背景技術(shù)：
：尸胺是參與產(chǎn)生多種產(chǎn)物的平臺化合物。尸胺可以通過微生物中的賴氨酸的脫羧作用合成。賴氨酸脫羧酶是通過從賴氨酸去除羧基來催化產(chǎn)生尸胺的酶。例如，在大腸桿菌(e.coli)中，尸胺是通過兩種賴氨酸脫羧酶多肽cada和ldcc直接從l-賴氨酸生物合成的。目前改良賴氨酸生產(chǎn)和賴氨酸衍生產(chǎn)物如尸胺生產(chǎn)的方法聚焦于參與細(xì)胞代謝的蛋白質(zhì)的過表達(dá)或弱化。然而，迄今為止獲得的產(chǎn)量仍不滿意。因此，需要獲得更高尸胺產(chǎn)量的新技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及賴氨酸脫羧酶多肽，其包含選自如下的氨基酸序列、由選自如下的氨基酸序列組成或者基本上由選自如下的氨基酸序列組成：seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)ldc的突變體)及其片段，及seqidno:2的片段(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段)，其中所述突變體或片段與seqidno:2具有至少95％序列相同性。在某些實施方案中，seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)可包含seqidno:2的氨基酸序列或其片段、由seqidno:2的氨基酸序列或其片段組成或基本上由seqidno:2的氨基酸序列或其片段組成，所述seqidno:2的氨基酸序列或其片段包含選自如下的一個或多個突變：在氨基酸位置287處突變?yōu)閤1的突變，在氨基酸位置398處突變?yōu)閤2的突變，在氨基酸位置436處突變?yōu)閤3的突變，在氨基酸位置507處突變?yōu)閤4的突變，及在氨基酸位置607處突變?yōu)閤5的突變；x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；條件是x1不是賴氨酸，x2不是蘇氨酸，x3不是精氨酸，x4不是苯丙氨酸，及x5不是苯丙氨酸。在某些實施方案中，seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)可包含選自如下的氨基酸序列、由選自如下的氨基酸序列組成或者基本上由選自如下的氨基酸序列組成：seqidno:5(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287e)，seqidno:7(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398s)，seqidno:9(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436g)，seqidno:11(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l)及seqidno:13(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607y)。本發(fā)明的另一方面涉及非天然存在的dna多核苷酸，其包含一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、由一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成或者基本上由一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成，其中所述賴氨酸脫羧酶核苷酸序列與seqidno:1或seqidno:3具有至少95％序列相同性，并且其中所述多核苷酸編碼本文描述的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽。在某些實施方案中，非天然存在的dna多核苷酸可包含選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段，及seqidno:1的片段(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段)，其中所述賴氨酸脫羧酶核苷酸序列與seqidno:1或seqidno:3具有至少95％序列相同性，并且其中所述多核苷酸編碼一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽，其包含選自如下的氨基酸序列、由選自如下的氨基酸序列組成或者基本上由選自如下的氨基酸序列組成：seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段。在某些實施方案中，seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)可包含seqidno:3的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1)或其片段、由seqidno:3的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1)或其片段組成或者基本上由seqidno:3的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1)或其片段組成。在某些實施方案中，seqidno:3的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列包含選自如下的一個或多個突變：在核苷酸位置859處突變?yōu)閦1的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)閦2的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)閦3的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)閦4的突變，及在核苷酸位置1820處突變?yōu)閦5的突變；z1、z2、z3、z4和z5各自獨立地選自腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)，條件是z1不是a，z2不是c，z3不是c，z4不是c或t，及z5不是t。在某些實施方案中，seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)包含選自如下的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、由選自如下的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成或者基本上由選自如下的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成：seqidno:4(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g)，seqidno:6(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g)，seqidno:8(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g)，seqidno:10(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g)及seqidno:12(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a)。本發(fā)明的另一方面涉及包含如本文描述的dna多核苷酸的表達(dá)質(zhì)粒載體，及在宿主細(xì)胞中能自主復(fù)制的骨架質(zhì)粒，其中所述表達(dá)質(zhì)粒載體用于賴氨酸衍生產(chǎn)物的生產(chǎn)。本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)化體，其包含在宿主細(xì)胞中的如本文描述的一個或多個表達(dá)質(zhì)粒載體。本發(fā)明的另一方面涉及突變宿主細(xì)胞，其包含整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中的如本文描述的dna多核苷酸。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)如本文描述的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽的方法，其中所述方法包括獲得本文描述的突變宿主細(xì)胞和/或本文描述的轉(zhuǎn)化體，將所述突變宿主細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)化體在使得所述一種或多種多肽有效表達(dá)的條件下培養(yǎng)，及收獲所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)尸胺(1,5-戊二胺)的方法，包括1a)培養(yǎng)本文描述的突變宿主細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)化體；1b)使用得自步驟1a的培養(yǎng)物使賴氨酸脫羧而生產(chǎn)尸胺；及1c)使用得自步驟1b的培養(yǎng)物提取并純化尸胺。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)尸胺(1,5-戊二胺)的方法，包括獲得如本文描述的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽及使用所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽使賴氨酸脫羧而生產(chǎn)尸胺。附圖簡述圖1：表中示出在下面的實施例章節(jié)中描述的用于產(chǎn)生構(gòu)建體的引物。圖2：表中示出本文描述的菌株、質(zhì)粒、酶、基因、啟動子和核糖體結(jié)合位點(rbs)脫氧核糖核酸(dna)序列。圖3：分批發(fā)酵結(jié)果。將菌株ln20(白色)和cib60(黑色)使用分批發(fā)酵進(jìn)行生長，并檢測培養(yǎng)物將賴氨酸-hcl轉(zhuǎn)化為尸胺的能力。在每個時間點取樣以測量od600(方框)、葡萄糖(圓形)及活性(三角形)。圖4：補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果。將菌株ln24以補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)行生長，并檢測培養(yǎng)物將賴氨酸-hcl轉(zhuǎn)化為尸胺的能力。在每個時間點取樣以測量od600(白色方框)及活性(黑色菱形)。圖5：分批發(fā)酵結(jié)果。將ln24(黑色)和ln3014(白色)使用分批發(fā)酵進(jìn)行生長，并檢測培養(yǎng)物將賴氨酸-hcl轉(zhuǎn)化為尸胺的能力。在每個時間點取樣以測量od600(方框)、葡萄糖(圓形)及活性(三角形)。圖6：補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果。將菌株ln3014以補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)行生長，并檢測培養(yǎng)物將賴氨酸-hcl轉(zhuǎn)化為尸胺的能力。在每個時間點取樣以測量od600(白色方框)及活性(白色三角形)。