我們提供了下面的具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例在本質(zhì)上是說(shuō)明性的而不是限制性的。
實(shí)施例1 使用TKNEO將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)骨髓細(xì)胞 1.1.病毒上清液的制備 含逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒TKNEO載體的GP+EnvAM 12生產(chǎn)細(xì)胞(見(jiàn)Markowitz等(1988)《病毒學(xué)》167卷，400頁(yè))培養(yǎng)于Iscove’s改良Dulbeccos培養(yǎng)基(IMDM，Gibco，Gaithersburg，MD)中，培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)和100單位/ml青霉素以及100微克/ml鏈霉素(P/S，均來(lái)自Cibco)。加入10ml含20％FCS的IMDM至匯合的培養(yǎng)板中過(guò)夜，收集含有病毒的上清液。收集的培養(yǎng)液過(guò)0.45微米濾器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)，貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 1.2.纖連蛋白片段的制備 FN由人血漿(Lifesource，Glenview，IL)中純化，方法如Ruoslahti等，《酶學(xué)方法》82卷，803-831頁(yè)(1982)所述，但在以4M尿素洗脫FN前用1M尿素洗明膠-瓊脂糖柱。純化的FN于4℃對(duì)10mM 3-(環(huán)己氨基)-1-丙烷-磺酸(CAPS)、150mM NaCl、2mM CaCl2、pH11.0充分透析，分成小份貯存于-80℃。FN的胰凝乳蛋白酶樣細(xì)胞(Chymotrypticcell)結(jié)合區(qū)(CBD)(CS-1)和肝素-II結(jié)合片段如前所述進(jìn)行純化(Ruoslahti等(1982)，上文，Patel和Lodish，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》，102卷，449-456頁(yè)(1986)及Bernardi等，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》，105卷489-498頁(yè)(1987)。三個(gè)主要的肝素結(jié)合片段(30KD、35KD及42KD)由肝素-瓊脂糖柱的1M NaCl洗脫物中獲得。為了進(jìn)一步純化這些肝素-結(jié)合片段，將1M NaCl洗脫物于4℃對(duì)10mM Tris-HCl，pH7.0透析過(guò)夜，并過(guò)已用10mM Tris-HCl pH7.0平衡的陰離子交換柱(2ml DEAEsepharose fast flow (Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)/mg蛋白質(zhì))。30/35 KD片段由未結(jié)合級(jí)份收集，而42KD片段以100mM NaCl由柱中洗脫。由500mg FN獲得了大約26mg的30/35KD片段和4mg的42KD片段。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法確定，42KD片段而非30/35KD片段被抗血纖蛋白結(jié)合區(qū)的抗體識(shí)別。并且，42 KD片段結(jié)合血纖蛋白-瓊脂糖親和柱。
為用于感染方案，如Patel和Lodish(1986)上文所述，將纖連蛋白片段以75pmol/cm2的濃度固定于35或100mm培養(yǎng)皿(Falcom，Lincoln Park，NJ)。對(duì)照培養(yǎng)板采用類(lèi)似方式以2％(無(wú)FN)牛血清白蛋白(BSA，Boehr inger Mannheim，Mannheim，Germany)包被。
1.3.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方案 根據(jù)Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)院Institutional Review Board證實(shí)的方案，將來(lái)自健康成年供者的骨髓樣品收集于含有無(wú)菌、無(wú)防腐劑的硫酸鈉肝素的試管中。25℃下在Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)中離心45分鐘制備低密度單核細(xì)胞。37℃、5％CO2下在組織培養(yǎng)板上于含2％FCS的IMDM中進(jìn)一步溫育4-16小時(shí)，由低密度骨髓細(xì)胞中除去塑料粘附細(xì)胞。
如Luskey等(1992)《血液》80卷，396頁(yè)所述進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染之前，將粘附陰性低密度單核細(xì)胞在37℃和5％CO2下于含下列成分的IMDM中預(yù)刺激48小時(shí)20％FCS、100U/ml rhIL-6、100ng/mlrhSCF(均購(gòu)自Amgen，Thousand Oaks，CA)和P/S，預(yù)刺激在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞/ml。用移液器劇烈沖擊培養(yǎng)皿除去與塑料粘附較松的細(xì)胞，收集預(yù)刺激細(xì)胞。
預(yù)刺激細(xì)胞(5×105細(xì)胞/ml)于BSA(對(duì)照)或纖連蛋白或纖連蛋白片段(以UV輻射處理以提高蛋白對(duì)塑料板的粘附)包被的板上溫育6小時(shí)，隨后在生長(zhǎng)因子(同上)和7.5微克/ml polybrene(Aldrich Chemical，Milwaukee，WI)存在下以病毒上清液感染。2小時(shí)后置換病毒上清液(包括生長(zhǎng)因子和5.0微克/ml Polybrene)，細(xì)胞再溫育12到24小時(shí)。每次更換培養(yǎng)基時(shí)均再加入非粘附細(xì)胞。
感染方案后，倒去非粘附細(xì)胞，粘附造血細(xì)胞使用細(xì)胞分離緩沖液(CDB)(不含酶/基于PBS，Gibco)按照廠商說(shuō)明由培養(yǎng)液中收集。將粘附細(xì)胞加入至非粘附級(jí)份，洗兩次并計(jì)數(shù)。收集的細(xì)胞在克隆形成甲基纖維素祖細(xì)胞試驗(yàn)或長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物中鋪板。
1.4.長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物 對(duì)以前介紹的方法稍作調(diào)整進(jìn)行LTC-IC(人干細(xì)胞)試驗(yàn)。Sutherland等，《血液》74卷，1563頁(yè)(1989)。簡(jiǎn)而言之，0.5-1×106感染細(xì)胞接種于長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)物(LTMC)，骨髓培養(yǎng)物之下為匯合、預(yù)先輻射處理(同上)的異源人骨髓成纖維細(xì)胞(BMF)，該培養(yǎng)物生長(zhǎng)于5ml含有下列成分的IMDM10％FCS、10％馬血清(Sigma)和P/S、1×10-5M氫化可的松(Upjohn，Kalamazoo，MI)和320 mosmol氯化鈉，用6孔組織培養(yǎng)板(Costar，Cambridge，MA)培養(yǎng)。LTMC于33℃、5％CO2下溫育，每周移去50％培養(yǎng)基和非粘附細(xì)胞進(jìn)行飼喂。五周后，使用CDB由BMF中除去粘附造血細(xì)胞使LTC-IC培養(yǎng)物死亡。合并非粘附和粘附造血細(xì)胞，并鋪于甲基纖維素中以得到LTC-IC來(lái)源的集落。
1.5.克隆形成甲基纖維素試驗(yàn) 對(duì)Toksoz等《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》89卷，7350頁(yè)(1992)所述方法稍作調(diào)整進(jìn)行甲基纖維素試驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，2-5×104感染的成人骨髓細(xì)胞與1ml 2.4％IMDM甲基纖維素(Fluka，Ronkonkoma，NY)中的5單位/ml紅細(xì)胞生成素(Epo，Amgen)、100ng/ml rhSCF、10ng/mlrhIL-3(Genzyme，Cambridge，MA)鋪板，IMDM纖維素中含有25％FCS、10％人血漿、10-5M β-巰基乙醇(Sigma)和P/S。培養(yǎng)物于37℃、5％CO2/95％空氣下溫育，第13天在倒置顯微鏡下觀察來(lái)對(duì)集落(＞50細(xì)胞)按照CFU-GM(含粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)、CFU-Mix(含骨髓和紅細(xì)胞成分)或BFU-E(只含紅細(xì)胞成分)進(jìn)行記錄。
