發(fā)明目的本發(fā)明涉及一種socs1衍生肽，所述socs1衍生肽可用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥，尤其是眼、腎、神經(jīng)和血管并發(fā)癥。所述糖尿病的眼部并發(fā)癥包括糖尿病性視網(wǎng)膜病和黃斑水腫?；趕ocs1衍生肽的神經(jīng)保護(hù)性，其除了對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病(其神經(jīng)變性起到基本作用)有效外，本發(fā)明(所述肽)被認(rèn)為對(duì)視網(wǎng)膜的其它疾病(例如獲得性或遺傳性視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病)也具有潛在的有效性。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種多發(fā)的系統(tǒng)性疾病，經(jīng)常導(dǎo)致一些器官病變，尤其是視網(wǎng)膜、腎臟、神經(jīng)和血管系統(tǒng)。糖尿病并發(fā)癥通常分為：a)急性并發(fā)癥，如低血糖，酮酸中毒和高滲性昏迷；b)慢性或晚期并發(fā)癥，又分為微血管并發(fā)癥(腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病)，大血管并發(fā)癥(心血管疾病)和糖尿病足(大血管和微血管病)。糖尿病的巨大社會(huì)健康影響是由于糖尿病的這些慢性并發(fā)癥，主要是眼部(視網(wǎng)膜病)，腎(腎病)和血管(動(dòng)脈粥樣硬化)并發(fā)癥。目前用于治療糖尿病的方法，例如嚴(yán)格地控制葡萄糖和高血壓，成功地阻止疾病的惡化，但是在許多情況下不能阻止慢性并發(fā)癥的發(fā)作，尤其在視網(wǎng)膜病、心血管疾病，或者患者發(fā)展為腎衰竭，甚至參與透析和移植方案。糖尿病足是糖尿病最常見的糖尿病并發(fā)癥之一，引起顯著的發(fā)病率和高截肢風(fēng)險(xiǎn)，并且其治療需要多學(xué)科方法。糖尿病性視網(wǎng)膜病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是全世界失明的主要原因之一。高血糖癥和與其直接相關(guān)的代謝途徑引起糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)病，并造成位于視網(wǎng)膜內(nèi)的毛細(xì)血管床的損傷(微血管病變)。糖尿病性視網(wǎng)膜病變通常被認(rèn)為是視網(wǎng)膜的微血管病變。然而，目前的證據(jù)表明，神經(jīng)變性是參與微血管病變的發(fā)展的糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)病的早期現(xiàn)象。目前對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病的初始階段沒有特定療法。此外，在疾病晚期階段采取的特定療法(激光凝固、玻璃體內(nèi)注射試劑例如抗-vegf-“血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子”抗體、腎上腺皮質(zhì)激素，或玻璃體切除術(shù))效力有限，且具有很高的副作用。因此，非侵入性治療方法對(duì)在初始階段(神經(jīng)變性)預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病是必要的。局部眼部給藥(滴眼劑)，因其非侵入性且能預(yù)防系統(tǒng)性副作用，將是最合適的給藥途徑。除了糖尿病性視網(wǎng)膜病之外，還存在伴隨視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的其他疾病，例如老年性黃斑變性(amd)、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病是指以漸進(jìn)性神經(jīng)元丟失為特征的視網(wǎng)膜病癥。schmidt等對(duì)這些疾病、其關(guān)鍵部位，以及可能的保護(hù)途徑和促使恢復(fù)的途徑進(jìn)行了深入分析。參見“neurodegenerativediseasesoftheretinaandpotentialfortheprotectionandrecovery”，currentneuropharmacology-2008，vol.no.6，pp.：164-178。在糖尿病性視網(wǎng)膜病中，神經(jīng)變性(有效神經(jīng)元的損失)發(fā)生在疾病的早期階段，并導(dǎo)致眼睛功能異常，例如辨色力和對(duì)比敏感度的喪失。這些改變可通過在糖尿病患者體內(nèi)，甚至是在患糖尿病低于兩年的患者體內(nèi)的電生理學(xué)研究來檢測(cè)，即可在微血管損傷之前在眼科檢查中進(jìn)行檢測(cè)。而且，延遲的多焦視網(wǎng)膜電圖潛伏時(shí)間(mferg-it)來預(yù)測(cè)早期微血管異常的發(fā)展。另外，神經(jīng)視網(wǎng)膜變性啟動(dòng)和/或激活的幾種代謝和信號(hào)通路，參與微血管病變過程和血液-視網(wǎng)膜屏障(brb)的破壞。brb是一種眼睛的結(jié)構(gòu)，它在視網(wǎng)膜的許多疾病中至關(guān)重要，特別地，它是糖尿病性視網(wǎng)膜病發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵因素。brb由內(nèi)部brb和外部brb組成。內(nèi)部brb由緊密的內(nèi)皮細(xì)胞連接而成。外部brb由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(rpe)組成，細(xì)胞之間也緊密連接。糖尿病性黃斑水腫是由brb的破壞而引起。amd是由于brb的破壞而導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫的另一種常見的視網(wǎng)膜疾病。并且，brb的破壞也發(fā)生在許多眼部情況中，例如葡萄膜炎、創(chuàng)傷、眼內(nèi)手術(shù)、血管視網(wǎng)膜病、遺傳性營(yíng)養(yǎng)不良等(cunha-vaz等，“theblood-retinalbarrierinretinaldisease”，europeanophthalmicreview-2009，vol.no.3，pp.:105-108)。近年來，研究者正在努力了解涉及糖尿病并發(fā)癥發(fā)展的分子機(jī)制，以及研究它們對(duì)糖尿病并發(fā)癥的治療潛力。jak/stat(januskinase/signaltransducersandactivatorsoftranscription)信號(hào)通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，高血糖及其他因素通過它促成糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展。jak/stat途徑控制許多細(xì)胞進(jìn)程，例如增殖、遷移和分化，以及炎癥介質(zhì)的表達(dá)。據(jù)稱，在粥樣斑塊中、在糖尿病患者的腎活檢中以及在視網(wǎng)膜病和糖尿病性腎病的動(dòng)物模型中中均有jak/stat途徑成員的表達(dá)和活化的增加。socs(suppressorsofcytokinesignaling，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物)蛋白家族是jak/stat途徑負(fù)調(diào)控的主要內(nèi)源性機(jī)制，并且其表達(dá)水平的改變與不同的免疫和炎性疾病相關(guān)。