發(fā)明詳述如下描述提供了徹底理解及能夠?qū)嵤┍景l(fā)明實施方案的具體詳細(xì)描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解不借助于這些詳細(xì)描述也可以實施本發(fā)明。在其它情況中，未詳細(xì)示出或描述熟知的結(jié)構(gòu)和功能以避免不必要的模糊關(guān)于本發(fā)明實施方案的描述。產(chǎn)酸克雷伯氏菌(k.oxytoca)是一種革蘭氏陰性棒狀細(xì)菌。產(chǎn)酸克雷伯氏菌e718基因組序列含有產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶基因ldc，其編碼賴氨酸脫羧酶多肽產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc。如本文所用，產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的核苷酸序列被稱作“產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc”、“l(fā)dc”、“產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc多核苷酸”或者“產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc核苷酸序列”，其具有seqidno:1的核苷酸序列。如本文所用，產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc多肽被稱作“產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc”、“l(fā)dc”、“產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc多肽”或者“產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白質(zhì)”，其具有seqidno:2的氨基酸序列。本發(fā)明的一方面涉及賴氨酸脫羧酶多肽，其包含選自如下的氨基酸序列、由選自如下的氨基酸序列組成或者基本上由選自如下的氨基酸序列組成：seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段，其中所述突變體或片段與seqidno:2具有至少95％序列相同性。在某些實施方案中，seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)或其片段因此與seqidno:2可具有至少大約90％、至少大約91％、至少大約92％、至少大約93％、至少大約94％、至少大約95％、至少大約96％、至少大約97％、至少大約98％、至少大約99％、大約90％～99.999％、大約91％～99.999％、大約92％～99.999％、大約93％～99.999％、大約94％～99.999％、大約95％～99.999％、大約96％～99.999％、大約97％～99.999％、大約98％～99.999％或者大約99％～99.999％的序列相同性。如本文所用，術(shù)語“大約”是指在指定數(shù)值或數(shù)值范圍的5％或10％內(nèi)。在某些實施方案中，seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)可包含含有一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列、由包含一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成或者基本上由包含一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成。seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)可包含在seqidno:2內(nèi)的一個或多個氨基酸的一個或多個缺失、取代、添加和/或插入，其中seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)提供了與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc基本相同的賴氨酸脫羧酶活性(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比具有大約80％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比大約90％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比大約95％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比大約97％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc對比大約99％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；或者與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc對比大約100％或更高的賴氨酸脫羧酶活性)。優(yōu)選的seqidno:2突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于：seqidno:5(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287e)，seqidno:7(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398s)，seqidno:9(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436g)，seqidno:11(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l)和seqidno:13(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607y)。另外的seqidno:2突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于包含如下的氨基酸序列、由如下的氨基酸序列組成或者基本上由如下的氨基酸序列組成：包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2：在氨基酸位置287處突變?yōu)閤1的突變，在氨基酸位置398處突變?yōu)閤2的突變，在氨基酸位置436處突變?yōu)閤3的突變，在氨基酸位置507處突變?yōu)閤4的突變，在氨基酸位置607處突變?yōu)閤5的突變；seqidno:5的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287x1)；seqidno:7的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398x2)；seqidno:9的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436x3)；seqidno:11的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507x4)；及seqidno:13的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607x5)。x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，條件是x1不是賴氨酸，x2不是蘇氨酸，x3不是精氨酸，x4不是苯丙氨酸，以及x5不是苯丙氨酸。如本文所用，同源多肽與指定的多肽序列可具有至少大約90％、至少大約91％、至少大約92％、至少大約93％、至少大約94％、至少大約95％、至少大約96％、至少大約97％、至少大約98％、至少大約99％、大約90％～99.999％、大約91％～99.999％、大約92％～99.999％、大約93％～99.999％、大約94％～99.999％、大約95％～99.999％、大約96％～99.999％、大約97％～99.999％、大約98％～99.999％或者大約99％～99.999％的序列同源性。在某些實施方案中，如本文所用，多肽的片段提供了與該片段從中衍生的完整未突變多肽基本相同的功能。在這些實施方案中，產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段或者產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體具有與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc或者其從中衍生的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的突變體基本相同的功能(例如賴氨酸脫羧酶活性)。本發(fā)明的另一方面涉及dna多核苷酸，其包含本文描述的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、由本文描述的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成或者基本上由本文描述的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成。在某些實施方案中，dna多核苷酸可包含選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：seqidno:1(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段，其中所述賴氨酸脫羧酶核苷酸序列與seqidno:1或seqidno:3具有至少95％序列相同性，并且其中所述多核苷酸編碼一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽，其包含選自如下的氨基酸序列、由選自如下的氨基酸序列組成或者基本上由選自如下的氨基酸序列組成：seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段。在某些實施方案中，所述賴氨酸脫羧酶多肽、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc和產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體與前文描述的相同。當(dāng)存在多個多肽時，每個多肽可以是相同或不同的，所述一種或多種多肽可以單獨表達(dá)或者作為融合蛋白表達(dá)。優(yōu)選的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:5(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287e)，seqidno:7(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398s)，seqidno:9(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436g)，seqidno:11(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l)及seqidno:13(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607y)。