本發(fā)明涉及一種以澤瀉醇B為天然活性化合物作為自噬誘導劑及其在治療糖尿病血管并發(fā)癥的應用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖尿病已經(jīng)成為現(xiàn)代人群常見的疾病之一，嚴重影響著人類健康和生活健康。糖尿病不僅體現(xiàn)在機體血糖的水平，更重要的是，糖尿病引發(fā)的血管并發(fā)癥已成為影響健康的重要原因。最新流行病學調(diào)查顯示，目前中國確診的糖尿病患者約為1.14億，糖尿病前期人群約為1.4億。而在糖尿病人群中，都或多或少存在一種或多種并發(fā)癥，如腎病、視網(wǎng)膜病變等。據(jù)研究顯示，糖尿病10年以上患者，存在并發(fā)癥的患者達到90％以上。糖尿病及其血管并發(fā)癥的防治已成為我國衛(wèi)生醫(yī)療事業(yè)的重要課題。

代謝紊亂是糖尿病及其血管并發(fā)癥的根本原因。目前有研究表明高糖血癥可視為細胞營養(yǎng)條件改變的狀態(tài)下，血管細胞、腎細胞、心肌細胞、視網(wǎng)膜細胞等細胞中營養(yǎng)敏感信號通路的改變引起代謝紊亂，導致高血糖導致的晚期糖基化終末產(chǎn)物的積聚、線粒體中活性氧物質(zhì)的過量等，可能是造成糖尿病血管并發(fā)癥的原因。

自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細胞的一種溶酶體依賴性蛋白降解過程，也是存在于真核生物細胞中的一種高度保守的保護性機制。通過吞噬自身細胞質(zhì)或細胞器以維持自身代謝所需和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬對多種疾病的發(fā)生具有保護作用，如：癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、肝病、糖尿病、糖尿病血管并發(fā)癥、腎病、自身免疫病及感染等。因此，自噬可能成為基于糖尿病及血管并發(fā)癥發(fā)病機制的新的預防和治療靶點，通過干預，可逆轉(zhuǎn)上述病理信號通路的改變，可以起到保護胰島細胞、腎臟、眼球等靶器官的作用。

澤瀉(Alisma orientalis)為多年沼生植物澤瀉科植物澤瀉的干燥塊莖，是中醫(yī)臨床常用中藥之一，具有利水、清濕熱和泄熱等功效，可用于治療小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛等病癥。近代藥理證明澤瀉具有抑制動脈粥樣硬化和活血化瘀的功效，以及利尿、降低血壓血糖和抗高血脂等作用。澤瀉醇B是澤瀉的主要三萜類成分，是澤瀉功效的主要活性成分。有報道顯示，澤瀉醇B可作為自噬誘導劑，用于腫瘤的治療中。但是，尚未將該化合物應用于糖尿病及血管并發(fā)癥的治療中。

本發(fā)明將為糖尿病及其血管并發(fā)癥提供一種有效的治療藥物，并將其應用于藥學領(lǐng)域。

附圖說明

圖1 MTT法檢測HK-2細胞存活率

圖2透射電鏡和免疫熒光檢測HK-2細胞自噬(A)以及LC3II半定量分析(B)

圖3 Western blot檢測HK-2細胞自噬水平

圖4 Western blot檢測HK-2細胞凋亡蛋白的相對表達水平

圖5 Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR通路水平

圖6澤瀉醇B對HUVEC細胞自噬水平的影響

圖7澤瀉醇B對心肌細胞自噬水平的影響

圖8澤瀉醇B對視網(wǎng)膜細胞自噬水平的影響

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療糖尿病及其血管并發(fā)癥的治療藥物，并將其應用于藥物開發(fā)中，該活性成為源于澤瀉或其他來源的澤瀉醇B。

所述的細胞為腎小管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞、視網(wǎng)膜細胞。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

1、采用透射電鏡、免疫熒光檢測、流式細胞儀、Western blot和免疫細胞化學檢實驗、q-PCR實驗充分證明了澤瀉醇B在誘導腎小管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞、視網(wǎng)膜細胞自噬中的作用。

2、本發(fā)明將誘導自噬活性化合物可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)方法，與多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。