1.6.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的分析 TKNEO病毒的感染效率通過(guò)在第13天確定抗1.5mg/ml(干粉，Gibco)G418的甲基纖維素集落的百分比進(jìn)行分析。在每一試驗(yàn)中將骨髓溫育于不產(chǎn)生重組病毒的GP+Env AM 12包裝細(xì)胞系進(jìn)行模擬感染。將這些模擬感染細(xì)胞與1.5mg/ml G418一起培養(yǎng)始終證明，背景集落＜1％。
1.7.基因轉(zhuǎn)移進(jìn)定向祖細(xì)胞的效率 通過(guò)對(duì)鋪于30/35 FN或BSA包被的培養(yǎng)皿上的骨髓細(xì)胞進(jìn)行感染比較了感染效率。在這些條件下沒(méi)有選擇的感染之后得到的集落數(shù)目未見(jiàn)差異。圖2示出感染后G418r集落的百分比。在30/35 FN上各種類(lèi)型的祖細(xì)胞，包括來(lái)自譜系限制(BFU-E和CFU-GM)以及寬譜系(CFU-Mix)祖細(xì)胞的祖細(xì)胞均可見(jiàn)到較高百分比的G418r集落。在30/35 FN上感染所有定向祖細(xì)胞均較在BSA上高出9倍。
1.8.基因轉(zhuǎn)移進(jìn)長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞的效率 用TKNEO載體對(duì)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)LTC-IC進(jìn)行了評(píng)價(jià)，基因轉(zhuǎn)移進(jìn)LTC-IC衍生集落只在于30/35 FN上進(jìn)行感染后檢測(cè)到(30/35 FN，16％G418r集落；BSA，0％G418r集落)。
1.9.30/35 FN對(duì)造血細(xì)胞感染效率影響的特異性 為確定30/35 FN上見(jiàn)到的提高的基因轉(zhuǎn)移效率的特異性，在以BSA、30/35 FN、完整纖連蛋白、含有包括RGDS四肽序列的中央細(xì)胞結(jié)合區(qū)(CBD)的115 kd FN片段和特征性具有肝素-II結(jié)合區(qū)但缺少CS-1序列(圖1)的42 KD C-末端FN片段(42 KD)包被的培養(yǎng)板上進(jìn)行TKNEO感染。BSA感染產(chǎn)生3±1％的G418r BFU-E、1±1％的G418r CFU-GM和0±0％的G418r CFU-Mix。CBD上的G418r集落比例未見(jiàn)明顯增加，而42 FN上可見(jiàn)BFU-E感染略有升高(6.0±-1％)(圖3)。但是，完整FN促進(jìn)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)所有定向祖細(xì)胞的升高。在完整FN上進(jìn)行感染后G418r集落百分比少于在30/35 FN上進(jìn)行感染后的百分比，這見(jiàn)于所有譜系，包括BFU-E(16±-2％對(duì)24±4％)、CFU-GM(5±2％對(duì)20±4％)和CFU-Mix(6±1對(duì)9±1)，(分別為完整FN對(duì)30/35 FN)。
實(shí)施例2 使用PGK-mADA將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)骨髓細(xì)胞 2.1.通用方案 PGK-mADA病毒上清液的制備如實(shí)施例1制備TKNEO所述。纖連蛋白的胰凝乳蛋白酶樣(chymotryptic)片段(圖1)如實(shí)施例1所述制備，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方案亦如實(shí)施例1。 LTC-IC(人干細(xì)胞)試驗(yàn)和甲基纖維素實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行。
2.2.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的分析 PGK-mADA載體感染的效率通過(guò)使用ADA同工酶電泳進(jìn)行蛋白分析確定。單個(gè)祖細(xì)胞集落的分析如Moritz(1993)和Lim等(1989)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》86卷，8892頁(yè)所述進(jìn)行。為嚴(yán)格分析轉(zhuǎn)移效率，只有mADA表達(dá)水平等于或高于內(nèi)源人ADA的集落被認(rèn)為是已轉(zhuǎn)導(dǎo)的。為分析合并的集落，由甲基纖維素培養(yǎng)物挑出的集落在1.5ml微量離心管(Rainin，Woburn，MA)中合并，用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基和磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌，離心并貯存于-20°。進(jìn)行ADA分析時(shí)，細(xì)胞在5ul裂解緩沖液中反復(fù)凍融進(jìn)行裂解，并如前所述進(jìn)行同工酶電泳。
2.3.基因轉(zhuǎn)移進(jìn)定向祖細(xì)胞的效率 通過(guò)對(duì)鋪于30/35 FN或BSA包被的平皿上的骨髓細(xì)胞進(jìn)行感染比較轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在這些條件下進(jìn)行無(wú)選擇感染之后得到的集落數(shù)目未見(jiàn)差異。如表1所示，相對(duì)于BSA，在30/35 FN上感染所有定向祖細(xì)胞的效率基本上均有提高。如以高滴度(~1×107病毒顆粒/ml)感染時(shí)預(yù)期的那樣，定向祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率極高。參看表I，在30/35 FN上以PGK-mADA感染骨髓的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)均獲得了將近100％的定向祖細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
表1 在纖連蛋白30/35片段上使用PGK-mADA載體感染人定向祖細(xì)胞的效率 *表達(dá)mADA的集落數(shù)目/分析的集落總數(shù) 2.4.基因轉(zhuǎn)移進(jìn)長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞的效率 在以PGK-mADA進(jìn)行的4個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中，相當(dāng)部分的來(lái)自5周齡LTMC(即LTC-IC衍生集落)的祖細(xì)胞集落表達(dá)轉(zhuǎn)移的鼠ADA基因。在分析的集落中表達(dá)從2/12(17％)到6/6(100％)(表2)。在所有被認(rèn)為是陽(yáng)性的集落中，導(dǎo)入的mADA基因的表達(dá)超過(guò)或至少等于內(nèi)源人ADA活性量。PGK-mADA的感染效率高于TKNEO。如表2所示，在30/35 FN上的PGK-mADA感染骨髓的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)均獲得了將近100％的定向祖細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
表2 使用PGK-mADA載體感染人長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)的效率 *mADA陽(yáng)性集落的數(shù)目/分析的集落數(shù)目 N/A未分析 2.5.30/35 FN對(duì)造血細(xì)胞感染效率影響的特異性 在30/35 FN上基因轉(zhuǎn)移進(jìn)LTC-IC的效率增加。由于這些次級(jí)LTC-IC衍生集落的大小相對(duì)較小，在單個(gè)集落上進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的能力有限。在BSA、完整纖連蛋白和42 FN上以PGK-mADA感染之后，分別有0/6、0/4和0/3 LTC-IC衍生集落表達(dá)鼠ADA，而在30/35FN上有3/5的LTC-IC衍生集落表達(dá)mADA。另外，在另兩個(gè)試驗(yàn)中，分析前合并多個(gè)LTC-IC衍生集落，鼠ADA表達(dá)僅在30/35 FN上進(jìn)行感染后檢測(cè)到，在完整FN上感染后表達(dá)較低，但在42 FN或BSA上感染后未見(jiàn)表達(dá)。
實(shí)施例3 使用PGK-hADA將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)骨髓細(xì)胞 3.1.通用方案 PGK-hADA病毒上清液制備如實(shí)施例1制備TKNEO所述。纖連蛋白的胰凝乳蛋白酶樣片段(圖1)如實(shí)施例1所述制備，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方案亦如實(shí)施例1。LTC-IC和甲基纖維素試驗(yàn)如實(shí)施例1所述進(jìn)行。