另外的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于包含如下的氨基酸序列、由如下的氨基酸組成或者基本上由如下的氨基酸序列組成的突變體：包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2：在氨基酸位置287處突變?yōu)閤1的突變，在氨基酸位置398處突變?yōu)閤2的突變，在氨基酸位置436處突變?yōu)閤3的突變，在氨基酸位置507處突變?yōu)閤4的突變，在氨基酸位置607處突變?yōu)閤5的突變；seqidno:5的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287x1)；seqidno:7的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398x2)；seqidno:9的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436x3)；seqidno:11的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507x4)；及seqidno:13的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607x5)。x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，條件是x1不是賴氨酸，x2不是蘇氨酸，x3不是精氨酸，x4不是苯丙氨酸，以及x5不是苯丙氨酸。在某些實施方案中，所述dna多核苷酸序列可包含選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段，及seqidno:1的片段(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段)。seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)在包含seqidno:1或seqidno:3的核苷酸序列中可包括一個或多個核苷酸的一個或多個缺失、取代、添加和/或插入，而由所述核苷酸序列編碼的賴氨酸脫羧酶多肽提供了與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc基本相同的功能(即由產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體編碼的賴氨酸脫羧酶多肽與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比具有大約80％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比具有大約90％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc對比具有大約95％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比具有大約97％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比具有大約99％或更高的賴氨酸脫羧酶活性；或者與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc相比具有大約100％或更高的賴氨酸脫羧酶活性)。在某些實施方案中，seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)或其片段與seqidno:1或seqidno:3可具有至少大約90％、至少大約91％、至少大約92％、至少大約93％、至少大約94％、至少大約95％、至少大約96％、至少大約97％、至少大約98％、至少大約99％、大約90％～99.999％、大約91％～99.999％、大約92％～99.999％、大約93％～99.999％、大約94％～99.999％、大約95％～99.999％、大約96％～99.999％、大約97％～99.999％、大約98％～99.999％或者大約99％～99.999％的序列相同性。seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于seqidno:1(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的核苷酸序列，其已經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1，seqidno:3)且其編碼seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的氨基酸序列。其它的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于這樣的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列，其編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列。編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的優(yōu)選的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:4(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g)，seqidno:6(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g)，seqidno:8(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g)，seqidno:10(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g)和seqidno:12(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a)。編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的另外的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于：包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)閦1的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)閦2的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)閦3的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)閦4的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閦5的突變，和/或這些突變的任意組合；包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或者基本上包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)間(鳥嘌呤)的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)間或a(腺嘌呤)的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閍的突變，和/或這些突變的任意組合；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859z1或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859z1)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193z2或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193z2)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306z3或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306z3)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521z4或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521z4)；及產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820a或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820z5或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820z5)。z1、z2、z3、z4和z5各自獨立地選自a、g、c(胞嘧啶)和t(胸腺嘧啶)，條件是z1不是a，z2不是c，z3不是c，z4不是c或t，以及z5不是t。如本文所用，同源核苷酸序列與指定的核苷酸序列可具有至少大約90％、至少大約91％、至少大約92％、至少大約93％、至少大約94％、至少大約95％、至少大約96％、至少大約97％、至少大約98％、至少大約99％、大約90％～99.999％、大約91％～99.999％、大約92％～99.999％、大約93％～99.999％、大約94％～99.999％、大約95％～99.999％、大約96％～99.999％、大約97％～99.999％、大約98％～99.999％或大約99％～99.999％的同源性。在某些實施方案中，所述dna多核苷酸可以是重組或非天然存在的多核苷酸。在某些實施方案中，所述dna多核苷酸可以是cdna。在某些實施方案中，所述dna多核苷酸可以通過密碼子優(yōu)化獲得以用于在特定微生物(例如大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌(h.alvei)或產(chǎn)酸克雷伯氏菌)中的最佳多肽表達(dá)。如本文所用，核苷酸序列、多肽和dna分子不限于功能區(qū)，可包括表達(dá)抑制區(qū)、編碼區(qū)、前導(dǎo)序列、外顯子、內(nèi)含子和表達(dá)盒中的至少一個(見例如papadakisetal.,"promotersandcontrolelements:designingexpressioncassettesforgenetherapy,"currentgenetherapy(2004),4,89-113)。而且，核苷酸序列或多核苷酸可包括雙鏈dna或者單鏈dna(即組成雙鏈dna的有義鏈和反義鏈)，或者核糖核酸(rna)。含有核苷酸序列的多核苷酸可包括該核苷酸序列的片段和/或突變體。核苷酸序列的片段是指核苷酸序列的一部分，其編碼提供與完整多核苷酸編碼的多肽基本相同功能的多肽。核苷酸序列的突變體的例子包括天然存在的等位基因突變體，人工突變體，及通過在所述核苷酸序列中缺失、取代、添加和/或插入一個或多個核苷酸獲得的核苷酸序列。應(yīng)理解這種核苷酸序列的片段和/或突變體編碼與原始核苷酸序列編碼的多肽具有基本相同功能的多肽。例如，產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段和/或突變體編碼與產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc具有基本相同功能(即賴氨酸脫羧酶活性)的多肽。