對(duì)socs蛋白家族成員遺傳修飾的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明，socs蛋白家族在胰腺β-細(xì)胞中的保護(hù)作用，降低了糖尿病的發(fā)病率(等，diabetes2003；52：2696-700)和相關(guān)的腎損傷(等，jamsocnephrol2010；21：763-72)以及抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)(等，arteriosclerthrombvascbiol2009；29：525-531；wesoly等，actabiochimpol2010；57(3)：251-260；liang等，intjmolmed.2013may；31(5)：1066-74)。表明了這些內(nèi)源性蛋白在糖尿病并發(fā)癥中的治療潛力。在之前的實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(多發(fā)性硬化模型)(mujtaba等，jimmunol2005；175：5077-5086；jager等，jneuroimmunol2011；232：108-118)以及外周神經(jīng)損傷模型(girolami等，expneurol2010；223：173-182)和痘病毒的病毒感染(ahmed等，jvirol2009；83：1402-1415)中已經(jīng)描述了socs蛋白模擬肽的使用。socs多肽也被描述為細(xì)胞因子誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑，特別是在炎癥和病毒或細(xì)菌感染中的抑制劑(us2009/0209458)。專利wo2010/151495描述了可用作抗病毒劑的socs-1或socs-3拮抗劑肽。專利文獻(xiàn)us8,420,096描述了含有socs1/socs3序列和膜轉(zhuǎn)位序列的可溶性肽及其在治療免疫疾病中的潛在應(yīng)用。專利us2009253618還描述了該類型肽在神經(jīng)元分化中的應(yīng)用。專利us2009030179使用這些肽socs-盒區(qū)域的幾種合成肽作為抗菌劑。盡管在該領(lǐng)域中存在研究，事實(shí)上已假定jak/stat信號(hào)傳導(dǎo)通路，socs蛋白和糖尿病之間存在關(guān)系，但是用于預(yù)防或治療糖尿病的眼部、腎或血管并發(fā)癥的肽自身的有效給藥方式，迄今尚未被描述。socs模擬肽與眼部疾病也不相關(guān)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)于socs1蛋白區(qū)域的多肽在治療糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)的糖尿病慢性并發(fā)癥中是有效的。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述多肽能有效治療視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病。因此，第一方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的分離多肽，所述多肽包括：a)序列seqidno2(dthfrtfrshadyrri)；或b)a)的序列的變異體，其基于所述序列的所有氨基酸的同一性，與seqidno2的同一性至少為85％；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。第二方面，本發(fā)明涉及一種包含有效治療量的第一方面所述的多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的組合物在預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥或視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病中的應(yīng)用；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。第三方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的分離多核苷酸，所述多核苷酸編碼：a)氨基酸序列seqidno2；或b)a)或b)的序列的變異體，其與序列seqidno2的同源性至少為85％；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。本發(fā)明另一方面是一種分離多肽在制備用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述多肽包含：a)序列seqidno2(dthfrtfrshadyrri)；或b)a)的序列的變異體，其基于所述序列的所有氨基酸的同一性，與seqidno2的同一性至少為85％；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的分離多核苷酸，所述多核苷酸編碼：a)氨基酸序列seqidno2；或b)a)的序列的變異體，其與序列seqidno2的同源性至少為85％；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。本發(fā)明也涉及一種分離多核苷酸在制備用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述多核苷酸編碼：a)氨基酸序列seqidno2；或b)a)的序列的變異體，其與序列seqidno2的同源性至少為85％；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。最后一方面，本發(fā)明涉及一種向患有糖尿病慢性并發(fā)癥和/或患有視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的患者施用有效治療量的第一方面所述的多肽的治療方法，所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。這些化合物可用作視網(wǎng)膜的局部神經(jīng)保護(hù)劑。必須指出的是，本發(fā)明所使用的肽的局部給藥方式，不僅能到達(dá)視網(wǎng)膜，而且還達(dá)到有效濃度，以預(yù)防糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)展。附圖說明圖1.糖尿病視網(wǎng)膜病變模型中血糖和體重的變化。(a)為整個(gè)研究中糖尿病視網(wǎng)膜病變模型的血糖水平示意圖，(b)為整個(gè)研究中糖尿病視網(wǎng)膜病變模型的體重示意圖。用抑制肽進(jìn)行處理不影響這些參數(shù)(血糖和體重)。圖2.socs1衍生肽的局部給藥(滴眼劑)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)激活的影響；基于用載體[d-sham]處理的糖尿病小鼠，用含有socs1衍生肽[d-socsm1s1]的滴眼劑處理的糖尿病小鼠以及非糖尿病小鼠[對(duì)照(db/+)]中，代表性樣品的視網(wǎng)膜中g(shù)fap(glialfibrillaracidicprotein，膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì))染色的測(cè)量來進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)激活量化。圖3.socs1衍生肽的局部給藥(滴眼劑)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。通過tunel(terminaltransferasedutpnick-endlabeling，末端轉(zhuǎn)移酶dutp缺口末端標(biāo)記)技術(shù)測(cè)定用載體[d-sham]處理的糖尿病小鼠，非糖尿病小鼠[對(duì)照(db/+)]以及用socs1衍生肽[d-socsm1s1]處理的糖尿病小鼠中，每組代表性小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。結(jié)果表示為平均值±sd。*：與其他組相比p<0.01。圖4.用socs1衍生肽的治療改善erg異常。(a)為實(shí)驗(yàn)組中a波振幅(上圖)和a波潛伏期(下圖)的示意圖。(b)為實(shí)驗(yàn)組中b波振幅(上圖)和b波潛伏期(下圖)的示意圖。圖5.用socs1衍生肽的治療阻止糖尿病引起的brb破壞。