本發(fā)明藥物具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明公開了澤瀉醇B對糖基化終末產(chǎn)物誘導的腎小管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞、視網(wǎng)膜細胞自噬作用。有研究表明自噬在細胞的穩(wěn)態(tài)和功能中起重要作用，主要體現(xiàn)在兩個方面：一方面在營養(yǎng)不足的情況下實現(xiàn)能量物質(zhì)再利用，另一方面在應激狀態(tài)下能清除構(gòu)型異常的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，并消化受損和多余的細胞器，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，澤瀉醇B可通過激活自噬來阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥靶器官的損傷。這種獨特的誘導功效的發(fā)現(xiàn)，將會使?jié)蔀a類藥物在糖尿病及血管并發(fā)癥治療中得到重要應用。

2、本發(fā)明以細胞自噬理論為背景，研究并闡明天然有效成分作用和機制，為開發(fā)糖尿病及血管并發(fā)癥防治藥物作用提供了靶點和策略。

3、本發(fā)明為糖尿病及其血管并發(fā)癥提供了新的治療候選藥物。

4、本發(fā)明的自噬誘導劑可加工成適宜劑型，如注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、丸劑、噴霧劑、乳劑、外用制劑，用于糖尿病及血管并發(fā)癥的治療。

具體實施方式

實施例1 MTT檢測HK-2細胞活力

1、儀器與試劑：

人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、CO₂細胞培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋、細胞培養(yǎng)超凈工作臺、低溫超速離心機、倒置顯微鏡、微量移液器、全自動酶標儀。

2、實驗方法

(1)HK-2細胞體外培養(yǎng)

用低糖DMEM+10％FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在溫度37℃、5％CO₂條件下生長至80％-90％匯合時進行細胞傳代。傾倒去除培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞1次，棄去PBS，根據(jù)培養(yǎng)面積加入適量0.1％胰酶溶液消化，37℃放置3～5min，并在倒置顯微鏡下觀察，待到絕大部分細胞變圓并懸浮后即加入培養(yǎng)基終止消化，吹吸幾次以離散成團的細胞，按1:3比例進行細胞傳代。傳代后的細胞24h后全數(shù)換液一次。

(2)MTT檢測HK-2細胞活力

取對數(shù)生長期的HK-2細胞，將其消化后調(diào)整到一定細胞濃度，均勻接種于96孔板上，在37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，吸棄培養(yǎng)基，分別加入含終濃度為1024μM、512μM、256μM、128μM、64μM、32μM、16μM、8μM和4μM、5％CO₂條件下培養(yǎng)48～96h后，每孔加入20μl(5mg/ml)MTT，在相同條件的澤瀉醇B和DMEM培養(yǎng)基100μl，將加完樣的96孔板置培養(yǎng)箱中于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)6h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，37℃恒溫振蕩10min，全自動酶標儀測定各孔OD值。細胞存活率計算公式如下：

3、實驗結(jié)果

用MTT法檢測不同濃度的細胞存活率(圖1)。給予不同濃度的澤瀉醇B，結(jié)果顯示HK-2細胞的存活率與澤瀉醇B呈濃度依賴關(guān)系，且ED50＝254.00±1.75μM。隨著澤瀉醇B濃度的增加(4-1024μM)，細胞的存活率逐漸降低(從99.82±14.94％到38.81±16.38％)。細胞存活率≥95％時，可保證藥物對細胞毒性較小，故本實驗選用32μM的澤瀉醇B(細胞存活率為95.71±17.59％作為后期的研究。

實施例2 透射電鏡和免疫熒光檢測HK-2細胞自噬

1、儀器與試劑：

人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、戊二醛、鋨酸、丙酮、包埋液、3％醋酸鈾-枸櫞酸鉛、吖啶橙染液、CO₂細胞培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋、細胞培養(yǎng)超凈工作臺、低溫超速離心機、透射電鏡、超薄切片機、倒置熒光顯微鏡。

2、實驗方法

(1)透射電鏡法檢測HK-2細胞自噬

按實施例1所述方法培養(yǎng)HK-2細胞，將處于對數(shù)生長期的HK-2細胞按2×10⁶個/瓶均勻接種到直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，過夜貼壁培養(yǎng)后，加入終濃度為32uM的澤瀉醇B，以未加藥物的細胞作為對照組。繼續(xù)于培養(yǎng)箱孵育24h，收集細胞，制成單細胞懸液，然后用預冷的PBS洗滌2次，然后緩慢加入預冷的2.5％的戊二醛4℃固定90min，用PBS漂洗后，再用1％鋨酸4℃固定30min,用PBS洗滌后，將細胞用連續(xù)梯度(10％為梯度，50—100％)的乙醇和純丙酮脫水，然后包埋于Epon812樹脂中，切片后用醋酸鈾-檸檬酸鉛染色在透射下觀察細胞的超顯微結(jié)構(gòu)。