密碼子優(yōu)化是可用于通過增加感興趣基因的翻譯效率使生物體中蛋白質(zhì)表達(dá)最大化的一種技術(shù)。不同的生物體由于突變傾向和天然選擇而通常示出對于編碼相同氨基酸的一些密碼子之一的特殊偏好性。例如，在快速生長的微生物如大腸桿菌中，優(yōu)化密碼子反映出其各自的基因組trna庫的組成。因此，在快速生長的微生物中，氨基酸的低頻率密碼子可以用用于相同氨基酸的但高頻率的密碼子置換。因此，優(yōu)化的dna序列的表達(dá)在快速生長的微生物中得以改良。見例如http://www.guptalab.org/shubhg/pdf/shubhra_codon.pdf關(guān)于密碼子優(yōu)化技術(shù)的綜述，將其全部內(nèi)容并入本文作參考。如本文所提供，多核苷酸序列可以是經(jīng)密碼子優(yōu)化的，以用于在特定微生物中的最佳多肽表達(dá)，所述微生物包括但不限于大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌。在某些實施方案中，核苷酸序列的突變體可得自核苷酸序列的密碼子優(yōu)化，以降低其g和c核苷酸含量用于改良的蛋白質(zhì)表達(dá)。如果大約50％或以上的堿基是g或c，則認(rèn)為該基因組是gc富集的。感興趣的核苷酸序列中的高gc含量可導(dǎo)致mrna中形成二級結(jié)構(gòu)，這可導(dǎo)致中斷的翻譯及較低水平的表達(dá)。因此，將編碼序列中的g和c殘基改變?yōu)閍和t殘基而不改變氨基酸可提供更高水平的表達(dá)。在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含一個或多個核糖體結(jié)合位點(rbs)dna核苷酸序列。如本文所用，rbsdna核苷酸序列可稱作“rbsdna”、“rbsdna序列”、“rbsdna核苷酸序列”或者“rbsdna多核苷酸序列”。rbs是在信使rna(mrna)中發(fā)現(xiàn)的一個rna序列，核糖體可與其結(jié)合并起始翻譯。在原核生物中，rbs被稱作shine-dalgarno序列，位于待翻譯的rna序列起始密碼子的上游。rbs序列中的突變在原核生物中可減少或增加翻譯。本發(fā)明提供的rbsdna核苷酸序列具有與rbs序列相同的堿基序列，除了在rbs序列的rna序列中的尿嘧啶(u)由胸腺嘧啶(t)置換。例如，如果rbs序列是“ggagau”，則相應(yīng)的rbsdna核苷酸序列是“ggagat”。如在下文實施例中示出，產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其突變體從不同rbs序列的表達(dá)導(dǎo)致不同水平的尸胺生產(chǎn)活性(見實施例7)。如下文實施例7提供，質(zhì)粒puc18-koldc-co1-pbad含有位于產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1序列上游的rbsdna核苷酸序列“ggagat”(rbsdna-1，seqidno:14)。制備rbsdna文庫用于篩選導(dǎo)致尸胺生產(chǎn)增加的用于產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白表達(dá)的最佳rbs序列。與含有rbsdna核苷酸序列rbsdna-1(seqidno:14)的質(zhì)粒相比，具有突變的rbsdna核苷酸序列的至少5個質(zhì)粒當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌k12中時產(chǎn)生更高水平的尸胺。含有rbsdna核苷酸序列“tggagg”(rbsdna-5，seqidno:18)的質(zhì)粒(pln637)產(chǎn)生最高的尸胺產(chǎn)量(見實施例7)。如本文提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自如下的一個或多個rbsdna核苷酸序列：seqidno:14(即rbsdna-1)，seqidno:15(即rbsdna-2)，seqidno:16(即rbsdna-3)，seqidno:17(即rbsdna-4)，seqidno:18(即rbsdna-5)和seqidno:19(即rbsdna-6)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述一個或多個rbsdna核苷酸序列可包含seqidno:18(即rbsdna-5)、由seqidno:18(即rbsdna-5)組成或者基本上由seqidno:18(即rbsdna-5)組成。在某些實施方案中，所述rbsdna核苷酸序列可位于seqidno:1的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段以及seqidno:1(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的突變體及其片段的上游。如本文所提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自如下的一個或多個啟動子核苷酸序列：seqidno:20(即plac啟動子序列)，seqidno:21(即pbad啟動子序列)及seqidno:22(即ptac啟動子序列)。啟動子是起始dna轉(zhuǎn)錄的dna區(qū)域。啟動子位于被轉(zhuǎn)錄的dna的上游。在某些優(yōu)選實施方案中，所述一個或多個啟動子核苷酸序列可包含seqidno:21(即pbad啟動子序列)、由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成或者基本上由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成。在某些實施方案中，所述啟動子核苷酸序列可位于seqidno:1的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)或其片段及seqidno:1(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的突變體或其片段的上游。當(dāng)dna多核苷酸包含一個或多個rbsdna核苷酸序列及一個或多個啟動子核苷酸序列時，所述一個或多個啟動子核苷酸序列可位于賴氨酸脫羧酶核苷酸序列和rbsdna核苷酸序列的上游。本發(fā)明的另一方面涉及表達(dá)質(zhì)粒載體，其包含如下多核苷酸、由如下多核苷酸組成或者基本上由如下多核苷酸組成：包含選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、由選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成或基本上由選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成的dna多核苷酸：seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段，及seqidno:1的片段(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段)，其中所述賴氨酸脫羧酶核苷酸序列與seqidno:1或seqidno:3具有至少95％序列相同性，及其中所述多核苷酸編碼一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽，該多肽包含選自如下的氨基酸序列、由選自如下的氨基酸序列組成或者基本上由選自如下的氨基酸序列組成：seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段；及能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的骨架質(zhì)粒，其中所述表達(dá)質(zhì)粒載體用于生產(chǎn)賴氨酸衍生產(chǎn)物。所述dna多核苷酸、賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其突變體和片段、賴氨酸脫羧酶多肽、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其突變體和片段與前文描述的相同。當(dāng)存在多個多肽時，每個多肽可以相同或不同，所述一個或多個多肽可以單獨表達(dá)或者作為融合蛋白表達(dá)。seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于seqidno:1(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的核苷酸序列，其已經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1，seqidno:3)，且其編碼seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的氨基酸序列。其它的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于賴氨酸脫羧酶核苷酸序列，其編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列。編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的優(yōu)選的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:4(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g)，seqidno:6(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g)，seqidno:8(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g)，seqidno:10(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g)和seqidno:12(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a)。