用載體[d-sham]處理的糖尿病小鼠和用socs1衍生肽[d-socsm1s1]處理的糖尿病小鼠中具有代表性的糖尿病小鼠，及非糖尿病小鼠[對(duì)照(db/+)]中評(píng)估的任意單位熒光(a.u.)中白蛋白外滲量。結(jié)果表示為平均值±sd。*：與其他組相比p<0.01。圖6.用socs1衍生肽的治療改善糖尿病小鼠中谷氨酸的代謝。(a)為任意單位熒光(a.u.)中g(shù)last免疫熒光值示意圖。結(jié)果表示為平均值±sd。(b)為實(shí)驗(yàn)組中通過uplc測(cè)定的視網(wǎng)膜中谷氨酸的濃度示意圖。結(jié)果表示為平均值±sd。*：與其他組相比p<0.001，**：與對(duì)照組相比p<0.01。圖7.socs1衍生肽降低糖尿病性視網(wǎng)膜病中炎癥基因的表達(dá)。采用rt-pcr測(cè)定用載體[d-sham]處理的糖尿病小鼠，非糖尿病小鼠(對(duì)照(db/+)以及用socs1衍生肽[d-socsm1s1]處理的糖尿病小鼠中il-1βmrna的表達(dá)量。結(jié)果表示為平均值±sd。*：與其他組相比p<0.05。rq:相對(duì)定量。圖8.socs1衍生肽抑制糖尿病小鼠腎臟中stat的激活。對(duì)糖尿病小鼠腎切片中磷酸化的stat1和stat3進(jìn)行免疫檢測(cè)。圖8顯示了腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)室的陽(yáng)性染色量。結(jié)果表示為平均值±sd。*：與對(duì)照組相比p<0.02。圖9.socs1衍生肽對(duì)糖尿病小鼠的腎保護(hù)作用。(a)為腎小球病變(hyper：細(xì)胞增生，mm：腎小球系膜，dil：毛細(xì)血管擴(kuò)張)，纖維化和腎小管變性(tub)及纖維化和間質(zhì)炎癥(int)的半定量評(píng)估示意圖。(b)為腎小球面積的形態(tài)學(xué)分析示意圖。(c)為pas+腎小球系膜面積的定量示意圖。結(jié)果表示為平均值±sd。*：與其他組相比p<0.05。圖10.socs1衍生肽阻止糖尿病性腎病的腎纖維化。(a)為糖尿病小鼠(對(duì)照和socs1)腎樣品中腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)室中膠原蛋白含量的定量分析示意圖。(b)為腎皮質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖連蛋白和i型膠原蛋白)，前纖維化因子(tgf-β)和腎小管病變標(biāo)記(kim-1)mrna表達(dá)的rt-pcr分析示意圖。結(jié)果表示為平均值±sd。*：與其他組相比p<0.05。圖11.socs1衍生肽對(duì)糖尿病腎臟的抗炎作用。(a)為糖尿病小鼠腎樣品中巨噬細(xì)胞(f4/80)和t-淋巴細(xì)胞(cd3)滲透的免疫過氧化物酶檢測(cè)。圖11a顯示了腎小球和腎小管間質(zhì)中的陽(yáng)性細(xì)胞量。(b)為腎皮質(zhì)中趨化因子(ccl2和ccl5)和tnfα細(xì)胞因子的mrna表達(dá)量的rt-pcr分析示意圖。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。*：與對(duì)照組比較p<0.05。圖12.mis1肽對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。(a)為糖尿病小鼠橫向主動(dòng)脈切片中粥樣斑塊的大小隨時(shí)間的變化示意圖。(b)為糖尿病小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變中炎癥內(nèi)含物(moma2巨噬細(xì)胞染色)和斑塊穩(wěn)定性標(biāo)記物(用天狼猩紅染色膠原纖維和用α-肌動(dòng)蛋白染色血管細(xì)胞)含量示意圖。*：與對(duì)照組比較p<0.05。圖13.socs1衍生肽及其無活性突變體對(duì)照的體外效果。(a)為在不同濃度的socs1衍生肽或突變肽存在下用細(xì)胞因子刺激的巨噬細(xì)胞中stat1和stat3的激活示意圖。(b)為巨噬細(xì)胞和vsmc中產(chǎn)生的ccl2趨化蛋白示意圖。c為巨噬細(xì)胞遷移分析示意圖。*：相對(duì)基線條件p<0.05；#：與細(xì)胞因子刺激相比p<0.05。具體實(shí)施方式如上所述，本發(fā)明的第一方面涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的分離多肽，所述多肽包括：a)序列seqidno2(dthfrtfrshadyrri)；或b)a)的序列的變異體，其基于所述序列的所有氨基酸的同一性，與seqidno2的同一性至少為85％；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。本發(fā)明中提及的任何序列，尤其是seqidno1，seqidno2和seqidno3中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被修飾，例如它們可以被磷酸化。根據(jù)一些具體的實(shí)施方式，所述序列中僅一個(gè)氨基酸被修飾，優(yōu)選為磷酸化。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方方式，磷酸化的氨基酸為酪氨酸(y)。本發(fā)明中，用語(yǔ)“％的同一性”或“至少％相同”是指氨基酸序列之間，通過以下方法測(cè)定的同一性的百分比：兩個(gè)氨基酸序列的比對(duì)通過https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/提供的服務(wù)，應(yīng)用該服務(wù)的默認(rèn)調(diào)整。因此，例如，seqidno1為本發(fā)明所定義的seqidno序列的變異體。本發(fā)明中，用語(yǔ)“糖尿病慢性并發(fā)癥”應(yīng)理解為包括但不限于眼，腎，神經(jīng)和血管的并發(fā)癥或病癥，用語(yǔ)“血管”應(yīng)理解為包括心血管和腦血管的并發(fā)癥。具體地，其包括選自糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病和糖尿病性血管病(包括微血管病和大血管病，例如糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病)的并發(fā)癥。因此，本發(fā)明所述肽用于預(yù)防或治療選自糖尿病患者的眼，腎，神經(jīng)和心血管并發(fā)癥或病癥的糖尿病慢性并發(fā)癥。因此，在一些特定的實(shí)施方式中，糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，糖尿病慢性并發(fā)癥為眼部疾病，特別為糖尿病性視網(wǎng)膜病。本發(fā)明所述肽還可用于治療視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病。本發(fā)明中，用語(yǔ)“視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病”應(yīng)理解為包括由于神經(jīng)膠質(zhì)炎癥(神經(jīng)膠質(zhì)激活或反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生)而存在的眼部疾病。所述神經(jīng)膠質(zhì)炎癥是由于視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡而導(dǎo)致的進(jìn)行性神經(jīng)元死亡，特別是光感受器，其可導(dǎo)致失明。所述疾病包括但不限于糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式，所述疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病，青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病為糖尿病性視網(wǎng)膜病構(gòu)成的組。