3.2.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的分析 為分析合并的集落，由甲基纖維素培養(yǎng)物挑出的集落在1.5ml微量離心管(Rainin，Woburn，MA)中合并，用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基和PBS洗滌，離心并貯存于-20℃。進(jìn)行ADA分析時(shí)，將細(xì)胞在5ul裂解緩沖液中反復(fù)凍融以使其裂解，并如前所述進(jìn)行同工酶電泳。
實(shí)施例4 使用TKNEO將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)臍帶血細(xì)胞 4.1.通用方案 TKNEO病毒上清液和纖連蛋白胰凝乳蛋白酶樣片段(圖1)的制備如前面實(shí)施例1所述。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方案如實(shí)施例1，不同之處是根據(jù)Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)院Institutional Review Board證實(shí)的方案將來(lái)自正常、足月的新生兒的臍帶血收集于含有肝素的試管中，并用之代替骨髓細(xì)胞。LTC-IC(人干細(xì)胞)和甲基纖維素試驗(yàn)根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行。
4.2.基因轉(zhuǎn)移進(jìn)定向祖細(xì)胞的效率 在三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中，在FN30/35上的感染較BSA提高了四倍(表3) 表3 使用30/35 FN片段和TKNEO載體感染臍帶血祖細(xì)胞的效率 實(shí)施例5 使用PGK-mADA將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)臍帶血細(xì)胞 5.1.通用方案 PGK-mADA病毒上清液和纖連蛋白的胰凝乳蛋白酶樣片段(圖1)的制備如前面實(shí)施例1所述。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方案如實(shí)施例1，不同之處是根據(jù)Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)院Institutional Review Board證實(shí)的方案將來(lái)自正常、足月的新生兒的臍帶血收集于含有肝素的試管中。LTC-IC和甲基纖維素試驗(yàn)根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行。
5.2.基因轉(zhuǎn)移進(jìn)長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞的效率 使用高滴度PGK-mADA載體，對(duì)LTC-IC衍生集落的分析表明，引入的mADA cDNA的高水平表達(dá)僅見(jiàn)于在FN 30/35上使用上清液感染的臍帶血建立的培養(yǎng)物。在BSA對(duì)照板上感染的LTC-IC衍生集落僅檢測(cè)到極低的mADA表達(dá)。
實(shí)施例4和實(shí)施例5列出的結(jié)果證實(shí)使用FN 30/35時(shí)提高的感染效率在使用臍帶血祖細(xì)胞和干細(xì)胞時(shí)也可得到。
實(shí)施例6 使用PGK-hADA將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)臍帶血細(xì)胞 PGK-hADA病毒上清液和纖連蛋白的胰凝乳蛋白酶樣片段(圖1)的制備如實(shí)施例1 TKNEO的制備所述。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染方案如實(shí)施例1，不同之處是根據(jù)Indiana大學(xué)醫(yī)學(xué)院Institutional Review Board證實(shí)的方案將來(lái)自正常、足月的新生兒的臍帶血收集于含有肝素的試管中，并用之代替骨髓細(xì)胞。LTC-IC和甲基纖維素試驗(yàn)根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行。
實(shí)施例7-11 實(shí)施例7-11中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和生產(chǎn)細(xì)胞系 實(shí)施例7-11中使用兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒-生產(chǎn)包裝細(xì)胞系分別為親嗜性GP+E86(Markowitz，D，S.Goff和A.Bank，《病毒學(xué)雜志》62卷，1120-1124頁(yè)(1988)和兼嗜性GP+envAM12細(xì)胞系(Markowitz，D，S.Goff和A.Bank，《病毒學(xué)》167卷，400-406頁(yè)(1988)。此處所述的研究中所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和生產(chǎn)克隆列于表4。
表4 所有細(xì)胞系均培養(yǎng)于Dulbecco’s改良Eagles培養(yǎng)基(DME，Gibco，Grand Island，NY)，其中含有10％胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，UT)、100單位/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素(P/S，均來(lái)自Gibco)，但EAL2a細(xì)胞生長(zhǎng)于含有10％FCS加上P/S的DME-F12(Gibco)。對(duì)鼠細(xì)胞，加入10ml含有10％FCS加上P/S的α-基本必需培養(yǎng)基(α-MEM Gibco)至匯合的10cm培養(yǎng)板中過(guò)夜，人細(xì)胞則加入10ml含有10％FCS加上P/S的Iscove’s Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM，Gibco)至匯合的10cm培養(yǎng)板中過(guò)夜，從而收集含有病毒的上清液。獲得的培養(yǎng)基通過(guò)0.45微米濾器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)過(guò)濾，并貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例7 鼠初級(jí)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo) 7.1.試驗(yàn) 使用鼠細(xì)胞研究時(shí)，使用150mg/kg 5-氟尿嘧啶(SoloPackLaboratories，F(xiàn)ranklin Park，IC)之后兩天由6到8周齡C3H/HeJ小鼠股骨和脛骨取骨髓(Lim，B.，J.F.Apperley，S.H.Orkin，及D.A.Williams《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》86卷，8892-8896頁(yè)(1989))。細(xì)胞在IMDM/20％FCS加上P/S中以5×105細(xì)胞/ml的濃度采用100ng/ml大鼠重組干細(xì)胞因子(rrSCF；Amgen，Thousands Oaks，CA)和100單位/ml重組人白介素-6(rhIL-6；Pepro Tech Inc.，Rock Hill，NJ)預(yù)刺激48小時(shí)(Luskey，B.D.，M.Rosenblatt，K.Zsebo和D.A.Williams，《血液》80卷，396-402頁(yè)(1992))。隨后，由EPHA-5生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生的PGK-hADA載體的基因轉(zhuǎn)移效率使用三種不同的感染方案進(jìn)行比較1)上清液感染；2)在FN30/35上進(jìn)行上清液感染；3)在EPHA-5生產(chǎn)細(xì)胞中協(xié)同培養(yǎng)。因此，100mm細(xì)菌培養(yǎng)皿以溶解于5ml磷酸緩沖鹽水(PBS；Gibco)中的FN30/35按2.5ug/cm2(等于75pmol/cm2)進(jìn)行包被，在紫外光下打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋室溫放置1小時(shí)，蓋上培養(yǎng)皿蓋再放置1小時(shí)。以2％牛血清白蛋白(BSA，F(xiàn)raction V；Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)在室溫下封閉30分鐘后，培養(yǎng)皿用補(bǔ)加有2.5％(v/v)1M Hepes的Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)(均來(lái)自Gibco)洗一次。上清液感染時(shí)，培養(yǎng)皿僅以BSA包被。5×106預(yù)刺激的供者細(xì)胞與補(bǔ)加有100U/mlrhIL-6、100ng/ml hrSCF和7.5ug/ml Polybrene的如上所述獲自EPHA-5細(xì)胞的病毒上清液10ml一起溫育。收集非粘附細(xì)胞，并再加入新鮮的病毒上清液。