編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的另外的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)閦1的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)閦2的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)閦3的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)閦4的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閦5的突變，和/或其任意組合；包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)間(鳥嘌呤)的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)間或a(腺嘌呤)的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閍的突變，和/或其任意組合；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859z1或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859z1)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193z2或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193z2)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306z3或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306z3)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521z4或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521z4)；及產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820a或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820z5或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820z5)。z1、z2、z3、z4和z5各自獨立地選自a、g、c(胞嘧啶)及t(胸腺嘧啶)，條件是z1不是a，z2不是c，z3不是c，z4不是c或t，以及z5不是t。優(yōu)選的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:5(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287e)、seqidno:7(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398s)、seqidno:9(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436g)、seqidno:11(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l)和seqidno:13(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607y)。另外的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成或基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成的突變體：在氨基酸位置287處突變?yōu)閤1的突變，在氨基酸位置398處突變?yōu)閤2的突變，在氨基酸位置436處突變?yōu)閤3的突變，在氨基酸位置507處突變?yōu)閤4的突變，在氨基酸位置607處突變?yōu)閤5的突變；seqidno:5的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287x1)；seqidno:7的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398x2)；seqidno:9的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436x3)；seqidno:11的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507x4)；及seqidno:13的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607x5)。x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，條件是x1不是賴氨酸，x2不是蘇氨酸，x3不是精氨酸，x4不是苯丙氨酸及x5不是苯丙氨酸。如本文所用，術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指微生物細(xì)胞，其可以是可以用表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞(例如埃希氏菌屬(例如大腸桿菌)，克雷伯氏菌屬(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌)，假單胞菌屬(例如銅綠假單胞菌(p.aeruginosa))，棒桿菌屬(例如谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum))，芽孢桿菌(bacilli)，哈夫尼菌屬(例如蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei))，短桿菌屬(brevibacterium)，乳桿菌屬(lactobacillus)(例如戊糖乳桿菌(lactobacilluspentosus)，植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，lactobacillussaerimneri)，乳球菌屬(lactococcus)(例如乳酸乳球菌(lactococcuslactis)，乳酸乳球菌乳脂亞種(lactococcuslactisssp.cremoris)，乳酸乳球菌乳亞種(lactococcuslactisssp.lactis))以及鏈球菌屬(streptococcus)(例如嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophilus)))。大腸桿菌細(xì)胞可以是衍生自大腸桿菌k12(例如mg1655、w3110、dh10b、dh1、bw2952及衍生自其的菌株)或大腸桿菌b的任何大腸桿菌菌株，或者衍生自其的菌株。如本文所用，賴氨酸衍生產(chǎn)物可以是尸胺。例如，本文描述的表達(dá)質(zhì)粒載體可用于生產(chǎn)尸胺。在某些實施方案中，所述宿主細(xì)胞可含有一個或多個內(nèi)源質(zhì)粒。在某些實施方案中，所述宿主細(xì)胞不含內(nèi)源質(zhì)粒。如本文所用，術(shù)語“治愈”是指從宿主細(xì)胞中去除一個或多個內(nèi)源質(zhì)粒。在某些實施方案中，可以通過從宿主細(xì)胞去除所有內(nèi)源質(zhì)粒來“治愈”宿主細(xì)胞的所有內(nèi)源質(zhì)粒。在某些實施方案中，可以通過僅去除從細(xì)胞靶向去除的一個或多個內(nèi)源質(zhì)粒來“治愈”宿主細(xì)胞的一個或多個內(nèi)源質(zhì)粒。在某些實施方案中，所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(例如是蜂房哈夫尼菌)，其含有編碼特異性毒素/抗毒素基因?qū)Φ膬?nèi)源質(zhì)粒。這種毒素/抗毒素基因?qū)υ诰S持遺傳信息及應(yīng)激反應(yīng)中起作用(見wertzetal.“chimericnatureoftwoplasmidsofhafniaalveiencodingthebacteriocinsalveicinsaandb.”journalofbacteriology,(2004)186:1598-1605)。只要細(xì)胞具有一個或多個包含抗毒素基因的質(zhì)粒，則該毒素被所述一個或多個質(zhì)粒持續(xù)表達(dá)的抗毒素中和以保持細(xì)胞存活。在某些原核生物中，所述抗毒素蛋白比毒素蛋白更快降解。如果包含抗毒素基因的質(zhì)粒從細(xì)胞中丟失，則細(xì)胞中毒素蛋白將比抗毒素蛋白存在更長時間并殺死細(xì)胞或者抑制細(xì)胞生長。因此，優(yōu)選保留包含抗毒素或者毒素/抗毒素基因的質(zhì)粒以保持宿主細(xì)胞存活。如本文所用，毒素/抗毒素基因?qū)哂袃蓚€基因，一個是毒素基因，其表達(dá)對于宿主細(xì)胞具有毒性的多肽，另一個是抗毒素基因，其中和宿主細(xì)胞中的毒性多肽。所述毒素/抗毒素基因?qū)Φ睦影ǖ幌抻赼bt/abi基因?qū)蚢at/aai基因?qū)?、其片段及其突變體。在一些實施方案中，所述毒素多核苷酸序列包含seqidno:23或seqidno:25的核苷酸序列、其片段或突變體，由seqidno:23或seqidno:25的核苷酸序列、其片段或突變體組成，或者基本上由seqidno:23或seqidno:25的核苷酸序列、其片段或突變體組成。在一些實施方案中，所述抗毒素多核苷酸序列包含seqidno:24或seqidno:26的核苷酸序列、其片段或突變體，由seqidno:24或seqidno:26的核苷酸序列、其片段或突變體組成，或者基本上由seqidno:24或seqidno:26的核苷酸序列、其片段或突變體組成。在某些實施方案中，所述宿主細(xì)胞可以是任何蜂房哈夫尼菌菌株，例如沒有內(nèi)源質(zhì)粒的蜂房哈夫尼菌菌株或者含有內(nèi)源質(zhì)粒的蜂房哈夫尼菌菌株。例如，所述宿主細(xì)胞可以是含有一個或多個palva質(zhì)粒的蜂房哈夫尼菌菌株，或者其經(jīng)治愈的菌株(palva-菌株)，或者含有一個或多個palvb質(zhì)粒的蜂房哈夫尼菌菌株及其經(jīng)治愈的菌株(palvb-菌株)。在某些實施方案中，本發(fā)明揭示的表達(dá)質(zhì)粒載體(例如表達(dá)質(zhì)粒載體)可進(jìn)一步包含選自abi基因，aai基因及其突變體及片段的一個或多個抗毒素基因，和/或選自abt/abi基因?qū)蚢at/aai基因?qū)捌渫蛔凅w和片段的一個或多個毒素/抗毒素基因?qū)?。例如，在某些實施方案中，表達(dá)質(zhì)粒載體(例如所述表達(dá)質(zhì)粒載體)可進(jìn)一步包含抵消對宿主細(xì)胞有害的毒素多肽的抗毒素多核苷酸以及編碼所述毒素多肽的毒素多核苷酸序列。在某些實施方案中，所述宿主細(xì)胞可以是適用于工業(yè)規(guī)?；虼笠?guī)模生產(chǎn)的工業(yè)菌株。例如，工業(yè)菌株可以在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。培養(yǎng)規(guī)模可以從數(shù)百升至數(shù)百萬升。另一方面，實驗室菌株通常在數(shù)升或更少中培養(yǎng)。在某些實施方案中，工業(yè)菌株可以比實驗室菌株在更簡單或更經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基中生長。能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的骨架質(zhì)粒可以是在宿主細(xì)胞中可以復(fù)制的任何質(zhì)粒。在一個實施方案中，表達(dá)質(zhì)粒載體包含在大腸桿菌中可以復(fù)制的骨架質(zhì)粒。在另一個實施方案中，表達(dá)質(zhì)粒載體包含在蜂房哈夫尼菌中可以復(fù)制的骨架質(zhì)粒。骨架質(zhì)粒的例子包括但不限于在大腸桿菌中可以復(fù)制的骨架質(zhì)粒，例如puc(例如puc18和puc19質(zhì)粒)，pbr322，psc101，pet，p15a和pacyc質(zhì)粒，及從其衍生的質(zhì)粒。在某些實施方案中，所述表達(dá)質(zhì)粒載體可用于生產(chǎn)如本文描述的賴氨酸衍生產(chǎn)物。在某些實施方案中，賴氨酸衍生產(chǎn)物可是如本文描述的尸胺。