本發(fā)明中，用語(yǔ)“神經(jīng)保護(hù)”應(yīng)理解為包括但不限于可以使用的任何類型的預(yù)防性治療或方法，使得形成神經(jīng)視網(wǎng)膜的神經(jīng)元保持在對(duì)應(yīng)于健康受試者動(dòng)物(包括人)的生理狀態(tài)。“神經(jīng)視網(wǎng)膜”是視網(wǎng)膜的神經(jīng)感覺部分，并且負(fù)責(zé)視覺周期。特別地，本發(fā)明“用于局部治療和/或預(yù)防”的肽，應(yīng)理解為包括但不限于用于眼睛的局部治療和/或預(yù)防，特別是視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病，選自糖尿病性視網(wǎng)膜病，青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方式，序列seqidno2的變異體與seqidno2的同一性至少為90％，甚至更優(yōu)選約為94％；其位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，例如序列seqidno2中一個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸取代，或者向序列seqidno2添加一個(gè)氨基酸。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方式，該變異體可以是seqidno1(dthfrtfrshsdyrri)。因?yàn)樵撔蛄性诓溉閯?dòng)物中高度保守，因此其它哺乳動(dòng)物，如褐家鼠、大猩猩、家兔、黑猩猩、蘇門答臘猩猩、荷蘭豬或野豬，也均具有seqidno1或seqidno2。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，該序列seqidno2或其具有如上所述的百分比同一性的變異體，與細(xì)胞通透性區(qū)域結(jié)合。所述細(xì)胞通透性區(qū)域可以選自不同的通透性序列，通常是小的陽(yáng)離子或疏水性肽，例如tat(seqidno4：ygrkkrrqrrr)、antp(seqidno5：rqikiwfqnrrmkw)、ptd-5(seqidno6：rrqrrtsklmkr)、seqidno7：8k(k＝lys)和seqidno8：6r(r＝arg)。更優(yōu)選地，細(xì)胞通透性區(qū)域?yàn)橘嚢彼?棕櫚酸酯區(qū)域。甚至更優(yōu)選地，細(xì)胞通透性區(qū)域結(jié)合在seqidno2或其同一性變異體的氨基末端。包含上述提到的序列或以如上定義的相同變異序列的任意多肽，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。然而，根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述多肽主要由以下組成：a)序列seqidno2；或b)a)的序列的變異體，其基于所述序列的所有氨基酸的同一性，與seqidno2的同一性至少為85％。特別地，變異序列由序列seqidno1組成。本發(fā)明中，用語(yǔ)“主要由...組成”是指所定義的序列或其同源序列最多包含8個(gè)額外的氨基酸(換句話說，最多50％以上)，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，最多7、6、5、4、3、2或1個(gè)額外的氨基酸，獨(dú)立地與所述序列的氨基末端，羧基末端或序列的任何位點(diǎn)結(jié)合，成為序列的一部分。在之前的任何情況下，所述序列可能會(huì)也可能不會(huì)與如上定義的細(xì)胞通透性區(qū)域結(jié)合。根據(jù)一些具體的實(shí)施方式，所述多肽由序列seqidno2組成，其可能會(huì)也可能不會(huì)與如上定義的細(xì)胞通透性區(qū)域結(jié)合。在多肽用于糖尿病患者的眼部并發(fā)癥或用于視網(wǎng)膜變性疾病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病的情況下，根據(jù)一些具體的實(shí)施方式，含有seqidno2的序列或其如上定義的相同變異序列的多肽主要由以下組成或?yàn)椋篴)小鼠socs1蛋白[uniprot(universalprotein)：o35716]；b)人socs1蛋白(uniprot：o15524)；或c)a)或b)的序列的變異體，其與小鼠socs1蛋白的氨基酸序列或人socs1蛋白的氨基酸序列的同源性至少為85％。與前述的任何具體實(shí)施方式一樣，人或小鼠的socs1蛋白，或其相同變異體中的至少一個(gè)氨基酸可被修飾，優(yōu)選為磷酸化。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，磷酸化的氨基酸或磷酸化氨基酸之一為酪氨酸(y)。同樣，前述定義的socs1蛋白可以結(jié)合到細(xì)胞通透性區(qū)域，優(yōu)選結(jié)合到棕櫚酸酯-賴氨酸團(tuán)體上。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，細(xì)胞通透性區(qū)域結(jié)合在多肽的n末端，細(xì)胞通透性區(qū)域更優(yōu)選為棕櫚酸酯-賴氨酸團(tuán)體。所述至少85％同一性的變異體包括其他哺乳動(dòng)物的socs1蛋白，例如褐家鼠、大猩猩、家兔、黑猩猩、蘇門答臘猩猩、荷蘭豬或野豬。根據(jù)具體的實(shí)施方式，人或小鼠socs1序列的變異序列與所述序列至少90％相同，甚至更優(yōu)選約94％相同。本發(fā)明第一方面所指示的所有優(yōu)選實(shí)施例也可應(yīng)用于本發(fā)明的其余方面，下面將詳細(xì)提供。本發(fā)明另一方面是一種分離多肽在制備用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述多肽包含：a)序列seqidno2(dthfrtfrshadyrri)；或b)a)的序列的變異體，其基于所述序列的所有氨基酸的同一性，與seqidno2的同一性至少為85％；所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病，糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，其涉及包含治療有效量的根據(jù)上述任何一方面所述的多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的組合物在預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥或視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病中的應(yīng)用；根據(jù)上述定義，其中，所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；其中，所述視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病變、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物適用于或旨在用于預(yù)防或治療糖尿病患者的眼部疾病和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病，優(yōu)選糖尿病性視網(wǎng)膜病。它還可以用于其他的視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病，例如，青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。因此，根據(jù)一些具體實(shí)施方式，所述載體或賦形劑是適于眼部給藥的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明所述組合物包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。用語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑”是指與本發(fā)明所述肽一起施用的分子物質(zhì)或?qū)嶓w。