協(xié)同培養(yǎng)時(shí)，4ml培養(yǎng)基中的EPHA-5細(xì)胞與10ug/ml絲裂霉素C于37℃溫育2小時(shí)，洗滌，胰酶消化，并以3×106細(xì)胞的濃度接種于裝有10 mlαMEM/20％FCS加P/S的100mm組織培養(yǎng)皿中。第二天，加入用100U/ml rhIL-6、100ng/ml hrSCF和4ug/ml Polybrene預(yù)刺激的5×106骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)。感染后，棄去非粘附細(xì)胞，粘附造血細(xì)胞使用細(xì)胞分離緩沖液(CBD)(不含酶/基于PBS，Gibco)按照廠商說(shuō)明由培養(yǎng)物中收集，將粘附細(xì)胞加入至非粘附級(jí)份中，洗滌兩次，懸浮于大約1ml HBSS/Hepes。由5×106預(yù)刺激細(xì)胞得到的全部細(xì)胞注射入三只受體小鼠的尾靜脈，這些小鼠已經(jīng)接受了致死量的全身輻射處理(700加400cGy，137Cs源)(Lusky，B.D.，M.Rosenblatt，K.Zsebo及D.A.Williams 《血液》80卷，396-402頁(yè)(1992))。造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)檢查重建小鼠中引入的人ADA cDNA的表達(dá)進(jìn)行分析。在移植小鼠中進(jìn)行這種ADA同工酶分析的方法如下通過(guò)乙酸纖維素原位酶分析檢查外周血細(xì)胞中是否存在hADA蛋白(Lim，B.，D.A.Williams和S.H.Orkin《分子細(xì)胞生物學(xué)》7卷3459-3465頁(yè)(1987))。移植后4個(gè)月開(kāi)始進(jìn)行檢查，以后每月重復(fù)。
7.2.結(jié)果 用經(jīng)遺傳操作的造血干細(xì)胞進(jìn)行的小鼠長(zhǎng)期骨髓重建通常被認(rèn)為足以在移植后4個(gè)月確定干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。7個(gè)月后通過(guò)同工酶分析進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)骨髓的受體分析提示1)人ADA cDNA表達(dá)見(jiàn)于使用協(xié)同培養(yǎng)或在FN30/35上的上清液感染的組別中，但在無(wú)FN30/35的上清液感染后的移植組別中不存在；和2)協(xié)同培養(yǎng)組和FN30/35組的表達(dá)水平相當(dāng)。如圖4泳道2-4所示，移植了通過(guò)在EPHA-5細(xì)胞上的協(xié)同培養(yǎng)而轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓的三只小鼠可見(jiàn)容易檢測(cè)到的人ADA。類(lèi)似水平的人ADA在三只移植了通過(guò)FN30/35上清液感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞的小鼠中也可以檢測(cè)到(圖4，泳道5-7)。相形之下，在三只移植了通過(guò)在BSA上的上清液感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞的小鼠中檢測(cè)不到人ADA(圖4，泳道8-10)。確定人ADA位置的對(duì)照示于圖4的泳道1和12，泳道11為小鼠ADA。泳道2-10中小鼠的條帶表明上樣的蛋白量相同。這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)FN30/35上的上清液感染的長(zhǎng)期重建造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)與協(xié)同培養(yǎng)等效，而遠(yuǎn)勝于無(wú)FN30/35的上清液感染。
實(shí)施例8 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)合FN30/35提高轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制 8.1.試驗(yàn) 為測(cè)試提高的轉(zhuǎn)導(dǎo)是否為病毒和造血細(xì)胞的協(xié)同定位的結(jié)果，我們對(duì)重組病毒顆粒是否結(jié)合FN30/35進(jìn)行了分析。因此，F(xiàn)N30/35包被的培養(yǎng)板與含TKNeo病毒的上清液預(yù)溫育30分鐘，然后充分洗滌。上清液的病毒滴度使用NIH3/3T3細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案測(cè)定(Markowitz，D.，S.Goff和A.Bank《病毒學(xué)雜志》62卷1120-1124頁(yè)(1988))。簡(jiǎn)而言之，3T3細(xì)胞以1000細(xì)胞/孔的濃度鋪于6孔組織培養(yǎng)板上并生長(zhǎng)過(guò)夜。病毒上清液的系列稀釋液和7.5u/ml polybrene加至各孔，并于37℃溫育2.5小時(shí)，隨后加入2ml培養(yǎng)基。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成含G418(0.75mg/ml，干粉，Gibco)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)板溫育10-12天。10-12天后將G418抗性集落(G418r)染色并計(jì)數(shù)。集落數(shù)/孔乘以病毒上清液稀釋度作為上清液的感染性顆粒(cfu)/ml。我們?cè)u(píng)價(jià)/“滴定”了如下處理后FN30/35或BSA包被的35mm培養(yǎng)板上殘余的病毒顆粒數(shù)量培養(yǎng)板與病毒上清液預(yù)溫育。隨后每個(gè)35mm細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)皿中加入1000NIH/3T3細(xì)胞和Polybrene充分洗滌。24小時(shí)后，加入含有0.75mg/mlG418(干粉)的培養(yǎng)基，將細(xì)胞再溫育10-12天。溫育之后，即可通過(guò)計(jì)數(shù)G418抗性NIH/3T3集落而對(duì)存在的粘附病毒進(jìn)行定量。
為評(píng)價(jià)病毒結(jié)合FN30/35是否以劑量依賴方式發(fā)生，以濃度增加的FN30/35包被培養(yǎng)皿重復(fù)上述試驗(yàn)。因此，35mm細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)皿如上所述以1、4、10和20ug/cm2 FN30/35包被。預(yù)先滴定為1×104感染性病毒顆粒/ml的TKNeo病毒原液的1∶50稀釋液在FN30/35包被的板上溫育30分鐘。充分洗滌后，2000 NIH/3T3細(xì)胞加入至各孔中。如上所述進(jìn)行選擇，選擇后10天對(duì)G418抗性NIH/3T3集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。
8.2.結(jié)果 圖5列出了三個(gè)代表性試驗(yàn)中一個(gè)的結(jié)果，使用TKNeo上清液，在BSA包被的平板上，通過(guò)NIH/3T3細(xì)胞中的G418r集落測(cè)定的逆轉(zhuǎn)錄病毒效價(jià)降低了3個(gè)Log(4×103到0)以上，而在30/35 FN包被的平板上僅降低了1Log。這些數(shù)據(jù)表明逆轉(zhuǎn)錄病毒定量結(jié)合FN 30/35，但不結(jié)合BSA包被的培養(yǎng)皿(對(duì)照培養(yǎng)皿)。圖6顯示，當(dāng)含病毒的上清液在用濃度提高的FN30/35包被的平板上溫育時(shí)，檢測(cè)到了數(shù)目增加的G418抗性集落。因此，病毒結(jié)合FN30/35是以劑量依賴方式進(jìn)行的。
實(shí)施例9 病毒結(jié)合重組纖連蛋白片段 9.1.試驗(yàn) Kimizuka等已經(jīng)報(bào)道了克隆的FN DNA序列在大腸桿菌中的表達(dá)(Kimizuka，F(xiàn).，Y.Taguchi，Y.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，D.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani《生物化學(xué)雜志》110卷，284-291頁(yè)(1991))?？寺‰暮颓逗想陌ɡw連蛋白中已知參與細(xì)胞粘附的一個(gè)或幾個(gè)重要序列的組合(包括RGDS、CS-1和肝素結(jié)合位點(diǎn))，見(jiàn)圖7。為分析逆轉(zhuǎn)錄病毒是否能結(jié)合這些重組FN片段，在以重組片段C-274、H-271、H-296、CH-271、CH-296和C-CS1包被的平板上重復(fù)3T3細(xì)胞集落形成試驗(yàn)，F(xiàn)N30/35作為陽(yáng)性對(duì)照，采用具有1×104感染性病毒顆粒/ml的逆轉(zhuǎn)錄病毒TKNeo冷凍原液的兩個(gè)不同稀釋度(1∶10和1∶100)。FN片段的使用濃度為120-130pmol/cm2(等于4ug/cm2C-274、H-271、H-296、C-CS1、FN30/35和8ug/cm2 CH-271和CH-296)。簡(jiǎn)而言之，包被平板，加入病毒，充分洗滌平板，加入NIH/3T3細(xì)胞24小時(shí)，隨后于選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10天，接著將集落染色并計(jì)數(shù)。