如上文所提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自如下的一個或多個rbsdna核苷酸序列：seqidno:14(即rbsdna-1)，seqidno:15(即rbsdna-2)，seqidno:16(即rbsdna-3)，seqidno:17(即rbsdna-4)，seqidno:18(即rbsdna-5)和seqidno:19(即rbsdna-6)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述一個或多個rbsdna核苷酸序列可包含seqidno:18(即rbsdna-5)、由seqidno:18(即rbsdna-5)組成或者基本上由seqidno:18(即rbsdna-5)組成。如本文所提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自seqidno:20(即plac啟動子序列)、seqidno:21(即pbad啟動子序列)和seqidno:22(即ptac啟動子序列)的一個或多個啟動子核苷酸序列。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述一個或多個啟動子核苷酸序列可包含seqidno:21(即pbad啟動子序列)、由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成或者基本上由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成。本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)化體，其包含在宿主細(xì)胞中的一個或多個表達(dá)質(zhì)粒載體、由在宿主細(xì)胞中的一個或多個表達(dá)質(zhì)粒載體組成或者基本上由在宿主細(xì)胞中的一個或多個表達(dá)質(zhì)粒載體組成，所述表達(dá)質(zhì)粒載體包含如下多核苷酸、由如下多核苷酸組成或者基本上由如下多核苷酸組成：包含選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、由選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成或者基本上由選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列組成的dna多核苷酸：seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段，seqidno:1的片段(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段)，其中所述賴氨酸脫羧酶核苷酸序列與seqidno:1或seqidno:3具有至少95％序列相同性，及其中所述多核苷酸編碼一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽，所述賴氨酸脫羧酶多肽包含選自如下的氨基酸序列、由選自如下的氨基酸序列組成或者基本上由選自如下的氨基酸組成：seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段；及能載宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的骨架質(zhì)粒，其中所述表達(dá)質(zhì)粒載體用于生產(chǎn)賴氨酸衍生產(chǎn)物。所述表達(dá)質(zhì)粒載體、宿主細(xì)胞、骨架質(zhì)粒、dna多核苷酸、賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其突變體和片段、賴氨酸脫羧酶多肽、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其突變體和片段與前文的描述相同。seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于seqidno:1(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的核苷酸序列，其已經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1，seqidno:3)且其編碼seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的氨基酸序列。其它的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列。編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的優(yōu)選的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:4(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g)、seqidno:6(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g)、seqidno:8(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g)、seqidno:10(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g)和seqidno:12(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a)。另外的編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于：包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)閦1的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)閦2的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)閦3的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)閦4的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閦5的突變，和/或其任意組合；包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)間(鳥嘌呤)的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)間或a(腺嘌呤)的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閍的突變，和/或其任意組合；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859z1或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859z1)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193z2或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193z2)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306z3或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306z3)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521z4或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521z4)；及產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820a或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820z5或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820z5)。z1、z2、z3、z4和z5各自獨立地選自a、g、c(胞嘧啶)和t(胸腺嘧啶)，條件是z1不是a，z2不是c，z3不是c，z4不是c或t，及z5不是t。優(yōu)選的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:5(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287e)，seqidno:7(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398s)，seqidno:9(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436g)，seqidno:11(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l)和seqidno:13(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607y)。另外的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于：包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成的突變體：在氨基酸位置287處突變?yōu)閤1的突變，在氨基酸位置398處突變?yōu)閤2的突變，在氨基酸位置436處突變?yōu)閤3的突變，在氨基酸位置507處突變?yōu)閤4的突變，在氨基酸位置607處突變?yōu)閤5的突變；seqidno:5的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287x1)，seqidno:7的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398x2)，seqidno:9的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436x3)，seqidno:11的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507x4)，及seqidno:13的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607x5)。x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，條件是x1不是賴氨酸，x2不是蘇氨酸，x3不是精氨酸，x4不是苯丙氨酸，及x5不是苯丙氨酸。如上文提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自如下的一個或多個rbsdna核苷酸序列：seqidno:14(即rbsdna-1)，seqidno:15(即rbsdna-2)，seqidno:16(即rbsdna-3)，seqidno:17(即rbsdna-4)，seqidno:18(即rbsdna-5)，和seqidno:19(即rbsdna-6)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述一個或多個rbsdna核苷酸序列可包含seqidno:18(即rbsdna-5)、由seqidno:18(即rbsdna-5)組成或者基本上由seqidno:18(即rbsdna-5)組成。