所述的載體或賦形劑將適合于所選的給藥途徑，并且根據(jù)給藥途徑所述載體或賦形劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。所述載體可以是無菌液體，例如水或油，包括來自石油、動(dòng)物、植物或合成來源的賦形劑、崩解劑、潤(rùn)濕劑或稀釋劑。例如在e.w.martin的“remington'spharmaceuticalsciences”中記載了合適的載體和賦形劑，通過引用并入本文。本發(fā)明所述的組合物可以通過任何已知的途徑給藥，包括口服、胃腸道、非腸道、直腸，或通過呼吸途徑和局部給藥，特別是眼部給藥。同樣地，組合物可以含有對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其它合適的活性成分或佐劑。同樣地，組合物可以僅含有本發(fā)明所述的單一多肽或本發(fā)明所述的兩種或更多種多肽。在眼部給藥的情況下，載體或賦形劑必須適合于這種給藥途徑。在這種情況下，所述組合物適宜以藥學(xué)上可接受的眼用堿溶液或載體制備成溶液或水性懸浮液。在這種情況下，除了活性成分之外，本發(fā)明所述多肽可以含有其它佐劑，例如抗微生物劑、防腐劑、螯合劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、ph調(diào)節(jié)劑、緩沖溶液、增稠劑等。當(dāng)受試者在檢測(cè)到功能異常(即，色差，對(duì)比敏感性和視網(wǎng)膜異常)時(shí)，在糖尿病性視網(wǎng)膜病的早期階段接受有助于視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)的化合物(例如本發(fā)明所述肽)，則可以預(yù)防疾病。因此，如果能保護(hù)視網(wǎng)膜免受慢性高血糖的影響，則可以使其主要并發(fā)癥最小化或甚至可以預(yù)防其發(fā)作，但是這需要實(shí)際改善糖尿病患者的生活質(zhì)量。此外，所述肽防止brb的破壞。肽的局部眼部給藥表現(xiàn)出真正的優(yōu)勢(shì)，可阻止更積極的治療。糖尿病性視網(wǎng)膜病早期階段治療的真是優(yōu)勢(shì)是預(yù)防額外的并發(fā)癥，即微動(dòng)脈瘤、微出血、硬滲出物、黃斑水腫和新生血管。本發(fā)明組合物中，含有的肽濃度為1-12mg/ml。在眼部給藥的特定情況下，組合物中至少含有5mg/ml的肽，在特定的實(shí)施方式中，其至少包含8mg/ml、9mg/ml或10mg/ml；在優(yōu)選的實(shí)施方式，肽的濃度為10mg/ml±5％，即10mg/ml±0.5mg/ml。在腹膜內(nèi)給藥的特定情況下，組合物中含有1-5mg/ml的肽，在特定的實(shí)施方式中，其含有1-3mg/ml的肽；在優(yōu)選的實(shí)施方式，肽的濃度為2mg/ml±10％或±5％，即2mg±0.2mg/ml或±0.1mg/ml。本發(fā)明的組合物適于每只眼睛每天施用10-200μg的肽。在具體的實(shí)施方式中，肽的日劑量為30-70μg/眼；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽的日劑量為40-60μg/眼，優(yōu)選45-55μg/眼。在腹膜內(nèi)或口服給藥的情況下，所述組合物適于每天施用1-16mg肽/kg患者或受試者的重量，在具體的實(shí)施方式中，日劑量為2-10mg肽/kg患者或受試者的重量，優(yōu)選2.5-3.5mg肽/kg患者或受試者的重量。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的分離多核苷酸，所述多核苷酸編碼：a)氨基酸序列seqidno2；或b)a)或b)的序列的變異體，其與序列seqidno2的同源性至少為85％；根據(jù)上述定義，所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜的神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方式，用于預(yù)防或治療糖尿病慢性并發(fā)癥和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病的分離多核苷酸編碼：a)結(jié)合到賴氨酸基團(tuán)的氨基酸序列seqidno2；或b)與賴氨酸基團(tuán)結(jié)合的a)的序列的變異體，其與氨基酸序列seqidno2的同一性至少為85％；根據(jù)上述定義，所述糖尿病慢性并發(fā)癥選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑水腫、糖尿病性腎病、糖尿病性血管病、糖尿病性微血管病、糖尿病性大血管病、糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病足和外周動(dòng)脈疾病構(gòu)成的組；所述視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病選自由糖尿病性視網(wǎng)膜病、青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎構(gòu)成的組。上述多核苷酸適于局部用于或旨在局部用于預(yù)防或治療前述疾病。優(yōu)選地，上述多核苷酸適于用于或旨在用于預(yù)防或治療糖尿病患者的眼部疾病和/或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病，更優(yōu)選用于預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病。本發(fā)明的一系列非限制性的、說明性的實(shí)施例如下。實(shí)施例材料和方法多肽：合成對(duì)應(yīng)于小鼠socs1蛋白“激酶抑制區(qū)”序列的16個(gè)氨基酸的肽(seqidno1：dthfrtfrshsdyrri，aspthrhispheargthrpheargserhisserasptyrargargile)，肽序列的n-末端(殘基d，天冬氨酸)結(jié)合于細(xì)胞通透性區(qū)域(賴氨酸-棕櫚酸酯)，其中酪氨酸(y)被磷酸化。在實(shí)施例中，由seqidno1和棕櫚酸酯-賴氨酸基團(tuán)形成的衍生肽稱為mis1或d-socsmis1。在一些情況下，后者與熒光標(biāo)記物綴合使得能夠在組織和細(xì)胞中進(jìn)行隨后的追蹤。同樣，還合成了用a(ala)取代f(phe)的非功能性突變肽(mut)：seqidno3，dthartarshsdyrri，aspthrhisalaargthralaargserhisserasptyrargargile；非功能性突變肽同樣結(jié)合到賴氨酸-棕櫚酸酯細(xì)胞通透性區(qū)域，用作實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。將上述合成的肽溶解(<1％dmso的鹽水溶液)并過濾除菌。動(dòng)物：使用兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，具體為2型糖尿病(db/db小鼠)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?型糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在apoe小鼠中注射鏈脲佐菌素)。將小鼠關(guān)在控制溫度(20℃)和濕度(60％)條件的標(biāo)準(zhǔn)尺寸籠中，12小時(shí)的光照/黑暗循環(huán)，并且隨意獲得食物(標(biāo)準(zhǔn)飲食)和水。這些研究依據(jù)西班牙在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用、保護(hù)和護(hù)理方面的法律(皇家法令53/2013)，遵循eec建議(86/609/eec)和arvo(associationforresearchinvisionandophthalmology)建議，并且之前已經(jīng)由兩個(gè)參與機(jī)構(gòu)(iis-fundaciónjiménezdíaz/universidadautónomademadridandinstitutderecercahospitaluniversitarivalld'hebron)的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。