(2)免疫熒光檢測HK-2細胞自噬

取對數(shù)生長期的HK-2細胞，將其消化后調(diào)整到一定細胞濃度，均勻接種于24孔板上，在37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)基，細胞給予200μg/ml AGEs處理，加入終濃度為32μM的澤瀉醇B，以未加藥物的細胞作為對照組。加藥處理時間結(jié)束后棄各孔中原有培養(yǎng)基，采用PBS洗滌2次，加入吖啶橙染液700μl染色40s，棄取吖啶橙染液，用PBS洗滌2次，加入700μl PBS，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。然后PS處理及分析實驗結(jié)果。

3、實驗結(jié)果

由圖2A所示，澤瀉醇B(32μM)與HK-2細胞共孵育24h后，能增加AGEs誘導的HK-2細胞形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。免疫熒光圖片可以觀察到綠色熒光強度明顯增強，同時LC3II半定量分析表明，與AGEs組相比，LC3II含量明顯增高(P<0.05)(圖2B)。

實施例3 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達

1、儀器與試劑

人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)；DDMEM(低糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、牛血清白蛋白(BSA)、組織蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、發(fā)光液(ECL)、SDS、麗春紅、PVDF膜；抗體：兔抗人LC3多克隆抗體、兔抗人Atg-5單克隆抗體、兔抗人Atg-12單克隆抗體、兔抗人Beclin-1單克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗、中性樹膠、蘇木素、DAB、乙醇、3％過氧化氫、培養(yǎng)皿、CO₂細胞培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋、細胞培養(yǎng)超凈工作臺、低溫超速離心機、倒置顯微鏡、微量移液器、SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜儀、點離機、雪花制冰機、全自動酶標儀、4000M化學發(fā)光成像系統(tǒng)、-80℃超低溫冰箱。

2、實驗方法

(1)Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達

細胞總蛋白的提?。簩⑻幱趯?shù)生長期的HK-2細胞均勻接種到96孔板中，過夜貼壁培養(yǎng)后，細胞給予200μg/ml AGEs處理，加入含有32μM的澤瀉醇B的新鮮培養(yǎng)液，同時設立對照(加等量的DMEM培養(yǎng)液)，培養(yǎng)一定時間后取出。棄培養(yǎng)液，加入4℃預冷的PBS清洗兩次，加入新鮮配制的蛋白裂解液，連同收集的懸浮細胞置于冰上裂解30min，用無菌細胞刮刀刮取細胞收集于1.5ml的無菌離心管中，4℃12000rpm離心10min，留取上清，分裝于0.2ml離心管中，-80℃保存。

BCA法測定總蛋白濃度：取適量的蛋白標準品，并在96孔板的第一排中按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入孔中，每個孔加磷酸鹽緩沖液(PBS)補足到20μl，最后再在每個孔里面加入BCA工作液：A+B液(A:B＝50:1)200ul,溫箱中放置半小時后在酶標儀上完成標準曲線的繪制；取5μl蛋白樣品溶液加入PBS15μl，最后每孔加入BCA工作液：A+B液(A:B＝50:1)液200μl，溫箱中放置半小時后96孔板放入酶標儀反應，反應后可讀取總蛋白的濃度。

SDS-PAGE電泳制備：

配分離膠：根據(jù)待測目的蛋白的分子量的大小而配置不同濃度的分離膠,吹打十余下后把分離膠分別加入安裝好的制膠槽內(nèi)，膠的高度最好離小玻璃板3cm左右，待加完膠后加入異丙醇，可以使分離膠平坦外還可以促進分離膠的凝固。30min后觀察發(fā)現(xiàn)分離膠已經(jīng)聚合則可以開始制備濃縮膠。