如上文提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自如下的一個或多個啟動子核苷酸序列：seqidno:20(即plac啟動子序列)，seqidno:21(即pbad啟動子序列)和seqidno:22(即ptac啟動子序列)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述一個或多個啟動子核苷酸序列可包含seqidno:21(即pbad啟動子序列)、由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成或者基本上由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成。如本文所用，轉(zhuǎn)化體可以是通過在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入一個或多個表達(dá)質(zhì)粒載體而改變的宿主細(xì)胞。在某些實施方案中，所述轉(zhuǎn)化體可以通過轉(zhuǎn)化向?qū)|(zhì)粒載體呈現(xiàn)出感受態(tài)的宿主細(xì)胞中導(dǎo)入所述表達(dá)質(zhì)粒載體而獲得。在某些實施方案中，所述轉(zhuǎn)化體可用于生產(chǎn)如本文描述的賴氨酸衍生產(chǎn)物。在某些實施方案中，賴氨酸衍生產(chǎn)物可以是如本文描述的尸胺。本發(fā)明的另一方面涉及突變宿主細(xì)胞，其包含如下多核苷酸、由如下多核苷酸組成或者基本上由如下多核苷酸組成：包含選自如下的一個或多個賴氨酸脫羧酶核苷酸序列的dna多核苷酸：seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段，及seqidno:1的片段(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的片段)，其中所述賴氨酸脫羧酶核苷酸序列與seqidno:1或seqidno:3具有至少95％序列相同性，及其中所述多核苷酸編碼包含選自如下的氨基酸序列的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽：seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段。所述宿主細(xì)胞、dna多核苷酸、賴氨酸脫羧酶核苷酸序列、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其片段和突變體、賴氨酸脫羧酶多肽、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其片段和突變體與前文描述的相同。seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于seqidno:1(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的核苷酸序列，其已經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1，seqidno:3)且其編碼seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)的氨基酸序列。其它的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列。編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的優(yōu)選的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:4(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g)、seqidno:6(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g)、seqidno:8(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g)、seqidno:10(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g)和seqidno:12(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a)。其它的編碼seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的氨基酸序列的seqidno:1的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子可包括但不限于：包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)閦1的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)閦2的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)閦3的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)閦4的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閦5的突變，和/或其任意組合；包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:1或seqidno:3組成的賴氨酸脫羧酶核苷酸序列：在核苷酸位置859處突變?yōu)間(鳥嘌呤)的突變，在核苷酸位置1193處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1306處突變?yōu)間的突變，在核苷酸位置1521處突變?yōu)間或a(腺嘌呤)的突變，在核苷酸位置1820處突變?yōu)閍的突變，和/或其任意組合；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldca859z1或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1a859z1；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1193z2或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1193z2)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1306z3或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1306z3)；產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521g或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521g的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcc1521z4或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1c1521z4)；及產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820a或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820a的同源核苷酸序列(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct1820z5或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1t1820z5)。z1、z2、z3、z4和z5各自獨立地選自a、g、c(胞嘧啶)和t(胸腺嘧啶)，條件是z1不是a，z2不是c，z3不是c，z4不是c或t，及z5不是t。優(yōu)選的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于seqidno:5(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287e)、seqidno:7(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398s)、seqidno:9(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436g)、seqidno:11(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l)及seqidno:13(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607y)。其它的seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)的例子包括但不限于包含含有選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列、由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成或者基本上由包含選自如下的一個或多個突變的seqidno:2的氨基酸序列組成的突變體：在氨基酸位置287處突變?yōu)閤1的突變，在氨基酸位置398處突變?yōu)閤2的突變，在氨基酸位置436處突變?yōu)閤3的突變，在氨基酸位置507處突變?yōu)閤4的突變，在氨基酸位置607處突變?yōu)閤5的突變；seqidno:5的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldck287x1)；seqidno:7的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldct398x2)；seqidno:9的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcr436x3)；seqidno:11的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507x4)；seqidno:13的同源多肽(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf607x5)。x1、x2、x3、x4和x5各自獨立地選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，條件是x1不是賴氨酸，x2不是蘇氨酸，x3不是精氨酸，x4不是苯丙氨酸及x5不是苯丙氨酸。如上文提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自如下的一個或多個rbsdna核苷酸序列：seqidno:14(即rbsdna-1)，seqidno:15(即rbsdna-2)，seqidno:16(即rbsdna-3)，seqidno:17(即rbsdna-4)，seqidno:18(即rbsdna-5)，和seqidno:19(即rbsdna-6)。如上文提供，在某些實施方案中，本文描述的dna多核苷酸可進(jìn)一步包含選自如下的一個或多個啟動子核苷酸序列、由選自如下的一個或多個啟動子核苷酸序列組成或者基本上由選自如下的一個或多個啟動子核苷酸序列組成：seqidno:20(即plac啟動子序列)，seqidno:21(即pbad啟動子序列)，及seqidno:22(即ptac啟動子序列)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述一個或多個啟動子核苷酸序列可包含seqidno:21(即pbad啟動子序列)、由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成或者基本上由seqidno:21(即pbad啟動子序列)組成。