9.2.結(jié)果 圖8表明使用片段H-271、H-296、CH-291和CH296時(shí)G418抗性集落的數(shù)量(并因此病毒粘附)增加。并且，盡管在該試驗(yàn)中CH-271片段表現(xiàn)出最高水平的病毒粘附，但在這些重組片段和FN30/35之間病毒粘附的數(shù)量大體相當(dāng)。所有這5個(gè)FN片段中共同的是III型重復(fù)12-14，其中含有可能位于重復(fù)13(Kimizuka，F(xiàn).，Y.Taguchi，Y.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani《生物化學(xué)雜志》110卷，284-291頁(yè)(1991))的高親和力肝素結(jié)合位點(diǎn)(Ruoslahti，E.，《生物化學(xué)年評(píng)》57卷，375-413頁(yè)(1988)和Kimizuka，F(xiàn).，Y.Taguchi，Y.Ohdate，Y.Kawase，T.Shimojo，K.Hashino，I.Kato，K.Sekiguchi和K.Titani《生物化學(xué)雜志》110卷，284-291頁(yè)(1991))。這表明病毒結(jié)合是通過(guò)該已知的粘附位點(diǎn)進(jìn)行的。這可通過(guò)將4ug/cm2 CH-271包被的培養(yǎng)皿與濃度增加(10-1000ug/ml)的硫酸肝素一起溫育證實(shí)，硫酸肝素為帶大量電荷的分子，已知其抑制細(xì)胞結(jié)合肝素結(jié)合位點(diǎn)。由圖9可見(jiàn)，CH-271與濃度增加的硫酸肝素預(yù)溫育之后G418抗性集落的數(shù)目減少。這些數(shù)據(jù)表明病毒結(jié)合FN是通過(guò)位于FN羧基末端區(qū)域中緊靠CS-1位點(diǎn)的高親和力肝素結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)的。
實(shí)施例10 造血細(xì)胞在重組纖連蛋白片段上的轉(zhuǎn)導(dǎo) 10.1.試驗(yàn) 為分析前文所述的在FN30/35上造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加是否見(jiàn)于重組FN片段，我們使用高增殖潛能—集落形成細(xì)胞(HPP-CFC)試驗(yàn)評(píng)價(jià)了體外上清液感染的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。通過(guò)使用EAL2a載體，我們比較了各種重組FN片段與FN30/35在BSA上的上清液感染對(duì)造血細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，使用G418抗性集落的生長(zhǎng)作為基因轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。并且，我們比較了已粘附于FN片段的病毒顆粒(對(duì)上清液中的病毒)轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的能力。0.5-1×106預(yù)刺激的骨髓細(xì)胞在1-2ml含EAL2a病毒的上清液中于35mmFN包被的培養(yǎng)皿中如上所述與生長(zhǎng)因子和5ug/ml Polybrene溫育。為評(píng)價(jià)結(jié)合于FN片段上的病毒對(duì)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，與含有病毒的上清液溫育過(guò)的35mmFN包被的培養(yǎng)皿以PBS洗滌三次，每次2ml。隨后，加入補(bǔ)加有生長(zhǎng)因子和Polybrene的2ml培養(yǎng)基中的0.5-1×106預(yù)刺激過(guò)的骨髓細(xì)胞。22小時(shí)后，收獲細(xì)胞并按介紹在有或無(wú)1.5mg/ml G418時(shí)在HPP-CFC試驗(yàn)中鋪板，(Bradley，T.R.和D.Metcalf，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，44287-293(1966))。培養(yǎng)物在7％CO2、33℃下溫育14天，根據(jù)G418抗性集落百分比計(jì)算基因轉(zhuǎn)移效率。
10.2.結(jié)果 對(duì)所有包括肝素結(jié)合位點(diǎn)(HBS)和至少另一個(gè)活性細(xì)胞粘附位點(diǎn)的片段(實(shí)心長(zhǎng)方體)來(lái)說(shuō)，初級(jí)造血細(xì)胞通過(guò)上清液感染的轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖10)顯著高于BSA上的上清液感染。重組片段CH-271、H-296、CH-296和C-CS1的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率類(lèi)似于FN30/35的效果，所有包括肝素結(jié)合位點(diǎn)和CS-1位點(diǎn)兩者的三個(gè)片段。在所有其它情況下，轉(zhuǎn)導(dǎo)大幅度減低。這些數(shù)據(jù)表明原來(lái)在FN30/35上所見(jiàn)的初級(jí)造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加在重組FN片段上可重現(xiàn)。這進(jìn)一步證實(shí)直接結(jié)合于纖連蛋白的病毒能夠遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞。最后它還證實(shí)存在CS-1和肝素結(jié)合兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)初級(jí)造血前體(干)細(xì)胞的用途。
實(shí)施例11 使用重組纖連蛋白片段上的鼠供體細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠長(zhǎng)期骨髓重建 11.1試驗(yàn) 我們重復(fù)了上述初級(jí)造血祖細(xì)胞體外試驗(yàn)(自實(shí)施例10)，比較了在下列物質(zhì)上的上清液感染BSA對(duì)FN 30/35對(duì)重組FN片段對(duì)協(xié)同培養(yǎng)，使用骨髓移植來(lái)分析它們對(duì)重建造血干細(xì)胞的影響。簡(jiǎn)而言之，給經(jīng)過(guò)致死輻射的小鼠注射已經(jīng)用含有人ADA cDNA的EPHA-5載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的供體細(xì)胞。1個(gè)月后和大約6個(gè)月后，取外周血進(jìn)行ADA同工酶試驗(yàn)來(lái)分析基因轉(zhuǎn)移效率。
11.2結(jié)果 圖11顯示了1個(gè)月后的結(jié)果，并清楚地顯示，含有肝素結(jié)合位點(diǎn)和CS-1兩種位點(diǎn)的纖連蛋白片段H-296產(chǎn)生與FN30/35和協(xié)同培養(yǎng)相似的結(jié)果。不同時(shí)含有這兩個(gè)位點(diǎn)的片段在轉(zhuǎn)導(dǎo)可移植造血細(xì)胞時(shí)，效率要低一些。這些數(shù)據(jù)表明，與同時(shí)含有CS-1和肝素結(jié)合位點(diǎn)的重組FN片段結(jié)合的初級(jí)造血/干細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒的協(xié)同定位能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)可移植的造血細(xì)胞。
圖12顯示了移植后4和6個(gè)月的結(jié)果。在此時(shí)間點(diǎn)，在用對(duì)照平板上轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或在僅含有CBD(C-271)或III12-24(H-271)的片段上轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞移植的動(dòng)物中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)種群恢復(fù)的造血干細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)。在C-CS1片段上所見(jiàn)的HSCs遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率較低，在此情況下1/3的動(dòng)物為人蛋白陽(yáng)性?；蜣D(zhuǎn)移進(jìn)體內(nèi)種群恢復(fù)干細(xì)胞在含有HBD與CBD(CH-271)或CS1(H-296)的組合的片段上總能發(fā)現(xiàn)。在含有所有三個(gè)細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的片段(CH-296)上的轉(zhuǎn)導(dǎo)最有效的，比得上靶細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞系的協(xié)同培養(yǎng)。這些數(shù)據(jù)顯示，含有III12-14以及VLA-4和/或VLA-5的結(jié)合位點(diǎn)的纖連蛋白片段能使逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)鼠造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞提高。