配濃縮膠：去掉分離膠上層封的異丙醇，最后用濾紙吸干凈，迅速放入剛剛制備的濃縮膠；然后兩邊同時插入梳子，這樣可以減少氣泡的混入。放置1.5h至凝膠完全聚合備用。

樣品上樣：將制備好的膠固定到電泳槽里面，倒入足夠的電泳液，將梳子拔出，取出處理好的樣品，按照樣品的順序依次加樣。蛋白上樣量為20μg，并加入蛋白上樣緩沖液。變性樣品點離后上樣跑SDS-PAGE膠。

垂直電泳：把樣品加入梳子所形成的的上樣孔后，調(diào)節(jié)電壓至50V恒壓，時間為30min，待樣品電泳至分離膠和濃縮膠的交界處時可以改變電泳條件，改為90V恒壓，電泳時間90min，使樣本在分離膠中迅速分離，待所需檢測的蛋白分子量的的條帶分離明顯并且溴酚藍帶將達到膠的底部時，停止電泳。

轉(zhuǎn)膜：將與分離膠大小一致的PVDF膜在含1×Transfer Buffer中浸泡15min，與分離膠、濾紙和海綿墊一起放入預冷的1×Transfer Buffer中浸泡5min。按照說明安裝轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：從負極到正極依次為海綿墊、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙和海綿墊。轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中(轉(zhuǎn)膜槽置冰水中)，恒壓90V轉(zhuǎn)膜1.5h。

鑒定轉(zhuǎn)膜效果：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后小心夾取PVDF膜，右上角做標記用來區(qū)分正反面，放入10×麗春紅溶液PBS稀釋9倍的溶液中，大約2min加去離子水漂洗，轉(zhuǎn)膜成功就可以看到PVDF膜上有一些大小不一的紅染的條帶。

封閉：用BSA封閉液將PVDF膜放置在封閉袋中，放在搖床上勻速搖蕩1h。

孵育一抗：去除封閉液，可與PBS清洗5次5min，然后將PVDF膜轉(zhuǎn)移到雜交袋中同時加入已經(jīng)稀釋好的一抗，封口后放到4℃的冰箱過夜。

洗一抗：第二天將雜交袋中的一抗回收，取出PVDF膜，放在干凈的盛有PBS-T的培養(yǎng)皿中，放置在搖床上，洗膜5次，每次5min。

孵育二抗：將洗過的膜再次放入雜交袋中，加入相應的稀釋好的二抗，封口后放置在搖床上勻速孵育1h,注意室溫不宜過高。

洗二抗：用PBS-T洗5次，每次5分鐘。

加ECL液：將膜放于顯影膜上，將PVDF膜的正面(吸附有蛋白質(zhì)的一面)朝上，把已混合好A液和B液的ECL液滴于PVDF膜上，包好顯影膜。

曝光：將上述處理好的顯影膜放在柯達化學發(fā)光成像儀中，調(diào)節(jié)曝光時間，成功后可以看到深淺不同的條帶。

掃描并分析結(jié)果：采用圖像分析軟件進行吸光度分析。以所測得的各指標的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

3、實驗結(jié)果

本實驗使用自噬相關(guān)指標LC3II/LC3I比值、Atg-5、Atg-12和Beclin-1來評價澤瀉醇B誘導的自噬。由圖3所示，與空白組相比，AGEs可抑制LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化，以及下調(diào)Atg-5、Atg-12和Beclin-1表達水平；與AGEs組相比，澤瀉醇B給藥組可顯著增加LC3II/LC3I比值、LC3、Atg-5、Atg-12和Beclin-1蛋白的表達水平(P<0.05)。結(jié)果說明，澤瀉醇B可提高AGEs誘導的HK-2細胞自噬的水平。

實施例4 Western blot和免疫細胞化學檢測凋亡相關(guān)蛋白表達

1、儀器與試劑：

人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、牛血清白蛋白(BSA)、組織蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、發(fā)光液(ECL)、SDS、麗春紅、PVDF膜；抗體：Bcl-2抗體、Bcl-xl抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗、中性樹膠、蘇木素、DAB、乙醇、3％過氧化氫、培養(yǎng)皿、CO₂細胞培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋、細胞培養(yǎng)超凈工作臺、低溫超速離心機、倒置顯微鏡、微量移液器、SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜儀、點離機、雪花制冰機、全自動酶標儀、4000M化學發(fā)光成像系統(tǒng)、-80℃超低溫冰箱。