用socs1衍生肽的眼部局部治療法來治療由糖尿病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)變性將mis1肽以滴眼劑的形式滴加于8周齡糖尿病小鼠(db/db)的眼中(每只眼滴5μl；10mg/ml；每天兩次，持續(xù)15天；n＝7只小鼠)。用非功能肽mut(n＝7)、載體處理的糖尿病小鼠，及非糖尿病小鼠(db/+)作為對(duì)照。利用微量吸管將滴眼劑直接滴加在每只眼睛角膜的上表面。整個(gè)研究期間控制小鼠的體重和血糖(比色測(cè)定)。在第15天，小鼠解剖前約2小時(shí)滴加含mis1肽或載體的滴劑。利用頸脫位將小鼠安樂死后，立即將摘出的眼冷凍，并切下8mm的背腹部切片用于視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)分析和其他免疫組織化學(xué)分析。根據(jù)其它研究中所述的方法(bogdanov等人，plosone.2004；9:e97302)，通過gfap(膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì))免疫熒光評(píng)價(jià)神經(jīng)膠質(zhì)激活。將固定切片封閉(1％bsa和10％山羊血清的pbs溶液，室溫下2小時(shí))，并與抗gfap抗體(稀釋度1:500，4℃下16小時(shí))一起溫育，然后與第二抗體(alexa488山羊抗兔，稀釋1:200)一起溫育，然后將切片樣品安裝在共聚焦顯微鏡下分析并與hoesch對(duì)比。用相同的參數(shù)獲取糖尿病和對(duì)照樣品的圖像，并且以0至5的等級(jí)分析gfap標(biāo)記的形貌分布(anderson等人clinophthalmol2008；2(4)：801-16)。得分1表示不存在神經(jīng)膠質(zhì)激活(gfap的陽(yáng)性免疫熒光限于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層)，而得分5表示最大神經(jīng)膠質(zhì)激活(gfap的免疫熒光從神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層延伸到外核層的外邊緣)。使用先前描述的方法(bogdanov等人，plosone.2004；9：e97302)，通過tunel(terminaltransferasedutpnick-endlabeling；熒光試劑盒)免疫組織化學(xué)測(cè)定細(xì)胞凋亡，隨后在熒光顯微鏡下量化。室溫下，將視網(wǎng)膜切片在新鮮制備的20μg/ml蛋白酶k溶液中孵育5分鐘使視網(wǎng)膜切片透化，然后使用綠色熒光[alexafluor594山羊-抗兔(invitrogen)(在pbs中稀釋1:200)]鑒定凋亡細(xì)胞。采用熒光顯微法在450-565nm(例如，488nm)的激發(fā)波長(zhǎng)下評(píng)估視網(wǎng)膜切片的細(xì)胞凋亡，在515-565nm(綠色)的激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)視網(wǎng)膜切片的細(xì)胞凋亡。結(jié)果表示為使用imagej軟件獲得的tunel陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)于hoestchst染色細(xì)胞的百分比。評(píng)估谷氨酸代謝以研究mis1肽產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制。通過超高效液相色譜(uplc)(acquity-uplc，waters)的masstrak氨基酸系統(tǒng)測(cè)定谷氨酸濃度。通過免疫熒光評(píng)價(jià)glast(glutamate/aspartatetransporter，谷氨酸酯/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體)。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟并在一系列(濃度)遞增的乙醇中再水化。然后將切片在酸性甲醇(-20℃)中固定1分鐘，并用ph7.4的0.01m磷酸緩沖鹽溶液(pbs)洗滌。之后，回收抗原，將切片浸沒在抗原回收溶液(10mm檸檬酸鈉，ph6.0)中，并在加壓罐中150℃加熱4分鐘。室溫下將切片在封閉溶液(0.5％bsa和10％山羊血清的pbs溶液)中孵育1小時(shí)。然后將切片與兔抗glast一抗(1:200，abcam)在4℃溫育過夜；在pbs中洗滌一次后，室溫下將切片與alexa488山羊抗兔二抗[1:200，molecularprobes(分子探針)]溫育1小時(shí)。將切片在pbs中洗滌，用hoechst(1:500，sigma-aldrich)復(fù)染，并置于具有蓋玻片的熒光封固介質(zhì)(prolong，invitrogen)中。使用imagej軟件通過激光共聚焦顯微鏡(olympusfluoviewtmfv1000共聚焦顯微鏡，hamburg，德國(guó))定量測(cè)定glast免疫熒光。評(píng)價(jià)il-1β，tnf-α和il-6的表達(dá)。根據(jù)制造商的說明書，用dna酶消化的rneasyminikit(rneasy迷你試劑盒，qiagen，由izasa，巴塞羅那，西班牙分銷)提取總rna。提取的rna(1μg)使用隨機(jī)六核苷酸引物和appliedbiosystems試劑(appliedbiosystems，madrid，spain)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體積為20μl。實(shí)時(shí)pcr在具有sybrgreensupermix的abiprism7000序列檢測(cè)系統(tǒng)(perkin-elmerappliedbiosystems；madrid，spain)中進(jìn)行。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，且每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照。人的s18作為內(nèi)源基因表達(dá)的對(duì)照。采用δδct方法獲得il-1β，tnf-α和il-6表達(dá)的相對(duì)定量(rq)。利用適應(yīng)黑暗的麻醉小鼠(12小時(shí)過夜)進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖(erg)記錄。使用microniiifocalerg系統(tǒng)(phoenixresearchlabs，pleasanton，ca)測(cè)量焦視網(wǎng)膜電圖(ferg)記錄。使用安裝在focalerg上的小鼠角膜晶狀體中的電極，放置在頭部眼睛之間的參考電極和放置在尾部中的接地電極來進(jìn)行記錄。此外，為了確保所有中心視網(wǎng)膜都被刺激，將光刺激投射在光盤上，并且使用最大可用光斑(直徑為1.5mm)。在20ms白光刺激下記錄兩只眼的erg反應(yīng)。白光刺激的強(qiáng)度為800、3200和12800cd·s·m-2，并且對(duì)每個(gè)強(qiáng)度進(jìn)行平均6-10次連續(xù)閃光。放大erg信號(hào)，濾過的帶在0.5和1000hz之間，并且用labscribe-2軟件(bioseb，vitrolles，france)分析，來計(jì)算如iscev(internationalsocietyofclinicalelectrophysiologyofvision)所推薦的a波和b波振幅及a波和b波隱含期(marmor等人docophtalmol108：107a144)。從開始到安樂死前一天進(jìn)行erg記錄。用socs1衍生肽的眼部局部治療法來治療由糖尿病引起的brb的破壞8周齡糖尿病小鼠(db/db)接受滴眼劑形式的mis1肽(每只眼滴5μl；10mg/ml；每天兩次，持續(xù)15天；n＝7只小鼠)。