實(shí)施例12 纖連蛋白通過(guò)至少三個(gè)位點(diǎn)指導(dǎo)細(xì)胞粘附(圖13)細(xì)胞結(jié)合區(qū)域(CBD)，它經(jīng)整聯(lián)蛋白VLA-5包含重復(fù)10的四肽RGDS；肝素結(jié)合區(qū)域，它經(jīng)細(xì)胞表面蛋白聚糖分子位于III型重復(fù)12-14(III12-14)中；和CS1序列，它經(jīng)整聯(lián)蛋白VLA-4位于可變剪接的IIICS區(qū)域。在這些研究中，我們使用了圖13中所示的六種嵌合重組FN片段，這些片段在肽中單獨(dú)或組合含有上述細(xì)胞粘附位點(diǎn)。
FN包被的細(xì)菌培養(yǎng)皿與200cfu在來(lái)自兼嗜性包裝細(xì)胞系TKNeo的2ml上清液(SN)中溫育。37℃下30分鐘后，培養(yǎng)皿用PBS洗滌三次，然后加入2000NIH/3T3細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)，該細(xì)胞在2ml補(bǔ)加有10％牛血清(CS；Sigma，U.S.A.)和2％P/S的DMEM中。第二天，將細(xì)胞置于含有0.75mg/ml G418的選擇培養(yǎng)基中。8-10天后，培養(yǎng)皿用StatStain(Volu-Sol，U.S.A.)染色，并對(duì)G418r集落計(jì)數(shù)。在此試驗(yàn)中，逆轉(zhuǎn)錄病毒不與沒(méi)有包被的或BSA包被的板結(jié)合。如圖14所示，基因轉(zhuǎn)移進(jìn)NIH/3T3僅發(fā)生在含有肝素II結(jié)合區(qū)域的片段上，該區(qū)域在此也被稱(chēng)作“III12-14”(H-271、CH-271、H-296、CH-296)。這些數(shù)據(jù)表明逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒直接與纖連蛋白的III12-14重復(fù)中的序列結(jié)合。在含有III12-14和CBD兩者的FN片段上的NIH/3T3細(xì)胞感染明顯比只含III12-14的FN片段上高(H-271與CH-271相比)。值得注意的是，由加入量?jī)H為200 NEO cfu/板可產(chǎn)生高達(dá)80個(gè)G418r NIH/3T3集落/板。相形之下，加入CS1沒(méi)有顯示對(duì)NIH/3T3轉(zhuǎn)導(dǎo)有任何效果(H-271對(duì)H296，CH271對(duì)CH-296)。
為了證明FN促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的機(jī)制是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細(xì)胞與片段的同時(shí)結(jié)合，使用非粘附細(xì)胞系(HL60-一種已知的前髓性白血病細(xì)胞系)進(jìn)行試驗(yàn)。HL-60細(xì)胞用熒光染料直接接合的抗VLA-4(FITC；Immunotech，U.S.A.)和VLA-5(PE，Antigenix Amercia，U.S.A.)單克隆抗體或IgG1和IgG2a的同種型對(duì)照(Becton Dickinson)染色，死亡的細(xì)胞用碘化丙錠(propifium iodine)染色來(lái)排除。然后用一臺(tái)FAScan(Becton Dickinson)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。對(duì)于基因轉(zhuǎn)移研究，104HL60細(xì)胞用來(lái)自兼嗜性包裝細(xì)胞系DAG(獲自St.Jude’s ChildrenResearch Hospital，Memphis，TN，U.S.A.)的、含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGF-R)的胞外結(jié)構(gòu)域的病毒上清液(滴度為105 cfu/ml)懸浮，然后加入至以2ug/cm2的濃度包被了六種FN片段的6孔細(xì)菌培養(yǎng)板中。4小時(shí)后，加入2ml取自正在生長(zhǎng)的HL60培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基。4-5天后，加入4ml新鮮培養(yǎng)基(含有5％FCS和2％P/S的RPMI(Gibco))。細(xì)胞共培養(yǎng)8天，然后用抗NGF-R的單克隆抗體8211(Boehringer，U.S.A.)或IgG1同種型對(duì)照(Dako，U.S.A.)進(jìn)行染色，接著與第二抗體FITC接合的羊抗鼠血清(Boehringer)進(jìn)行反應(yīng)。樣品與碘化丙錠一起溫育以排除細(xì)胞殘?jiān)?，并隨后在FACScan上測(cè)量。基因轉(zhuǎn)移在活細(xì)胞進(jìn)入后通過(guò)分析NGF-R的表達(dá)來(lái)證明。所有的基因轉(zhuǎn)移研究均在沒(méi)有Polybrene或魚(yú)精蛋白的條件下進(jìn)行。如圖15所示，HL60細(xì)胞在流式細(xì)胞分析(A+B)中表達(dá)VLA-4而不表達(dá)VLA-5。與表達(dá)數(shù)據(jù)一致，HL60細(xì)胞僅與用含有CS1的片段(H-296、CH-296、C-CS1)包被的板粘附。如圖15所示，HL60細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)僅見(jiàn)于含有III12-14及CS1(H-296、CH-296)的片段。雖然HL-60細(xì)胞可通過(guò)VLA-4整聯(lián)蛋白粘附于C-CS1片段，但缺乏與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的III12-14使HL60細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)大幅度地降低。
在另一組試驗(yàn)中，濃度增加的高分子量(HMW)肝素(Sigma，U.S.A.，MW約7000-25000)溶解在2ml補(bǔ)加有2.5％(v/v)1M Hepes的Hanks平衡鹽緩沖液(HBSS/Hepes；均購(gòu)自Gibco)中，加入至用不同的FN片段以4ug/cm2的濃度包被的6孔細(xì)菌培養(yǎng)板中。30分鐘后，板用PBS洗滌三次，然后加入400cfu/2ml的兼嗜性TKNeo載體。37℃下30分鐘后，板用PBS再次洗滌，接著加入2000個(gè)含有10％CS和2％P/S的DMEM中的NIH/3T3細(xì)胞。按前述方法進(jìn)行選擇，基因轉(zhuǎn)移效率用培養(yǎng)8-10天后的G418r集落數(shù)進(jìn)行計(jì)算。在一組相似的試驗(yàn)中，分級(jí)的低分子量(LMW)肝素(Sigma，U.S.A.，MW約3000)以濃度增加的方式溶解在2ml HBSS/Hepes中，隨后的試驗(yàn)設(shè)計(jì)如上面用于HMW肝素的試驗(yàn)設(shè)計(jì)?；蜣D(zhuǎn)移效率用培養(yǎng)8-10天后G418r集落的數(shù)目讀出。所有這些基因轉(zhuǎn)移研究都在沒(méi)有Polybrene或魚(yú)精蛋白的條件下進(jìn)行。這些試驗(yàn)的結(jié)果示于圖16。如圖所示，病毒與FN結(jié)合能以劑量依賴方式被高分子量肝素競(jìng)爭(zhēng)(16A)，而不能被低分子量肝素競(jìng)爭(zhēng)(16B)。這些結(jié)果證明病毒顆粒與III12-14內(nèi)的序列結(jié)合。
實(shí)施例13 CD34+細(xì)胞群體中BFU-E細(xì)胞的選擇性轉(zhuǎn)導(dǎo) 本實(shí)施例證明，通過(guò)使用帶有一個(gè)病毒結(jié)合區(qū)域和一個(gè)靶細(xì)胞特異的細(xì)胞結(jié)合區(qū)域的多肽，混合的細(xì)胞群體中的所選細(xì)胞可以用作轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。重復(fù)實(shí)施例1的通用TKNEO感染和試驗(yàn)方案，不同之處是使用含有BFU-E、CFU-GM和CFU-Mix細(xì)胞的基本上同源的CD34+細(xì)胞群體(用親和層析法從臍帶血(CB)細(xì)胞中獲得)，并且使用1、2、4、8、16和20ug/cm2的不同濃度的重組FN片段CH-271。結(jié)果示于圖17。如圖所示，能與VLA-5結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的BFU-E細(xì)胞被高效轉(zhuǎn)導(dǎo)(大于25％G418抗性集落)而不能顯示明顯VLA-5結(jié)合的CFU-GM和CFU-Mix群體的轉(zhuǎn)導(dǎo)基本很低效(小于5％G418抗性集落)。