2、實驗方法

實驗方法同實施例3。

3、實驗結(jié)果

細胞的凋亡與一系列的凋亡相關(guān)蛋白表達有關(guān)，如Bcl-2家族。Bcl-2和Bcl-xl是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白。圖4結(jié)果顯示：相比于模型組，澤瀉醇B給藥組細胞Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平都有顯著的提升(P<0.05)。結(jié)果表明，澤瀉醇B可通過上調(diào)Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平而抑制HK-2細胞凋亡。

實施例5 澤瀉醇B對腎小管上皮細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)表達

1、儀器與試劑

人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、牛血清白蛋白(BSA)、組織蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、發(fā)光液(ECL)、SDS、麗春紅、PVDF膜、抗體：PI3K、Akt、mTOR、兔抗人β-actin多克隆抗體；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗；中性樹膠；蘇木素、DAB、乙醇、3％過氧化氫、培養(yǎng)皿、CO₂細胞培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋、細胞培養(yǎng)超凈工作臺、低溫超速離心機、倒置顯微鏡、微量移液器、SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜儀、點離機、雪花制冰機、全自動酶標儀、4000M化學發(fā)光成像系統(tǒng)、-80℃超低溫冰箱。

2、實驗方法

實驗方法同實施例3。

3、實驗結(jié)果

圖5結(jié)果顯示：相比于空白組，澤瀉醇B給藥組中PI3K/Akt/mTOR通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白水平都存在顯著地降低(P<0.05)。結(jié)果表明，澤瀉醇B可抑制HK-2細胞的PI3K/Akt/mTOR通路。

實施例6 澤瀉醇B對人血管內(nèi)皮細胞自噬作用的影響

1、儀器與試劑

人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)；DMEM(低糖培養(yǎng)基)；胎牛血清；胰蛋白酶；PBS緩沖液；牛血清白蛋白(BSA)；組織蛋白裂解液；BCA蛋白濃度測定試劑盒；發(fā)光液(ECL)；SDS；麗春紅；PVDF膜；抗體：兔抗人LC3多克隆抗體、兔抗人Beclin-1單克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗；中性樹膠；蘇木素；DAB；乙醇；3％過氧化氫；培養(yǎng)皿；CO₂細胞培養(yǎng)箱；數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋；細胞培養(yǎng)超凈工作臺；低溫超速離心機；倒置顯微鏡；微量移液器；SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜儀；點離機；雪花制冰機；全自動酶標儀；4000M化學發(fā)光成像系統(tǒng)；-80℃超低溫冰箱。

2、實驗方法

(1)細胞培養(yǎng)及藥物處理

將處于對數(shù)生長期的HUVEC細胞均勻接種到96孔板中，過夜貼壁培養(yǎng)后，細胞豐度約為80％時，加入含有32μM的澤瀉醇B的新鮮培養(yǎng)液，同時設立對照(加等量的DMEM培養(yǎng)液)，培養(yǎng)一定時間后取出。棄培養(yǎng)液，加入4℃預冷的PBS清洗兩次，加入新鮮配制的蛋白裂解液，連同收集的懸浮細胞置于冰上裂解30min，用無菌細胞刮刀刮取細胞收集于1.5ml的無菌離心管中，4℃12000rpm離心10min，留取上清，分裝于0.2ml離心管中，-80℃保存。

(2)Western blotting

檢測和分析方法同實施例3。

3、實驗結(jié)果

本實驗使用自噬相關(guān)指標LC3II/LC3I比值、Atg-5和Beclin-1來評價澤瀉醇B對AGEs誘導的血管內(nèi)皮細胞HUVEC自噬紊亂的調(diào)節(jié)作用。由圖6所示，與AGEs組相比，澤瀉醇B給藥組中LC3II/LC3I比值、LC3、Atg-5、Atg-12和Beclin-1蛋白的表達水平均有顯著地提高(P<0.05)。結(jié)果說明，澤瀉醇B可上調(diào)AGEs誘導的HUVEC細胞自噬的能力。