用載劑(n＝7)處理的糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠(db/+)(n＝7)作為對(duì)照。在整個(gè)研究期間控制小鼠的體重和血糖(比色測(cè)定)，在第15天通過頸脫位法將小鼠安樂死。通過測(cè)定白蛋白的滲透性來評(píng)價(jià)brb的破壞。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟并在一系列漸進(jìn)的乙醇中再水化，然后將切片在酸性甲醇(-20℃)中固定1分鐘，并用ph7.4的0.01m磷酸緩沖鹽溶液(pbs)洗滌。室溫下將切片在封閉溶液(2.5％干，脫脂乳)中溫育30分鐘，然后將切片與山羊抗人血清白蛋白的一抗(1:500，abcam)在4℃溫育過夜；在pbs中洗滌一次后，室溫下將切片與alexa594驢抗山羊二抗(1:200，molecularprobes)溫育1小時(shí)；將切片在pbs中洗滌，用hoechst(1:500，sigma-aldrich)復(fù)染色，并置于具有蓋玻片的熒光封固介質(zhì)(prolong，invitrogen)中。通過激光共聚焦顯微鏡(olympusfluoviewtmfv1000共聚焦顯微鏡，hamburg，germany)分析白蛋白的免疫熒光。用socs1衍生肽的腹膜內(nèi)治療法來治療由糖尿病引起的腎病和動(dòng)脈粥樣硬化通過鏈脲霉素注射(125mg/kg重量的10mm檸檬酸鹽，ph4.5，連續(xù)兩天)使8周齡的載脂蛋白e(apoe)缺陷的雄性小鼠患糖尿病。2周后，將血糖大于350mg/dl的小鼠隨機(jī)分成兩組(每組n＝9只小鼠)：處理組小鼠(mis1肽：65μg/天，200μl，腹膜內(nèi)給藥，每2天一次，連續(xù)8周)和對(duì)照組小鼠(載體)。在整個(gè)研究期間控制小鼠的體重和血糖(比色測(cè)定)。研究結(jié)束時(shí)，麻醉的小鼠用鹽水灌注并處死，然后立即處理組織。在腎皮質(zhì)(石蠟切片，5μm)中，通過pas和masson三色染色法研究腎小球和腎小管間質(zhì)形態(tài)學(xué)，并且采用雙盲和半定量方式以0-3的尺度(評(píng)分)評(píng)價(jià)病變。通過picro-sirius紅染色測(cè)定腎纖維化和通過免疫組織化學(xué)測(cè)定滲透炎癥細(xì)胞(f4/80+巨噬細(xì)胞和cd3+t淋巴細(xì)胞)。在主動(dòng)脈中，根/弓區(qū)(從瓣膜8μm延伸至1000μm的系列冰凍切片)用油紅o/蘇木精染色，并且量化動(dòng)脈粥樣硬化病變的面積(metamorph程序)。通過使用picro-sirius紅和α-肌動(dòng)蛋白免疫熒光的膠原纖維染色來評(píng)估斑塊穩(wěn)定性。通過單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(moma2)的免疫組織化學(xué)測(cè)定炎癥組分。通過imagepro-plus程序定量陽(yáng)性染色。通過常規(guī)商業(yè)試劑盒測(cè)定血清(糖化血紅蛋白，膽固醇和肌酐)和尿液(白蛋白和肌酐)中的生化參數(shù)。體外研究使用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)raw264.7巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vsmc)。將細(xì)胞同步化(無血清24小時(shí))，然后與不同濃度的肽(mis1或其對(duì)照，50-150μg/ml)預(yù)溫育90分鐘，并用細(xì)胞因子(ifnγ103u/ml；il-u/ml)刺激。通過磷酸化的stat1/stat3亞型的蛋白質(zhì)印跡分析stat激活。通過elisa測(cè)定jak/stat途徑依賴性趨化因子(ccl2)的表達(dá)。通過mtt比色法分析細(xì)胞活力，并通過趨化實(shí)驗(yàn)分析巨噬細(xì)胞遷移。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表示為每組的全部小鼠和至少3種獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用graphpadprism(anova，tukey和studentt檢驗(yàn)；p<0.05的顯著性)程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例1：本發(fā)明所述肽對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的影響在2型糖尿病模型(db/db小鼠)中局部給予滴眼劑形式的mis1肽(50μg，5μl/眼，每天兩次)15天。小鼠的體重和葡萄糖水平的變化如圖1所示。用gfap標(biāo)記物測(cè)量神經(jīng)膠質(zhì)激活(圖2)。如所預(yù)期的，非糖尿病小鼠[(對(duì)照(db/+)]中g(shù)fap的表達(dá)主要限于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(gcl)(圖2)。用載體[d-sham]治療的糖尿病小鼠比根據(jù)年齡匹配的非糖尿病小鼠顯示出更顯著的gfap表達(dá)。因此，100％的糖尿病小鼠顯示gfap評(píng)分≥3。socs1衍生肽的兩周給藥導(dǎo)致反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生顯著減少，并且用socs1衍生肽[d-socsmis1]處理的小鼠的gfap評(píng)分均≤3(圖2)。糖尿病小鼠[d-sham]視網(wǎng)膜層(onl，inl和gcl)中凋亡細(xì)胞的百分比與在相同年齡的非糖尿病小鼠[對(duì)照(db/+)]視網(wǎng)膜中觀察到的相比顯著更大(圖3)。用socs1衍生肽[d-socsmis1]治療的糖尿病小鼠顯示出比用載體[d-sham]治療的糖尿病小鼠顯著更低的凋亡率。在用socs1衍生肽[d-socsmis1]治療的糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠之間，沒有觀察到凋亡細(xì)胞百分比的差異。socs1衍生肽的治療降低了由糖尿病誘導(dǎo)的a波和b波振幅的減少，同時(shí)也降低了a波和b波潛伏期的增加(圖4)。glast是由müller細(xì)胞表達(dá)的主要谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它負(fù)責(zé)至少將50％的谷氨酸攝入哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜(圖6a，上圖)。用載體[d-sham]治療的糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中g(shù)last含量降低，用socs1衍生肽[d-socsm1s1]治療的糖尿病小鼠中g(shù)last含量沒有降低(圖6a，下圖)。視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酸水平降低，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖6b)。因此，在mis1肽是視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)劑的機(jī)制中，必須指出mis1肽阻止谷氨酸的增加和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glast的減少。此外，mis1肽阻止由糖尿病誘導(dǎo)的il-1β的增加(圖7)。必須指出，該細(xì)胞因子在糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用?？傊?，在糖尿病小鼠中以滴眼劑形式施用mis1肽阻止了視網(wǎng)膜神經(jīng)變性，其通過與接受mut肽或載體的組相比，gfap膠質(zhì)蛋白染色和凋亡的顯著減少(約80％)來確定。socs1衍生肽的神經(jīng)保護(hù)作用也通過視網(wǎng)膜(erg)的功能檢查來證明。