實(shí)施例14 c-KIT+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo) 在本實(shí)施例中，一個(gè)基本上為c-KIT+同源的細(xì)胞群體按照本發(fā)明進(jìn)行了轉(zhuǎn)導(dǎo)。這樣，采用流式細(xì)胞分類(lèi)技術(shù)從小鼠骨髓中分離c-KIT+細(xì)胞?；旧习凑諏?shí)施例1中的介紹使用TKNEO載體將細(xì)胞用于感染方案，不同之處在于FN片段如圖18所示不同，并且感染細(xì)胞進(jìn)行HPP-CFC分析。如圖18所示，含有III12-14和VLA-4結(jié)合位點(diǎn)的FN片段(FN30/35、H296和CH-296)導(dǎo)致高轉(zhuǎn)化效率(大于80％G418抗性集落)，而缺乏這兩個(gè)區(qū)域的FN片段不能產(chǎn)生明顯的轉(zhuǎn)導(dǎo)(C274和C-CS1)或基本上效率較低(H271、CH271，小于20％G418抗性集落)。
實(shí)施例15 采用不同濃度的Polybrene進(jìn)行的NIH/3T3和克隆形成BM細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) 本組試驗(yàn)證明本發(fā)明的有利轉(zhuǎn)導(dǎo)方法在沒(méi)有溴化己二甲銨的情況下進(jìn)行。分別基本上按照實(shí)施例12和1的介紹將NIH/3T3(成纖維細(xì)胞)和克隆形成骨髓細(xì)胞用于TKNEO感染方案，不同之處在于載體、細(xì)胞和不同濃度的Polybrene首先一起懸浮，然后加于用FN片段CH-296(8ug/ml)包被的基質(zhì)。按前面介紹的方法對(duì)這些細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果示于圖19和20。如圖19所示，G418抗性的NIH/3T3集落數(shù)目隨Polybrene濃度的增加而急劇下降，其范圍從不用Polybrene時(shí)的14降至使用12.5ug/ml Polybrene時(shí)的約4。同樣，圖20顯示，當(dāng)感染在沒(méi)有Polybrene時(shí)進(jìn)行，觀察到近40個(gè)集落，而當(dāng)使用10ug/mlPolybrene時(shí)，相應(yīng)的值少于15。
實(shí)施例16 T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和含有膠原蛋白V和FGF病毒結(jié)合序列的多肽的使用 本實(shí)施例介紹了DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)人T細(xì)胞的提高和本發(fā)明的來(lái)自膠原蛋白V和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合序列的使用，這兩種序列基本上與纖連蛋白的肝素II結(jié)合位點(diǎn)同源。這樣，全血用抗CD3(perCP；Becton Dickinson)、CD49e(PE；Anitenix America)、CD49d(分別為FITC，PEBecton Dickinson)的單克隆抗體(MoAbs)在室溫下染色15分鐘，然后按照廠商推薦用FACS裂解液(BECTINDICKINSON)制備用于在FACScan(BECTIN DICKINSON)上進(jìn)行分析。外周血來(lái)源的單核細(xì)胞(PB-MNCs)以1×106細(xì)胞/ml的濃度用1ug/ml OKT-3(Ortho)和50U/ml IL-2(Cetus)進(jìn)行預(yù)刺激。2-3天后，收集細(xì)胞，洗滌，并在用8ug/cm2 CH296或2％牛血清白蛋白(BSA，Boehringer)包被的非組織培養(yǎng)處理板上，在連續(xù)存在7.5ug/mlPolybrene(Aldrich)下，用含有PGK啟動(dòng)子控制下的鼠腺苷脫氨酶的兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒55/6轉(zhuǎn)導(dǎo)1或2天，在其它的每一天，用含有50U/ml IL-2的新鮮培養(yǎng)基置換50％的培養(yǎng)基。在感染后4-6天，收集細(xì)胞，用抗CD3、CD56、TCR-αβ和HLA-DR的MoAbs(均來(lái)自Bectin Dickinson)進(jìn)行表型分析?；蜣D(zhuǎn)移效率的分析在非選擇群體中通過(guò)測(cè)量在ADA同工酶試驗(yàn)中與內(nèi)源的人ADA蛋白相比轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠ADA酶活性來(lái)進(jìn)行(Bodine，D.M.等，《血液》82卷，1975-80頁(yè)(1993)；Moritz，T.等，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》178卷，529-36頁(yè)(1993))。
結(jié)果 A.T細(xì)胞 首先，分析了人T細(xì)胞的FN受體VLA-4和VLA-5的表達(dá)。為此，外周血(PB)來(lái)源的單核細(xì)胞(MNCs)用抗CD3、CD49d和CD49e的單克隆抗體(MoAbs)染色，并用流式細(xì)胞技術(shù)分析。如圖21所示，記入代表全部外周血T細(xì)胞的CD3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞(R1和R4)。94％的PBT細(xì)胞為CD49d陽(yáng)性，96％為CD49e陽(yáng)性。90％的T細(xì)胞表達(dá)VLA-4和VLA-5兩者。
其次，PB來(lái)源的PB-MNCs用CD3 MoAbs OKT-3和重組IL-2預(yù)刺激2-3天，然后在用重組IL-2包被的非組織培養(yǎng)處理板上轉(zhuǎn)導(dǎo)1-2天，然后用來(lái)自兼嗜性生產(chǎn)細(xì)胞系A(chǔ)MmA55/6(Bodine，D.M.等，《血液》82卷，1975-80(1993)；Moritz，T.等，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》178卷，529-36頁(yè)(1993))的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液在用重組FN片段CH-296或?qū)φ誃SA包被的非組織培養(yǎng)處理板上轉(zhuǎn)導(dǎo)1-2天。該病毒含有PGK啟動(dòng)子控制下的鼠腺苷脫氨酶(ADA)cDNA。
感染4-6天后的流式分析顯示，細(xì)胞培養(yǎng)物含有＞90％的T細(xì)胞，其HLA-DR和CD56表達(dá)顯示其中大部分被強(qiáng)烈活化(圖22)。
用ADA同工酶試驗(yàn)(圖23)進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移效率分析證明，當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)方案包括重組肽CH-296時(shí)，導(dǎo)入的鼠ADA蛋白的活性與內(nèi)源的人蛋白活性相同。BSA上感染產(chǎn)生的基因轉(zhuǎn)移水平超出了試驗(yàn)的敏感范圍。
這些數(shù)據(jù)證明，在沒(méi)有聚陽(yáng)離子如polybrene時(shí)，初級(jí)人T細(xì)胞能有效地用不含細(xì)胞含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液在重組FN片段CH-296上進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)?；騻鬟f的效率與使用上清再加polybrene的標(biāo)準(zhǔn)方案相比要高得多。
B.新型重組肽 由于膠原蛋白V(COL)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)兩者都顯示序列與纖連蛋白的HBD同源，并也能結(jié)合肝素，對(duì)圖24中顯示的7種重組蛋白都進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性分析。
首先，分析COL和FGF以確定它們是否含有有功能的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合序列。為此，用重組肽包被細(xì)菌學(xué)板，然后加入含有一種兼嗜性NEO逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液。30分鐘后，充分洗滌板以除去所有未結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，然后在每個(gè)板中加入2000 NIH/3T3細(xì)胞。8-10天后，以G418抗性的(G418r)NIH/3T3細(xì)胞集落的數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖25所示，用G418r集落的生長(zhǎng)所估測(cè)的成功的基因傳遞進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞發(fā)生在含有FN的細(xì)胞結(jié)合區(qū)域(CBD)與HBD(CH-271片段)或與膠原蛋白V(C-COL)或FGF(C-FGF)的序列組合的重組肽上。這些結(jié)果證明，逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒也直接與膠原蛋白V或bFGF中的序列結(jié)合，這也證明含有這些序列的重組肽能用于靶造血祖細(xì)胞。