實施例7 澤瀉醇B對人心肌細胞自噬作用的影響

1、儀器與試劑

人心肌細胞(H9C2)；DMEM(低糖培養(yǎng)基)；胎牛血清；胰蛋白酶；PBS緩沖液；牛血清白蛋白(BSA)；組織蛋白裂解液；BCA蛋白濃度測定試劑盒；發(fā)光液(ECL)；SDS；麗春紅；PVDF膜；抗體：兔抗人LC3多克隆抗體、兔抗人Beclin-1單克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗；中性樹膠；蘇木素；DAB；乙醇；3％過氧化氫；培養(yǎng)皿；CO₂細胞培養(yǎng)箱；數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋；細胞培養(yǎng)超凈工作臺；低溫超速離心機；倒置顯微鏡；微量移液器；SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜儀；點離機；雪花制冰機；全自動酶標儀；4000M化學發(fā)光成像系統(tǒng)；-80℃超低溫冰箱。

2、實驗方法

(1)細胞培養(yǎng)及藥物處理

將處于對數(shù)生長期的H9C2心肌細胞均勻接種到96孔板中，過夜貼壁培養(yǎng)后，細胞豐度約為80％時，加入含有32μM的澤瀉醇B的新鮮培養(yǎng)液，同時設立對照(加等量的DMEM培養(yǎng)液)，培養(yǎng)一定時間后取出。棄培養(yǎng)液，加入4℃預冷的PBS清洗兩次，加入新鮮配制的蛋白裂解液，連同收集的懸浮細胞置于冰上裂解30min，用無菌細胞刮刀刮取細胞收集于1.5ml的無菌離心管中，4℃12000rpm離心10min，留取上清，分裝于0.2ml離心管中，-80℃保存。

(2)Western blotting

檢測和分析方法同實施例3。

3、實驗結(jié)果

本實驗使用自噬相關(guān)指標LC3II/LC3I比值、Atg-5來評價澤瀉醇B對AGEs誘導的人心肌細胞H9C2的自噬。由圖7所示，與AGEs組相比，澤瀉醇B給藥組中LC3II/LC3I比值Atg-5蛋白的表達水平均有顯著地提高(P<0.05)。結(jié)果說明，澤瀉醇B可促進AGEs抑制的H9C2心肌細胞自噬的形成。

實施例8 澤瀉醇B對視網(wǎng)膜細胞自噬作用的影響

1、儀器與試劑:

人視網(wǎng)膜細胞(ARPE-19)；DMEM(低糖培養(yǎng)基)；胎牛血清；胰蛋白酶；PBS緩沖液；牛血清白蛋白(BSA)；組織蛋白裂解液；BCA蛋白濃度測定試劑盒；發(fā)光液(ECL)；SDS；麗春紅；PVDF膜；抗體：兔抗人LC3多克隆抗體、兔抗人Beclin-1單克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗；中性樹膠；蘇木素；DAB；乙醇；3％過氧化氫；培養(yǎng)皿；CO₂細胞培養(yǎng)箱；數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水浴鍋；細胞培養(yǎng)超凈工作臺；低溫超速離心機；倒置顯微鏡；微量移液器；SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜儀；點離機；雪花制冰機；全自動酶標儀；4000M化學發(fā)光成像系統(tǒng)；-80℃超低溫冰箱。

2、實驗方法

(1)細胞培養(yǎng)及藥物處理

將處于對數(shù)生長期的ARPE-19細胞均勻接種到96孔板中，過夜貼壁培養(yǎng)后，細胞豐度約為80％時，加入含有32μM的澤瀉醇B的新鮮培養(yǎng)液，同時設立對照(加等量的DMEM培養(yǎng)液)，培養(yǎng)一定時間后取出。棄培養(yǎng)液，加入4℃預冷的PBS清洗兩次，加入新鮮配制的蛋白裂解液，連同收集的懸浮細胞置于冰上裂解30min，用無菌細胞刮刀刮取細胞收集于1.5ml的無菌離心管中，4℃12000rpm離心10min，留取上清，分裝于0.2ml離心管中，-80℃保存。

(2)Western blotting

檢測和分析方法同實施例3。

3、實驗結(jié)果

本實驗使用自噬相關(guān)指標LC3II/LC3I比值、Atg-5和Beclin-1來評價澤瀉醇B對AGEs誘導的人視網(wǎng)膜細胞ARPE-19的自噬。由圖8所示，與AGEs組相比，澤瀉醇B給藥組中LC3II/LC3I比值、LC3、Atg-5和Beclin-1蛋白的表達水平均有顯著地提高(P<0.05)。結(jié)果說明，澤瀉醇B可引起AGEs抑制的ARPE-19細胞自噬的形成。