這些結(jié)果表明，本發(fā)明所述肽可用于治療呈現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的其它疾病，例如青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎。像糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)變性，這些疾病的特征在于存在神經(jīng)膠質(zhì)炎癥和由凋亡引起的進(jìn)行性神經(jīng)元死亡。實(shí)施例2：本發(fā)明所述肽對(duì)血液-視網(wǎng)膜屏障滲透性的影響在2型糖尿病模型(db/db小鼠)中以滴眼劑(50μg，5μl/眼，每天兩次)的形式局部施用mis1肽15天。小鼠的體重和葡萄糖水平的變化如圖1所示。通過測(cè)量白蛋白外滲來評(píng)價(jià)血管通透性。與對(duì)照小鼠[對(duì)照(db/+)]相比，用載體[d-sham]處理的db/db小鼠中觀察到更大的白蛋白外滲。用socs1衍生肽mis1的處理阻止了db/db小鼠中白蛋白的外滲[d-socsm1s1](圖5)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明所述肽可用于治療糖尿病性黃斑水腫，因?yàn)樗鎏悄虿⌒渣S斑水腫的病理是由于血液-視網(wǎng)膜屏障的破壞使流體(水和溶液；最豐富的溶質(zhì)是白蛋白)滲出到血管外中。本發(fā)明所述的socs1衍生肽能夠阻止血液-視網(wǎng)膜屏障的破壞。實(shí)施例3：本發(fā)明所述肽對(duì)糖尿病小鼠腎病和動(dòng)脈粥樣硬化斑形成的影響在1型糖尿病模型(鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的apoe小鼠)中用mis1肽(65μg/天，每2天一次)進(jìn)行8周的系統(tǒng)治療。表1顯示了研究結(jié)束時(shí)糖尿病小鼠的臨床和代謝參數(shù)。從表1可知，所有糖尿病小鼠顯示出等效水平的高血糖(葡萄糖、糖化血紅蛋白(hba1c)和膽固醇)，表明所述肽的保護(hù)作用不是由于對(duì)糖尿病小鼠血糖的潛在控制。mis1肽的治療也顯著改善糖尿病小鼠的腎功能，觀察到白蛋白水平降低28％。此外，采用mis1肽治療組的小鼠中由慢性糖尿病引起的體重沒有顯著減輕。糖尿病小鼠腎切片的組織學(xué)分析顯示，與接受載體治療的糖尿病小鼠相比，采用mis1肽治療組的糖尿病小鼠腎臟中stat1和stat3激活得到降低(圖8)，同時(shí)腎小球病變(hyper：細(xì)胞增生，mm：腎小球系膜，dil：毛細(xì)血管擴(kuò)張)和腎小管間質(zhì)病變(萎縮，退化和滲透)也得到改善(圖9)。mis1肽顯著減少腎小管間質(zhì)纖維化(圖10)和炎癥淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞滲透(圖11)。在另一系列實(shí)驗(yàn)中研究了采用mis1肽治療的糖尿病小鼠的抗動(dòng)脈粥樣硬化性質(zhì)。用油紅o/蘇木精染色的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及其隨后的量化，顯示用mis1肽治療的糖尿病小鼠中損傷的大小和延伸得到顯著降低(與接受載體的對(duì)照組相比減少50％；圖12a)。斑塊組合物的分析顯示，經(jīng)治療的小鼠中損傷部位的巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)含有較高的膠原蛋白和血管細(xì)胞(圖12b)。表明mis1肽的治療減少了糖尿病小鼠體內(nèi)的炎癥并改善了糖尿病小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的穩(wěn)定性。表1：1型糖尿病小鼠的代謝和腎臟數(shù)據(jù)參數(shù)對(duì)照socs1體重(g)21.3±0.921.9±0.6血糖(mg/dl)528±12549±29糖化血紅蛋白(ug/ml)470±74503±76總膽固醇(mg/dl)583±19611±59低密度脂蛋白膽固醇(mg/dl)557±19597±61高密度脂蛋白膽固醇(mg/dl)12±111±1甘油三脂(mg/dl)72±589±23天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(u/l)226±16176±20丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(u/l)106±697±17腎臟體質(zhì)量比(mg/g)20.5±1.116.4±1.3(p<0.05)血清肌酐(mg/dl)0.40±0.040.24±0.04(p<0.02)尿蛋白/肌酐比值(ug/umol)22.6±1.416.2±61.1(p<0.01)實(shí)施例4：體外研究小鼠巨噬細(xì)胞和小鼠血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)物(圖13)用于體外研究。在兩種細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中，用促炎細(xì)胞因子ifnτ和il-6誘導(dǎo)刺激jak/stat途徑的活化。巨噬細(xì)胞與濃度增加(50-150ug/ml)的抑制性肽mis1的預(yù)溫育以劑量依賴性方式減少stat1和stat3的激活(通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)定兩種蛋白質(zhì)的磷酸化水平確定)。相反，相似劑量的mut肽(150ug/ml)不引起任何效果，因此證實(shí)了抑制性肽mis1的特異性。類似地，在免疫熒光圖像中可以看到，mis1肽阻止了vsmc中stat1和stat3的激活。通過分析單核細(xì)胞趨化蛋白ccl2(其表達(dá)取決于jak/stat途徑)的分泌，來測(cè)定mis1肽抑制的功能結(jié)果。與抑制性肽mis1預(yù)溫育，但不與mut肽預(yù)溫育，在vsmc和巨噬細(xì)胞中均顯著降低(30-40％)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ccl2產(chǎn)生。最后，通過趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制性肽mis1在巨噬細(xì)胞中的抗遷移效應(yīng)。在任何研究的實(shí)驗(yàn)條件下，沒有觀察到vsmc和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力的變化，這表明在所用濃度下肽的無毒性。實(shí)施例5：提供的數(shù)據(jù)可以外推到人類的理由用于本發(fā)明實(shí)施例的小鼠和細(xì)胞模型為醫(yī)學(xué)和制藥部門接受的允許將通過使用其獲得的數(shù)據(jù)外推至人類疾病的模型。一方面，載脂蛋白e基因缺陷小鼠的特征在于膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能不足，導(dǎo)致在脂肪和外周組織中具有高脂質(zhì)和膽固醇積聚的全身性高膽固醇血癥。這種小鼠模型自發(fā)地發(fā)展(以加速的方式，如果它被喂養(yǎng)脂肪膳食)成動(dòng)脈粥樣硬化病變，具有類似于人類損傷的一些特征。因此，它是心血管研究中最廣泛使用的模型之一。其次，apoe小鼠中1型糖尿病的誘導(dǎo)是結(jié)合高血糖和高脂血癥(在這些病理學(xué)中的兩個(gè)危險(xiǎn)因素)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停⑶揖哂杏捎谔悄虿?dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和腎病的快速發(fā)展的特征。最后，db/db小鼠的特征在于瘦素受體缺陷，其為4-8周齡的2型糖尿病和肥胖小鼠的自發(fā)發(fā)展結(jié)果，隨后的視網(wǎng)膜神經(jīng)變性過程與糖尿病患者糖尿病性視網(wǎng)膜病變初始階段非常相似。當(dāng)前第1頁(yè)12