表達(dá)VLA-4和VLA-5的HEL細(xì)胞用含有經(jīng)過(guò)剪切的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體P75鏈(NGF-R)cDNA的兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒在重組片段C-274(CBD)、H-271(HBD)、CH-271(CBD_HBD)、COL、C-COL(CBD+COL’)、C-FGF、C-FGF-CS1以及對(duì)照BSA上進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。8天后用流式細(xì)胞技術(shù)分析NGF-R的表達(dá)來(lái)分析基因轉(zhuǎn)移效率。
如圖26所示，低水平的基因轉(zhuǎn)移見(jiàn)于用C-274包被的板或BSA上。H-271(CBD)和COL上的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生了33-36％的NGR-R陽(yáng)性細(xì)胞。在此試驗(yàn)中CBD加入至HBD(CH-271)中使轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的百分比增至最高水平。有趣的是，CBD(＝VLA-5結(jié)合位點(diǎn))加入至C-COL片段中的COL或CS-1(＝VLA-4結(jié)合位點(diǎn))加入片段C-FGF-CS1都不能明顯地增加HEL細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)。
最后，IL-6和SCF預(yù)刺激1天的人CD34+骨髓(BM)細(xì)胞在嵌合肽上用兼嗜性NEO逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)1天，然后在存在或缺乏1.5mg/ml G418的情況下鋪板于祖細(xì)胞試驗(yàn)。
經(jīng)過(guò)14天培養(yǎng)后以G418r集落的百分比進(jìn)行評(píng)價(jià)，有效的基因轉(zhuǎn)移見(jiàn)于含有H-271或FGF中逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合序列與細(xì)胞結(jié)合受體的組合的片段。值得注意的是，與用NGF-R逆轉(zhuǎn)錄病毒遺傳改造的HEL細(xì)胞所得的結(jié)果相反(圖27)，在C-FGF中加入CS1位點(diǎn)大大地提高了基因轉(zhuǎn)移進(jìn)克隆形成CD34+BM細(xì)胞的效率，接近在片段CH-296(CBD+HBD+CS1)上獲得的水平。
這樣證明了應(yīng)用T細(xì)胞與纖連蛋白經(jīng)其VLA-4或VLA-5整聯(lián)蛋白結(jié)合的能力，初級(jí)T細(xì)胞能用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在纖連蛋白的特殊粘附區(qū)域上獲得有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。還顯示了逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與膠原蛋白V或bFGF中的序列粘附，這兩個(gè)序列顯示與纖連蛋白的肝素II區(qū)域同源。并且還顯示了造血細(xì)胞和細(xì)胞系能在含有膠原蛋白V或bFGF的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合序列與靶細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的組合的重組肽上進(jìn)行有效的遺傳改造。
盡管本發(fā)明已在前面的敘述中進(jìn)行了詳細(xì)闡述和介紹，這在本質(zhì)上應(yīng)看作是說(shuō)明性的而不是限制性的，應(yīng)當(dāng)理解，只有優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了介紹，所有根據(jù)本發(fā)明的精神所做的改變和修飾都是需要保護(hù)的。
所有在此引用的出版物都特此全文引入作為參考，如同其單獨(dú)引入作為參考和全文列出。另外，1994年3月25日提交的共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/218,355以及1995年3月27日提交并指定美國(guó)的共同未決的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)PCT/US95/03817，特此全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的方法，包括在存在如下物質(zhì)時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞，該物質(zhì)包含一種與T細(xì)胞結(jié)合的配體和一種與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的配體，用來(lái)使逆轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)胞協(xié)同定位并提高細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的物質(zhì)是一種多肽，該多肽包含與T細(xì)胞結(jié)合的第一氨基酸序列和與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的第二氨基酸序列，第二氨基酸序列具有如下的序列
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly
Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val
Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln
Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr
Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala
Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Glu Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg
Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala
Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile
Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn
Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr；
或與之足夠相似以能顯示結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的能力的氨基酸序列。
全文摘要
一種提高逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞和其它細(xì)胞的效率的方法，該方法包括在存在纖連蛋白或纖連蛋白片段時(shí)感染細(xì)胞。纖連蛋白和纖連蛋白片段明顯增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞，特別是造血細(xì)胞包括定向祖細(xì)胞和初級(jí)造血干細(xì)胞。本發(fā)明還提供利用增強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)移造血細(xì)胞群體和用于增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的新型構(gòu)建體進(jìn)行體細(xì)胞基因治療的改進(jìn)方法及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101070548SQ200710104239
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期1996年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月29日
發(fā)明者D·A·威廉斯 申請(qǐng)人:印第安納大學(xué)研究及科技有限公司