在某些實施方案中，所述突變宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)如本文描述的賴氨酸衍生產(chǎn)物。在某些實施方案中，賴氨酸衍生產(chǎn)物可是如本文描述的尸胺。在某些實施方案中，根據(jù)pcr介導(dǎo)的基因置換方法可以將所述dna多核苷酸整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中(見例如datsenko,2000關(guān)于pcr介導(dǎo)的基因置換方法的綜述，該文獻(xiàn)以其全部內(nèi)容并入本文作參考)。整合的染色體也可以通過其它合適方法產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)如本文描述的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽的方法，包括：獲得如本文描述的突變宿主細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)化體；在使所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽有效表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述突變宿主細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)化體；及收獲所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽。所述賴氨酸脫羧酶多肽、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc及其突變體和片段、突變宿主細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)化體與前文描述的相同。在某些實施方案中，所述轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞可以是如本文描述的任何那些轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞。例如，用于生產(chǎn)一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽的轉(zhuǎn)化體可以通過將如本文描述的一種或多種表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中而獲得。所述轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞可以使用含有碳源和非碳營養(yǎng)源的培養(yǎng)基培養(yǎng)。碳源的例子包括但不限于糖(例如碳水化合物如葡萄糖和果糖)、油和/或脂肪、脂肪酸，和/或其衍生物。油和脂肪可含有飽和和/或不飽和的脂肪酸，其具有10或更多個碳原子，例如椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油等。脂肪酸可以是飽和和/或不飽和脂肪酸，例如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸等。脂肪酸衍生物的例子包括但不限于其酯及鹽。非碳源的例子包括但不限于氮源、無機(jī)鹽，及其它有機(jī)營養(yǎng)源。例如，培養(yǎng)基可含有能被轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞同化的碳源，任選具有選自氮源、無機(jī)鹽及其它有機(jī)營養(yǎng)源的一種或多種其它來源。在某些實施方案中，氮源的重量百分比是培養(yǎng)基的大約0.01％至大約0.1％。氮源的例子可包含氨、銨鹽(例如氯化銨、硫酸銨和磷酸銨)、蛋白胨、肉膏、酵母提取物等。無機(jī)鹽的例子包括但不限于磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。其它有機(jī)營養(yǎng)源的例子包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸)、維生素(例如維生素b1、維生素b12和維生素c)等。培養(yǎng)可以在只要細(xì)胞可以生長的任何溫度進(jìn)行，優(yōu)選大約20℃至大約40℃，或者大約35℃。培養(yǎng)時間可以是大約1天、大約2天、大約3天、大約4天、大約5天、大約6天、大約7天、大約8天、大約9天或者大約10天。在一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞是在含有肽、蛋白胨、維生素(例如維生素b)、微量元素(例如氮、硫、鎂)和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這種培養(yǎng)基的例子包括但不限于通常已知的lysogenybroth(lb)培養(yǎng)基，其包含懸浮于水(例如蒸餾水或去離子水)中的胰蛋白胨、酵母提取物和nacl。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)尸胺(1,5-戊二胺)的方法，包括如下步驟、由如下步驟組成或者基本上由如下步驟組成：1a)培養(yǎng)本文揭示的轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞，1b)使用得自步驟1a的培養(yǎng)物使賴氨酸脫羧而生產(chǎn)尸胺，及1c)使用得自步驟1b的培養(yǎng)物提取及純化尸胺。在某些實施方案中，所述轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞可以是本文描述的任何那些轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞。培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞可包括前述培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體的步驟。例如，所述轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞可以使用含有碳源和非碳源營養(yǎng)源的培養(yǎng)基培養(yǎng)。碳源的例子包括但不限于糖(例如碳水化合物如葡萄糖和果糖)、油和/或脂肪，脂肪酸、和/或其衍生物。油和脂肪可含有飽和和/或不飽和脂肪酸，其具有10或更多個碳原子，例如椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油等。所述脂肪酸可以是飽和和/或不飽和脂肪酸，例如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸等。脂肪酸衍生物的例子包括但不限于其酯及其鹽。非碳源的例子包括但不限于氮源、無機(jī)鹽，及其它有機(jī)營養(yǎng)源。例如，培養(yǎng)基可含有能被轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞同化的碳源，任選具有選自氮源、無機(jī)鹽及其它有機(jī)營養(yǎng)源的一種或多種其它來源。在某些實施方案中，氮源的重量百分比是培養(yǎng)基的大約0.01％至大約0.1％。氮源的例子可包含氨、銨鹽(例如氯化銨、硫酸銨和磷酸銨)、蛋白胨、肉膏、酵母提取物等。無機(jī)鹽的例子包括但不限于磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。其它有機(jī)營養(yǎng)源的例子包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸)、維生素(例如維生素b1、維生素b12和維生素c)等。培養(yǎng)可以在只要細(xì)胞可以生長的任何溫度進(jìn)行，優(yōu)選大約20℃至大約40℃，或者大約35℃。培養(yǎng)時間可以是大約1天、大約2天、大約3天、大約4天、大約5天、大約6天、大約7天、大約8天、大約9天或者大約10天。在一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)化體和/或突變宿主細(xì)胞是在含有肽、蛋白胨、維生素(例如維生素b)、微量元素(例如氮、硫、鎂)和礦物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這種培養(yǎng)基的例子包括但不限于通常已知的lysogenybroth(lb)培養(yǎng)基，其包含懸浮于水(例如蒸餾水或去離子水)中的胰蛋白胨、酵母提取物和nacl。如本文所用，“使用得自步驟1a的培養(yǎng)物”可包括進(jìn)一步處理得自步驟1a的培養(yǎng)物。例如使用緩沖溶液稀釋所述培養(yǎng)物，離心所述培養(yǎng)物以收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸浮于緩沖溶液中，或者將細(xì)胞裂解為細(xì)胞裂解物，和/或從細(xì)胞裂解物中純化賴氨酸脫羧酶。在另一個實施方案中，所述方法的步驟1c進(jìn)一步包括如下步驟：1d)分離得自步驟1b的反應(yīng)的固體與液體成分；1e)將得自步驟1d的液體成分的ph調(diào)節(jié)為大約14或更高；1f)從得自步驟1e的液體成分中除去水；及1g)回收尸胺。在步驟1d中，步驟1b的反應(yīng)的固體與液體成分的分離可以通過常規(guī)離心和/或過濾方法實現(xiàn)。在步驟1e中，步驟1d的液體成分的ph值可以通過加入堿例如naoh調(diào)節(jié)。naoh可以作為固體和/或溶液(例如水溶液)加入。在步驟1f中，水可以通過在環(huán)境壓力或真空蒸餾而除去。在步驟1g中，尸胺可以通過在環(huán)境壓力或真空蒸餾而回收。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)尸胺(1,5-戊二胺)的方法，包括如下步驟、由如下步驟組成或者基本上由如下步驟組成：2a)獲得包含選自如下的氨基酸序列的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽：seqidno:2(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc)及其片段，及seqidno:2的突變體(即產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的突變體)及其片段；及2b)使用在步驟2a中獲得的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽使賴氨酸脫羧而生產(chǎn)尸胺。所述賴氨酸脫羧酶多肽、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc、其突變體和片段與前文描述的相同。在某些實施方案中，所述生產(chǎn)尸胺的方法可進(jìn)一步包括包含提取和純化步驟2b中產(chǎn)生的尸胺的步驟2c。在另一個實施方案中，所述方法的步驟2c進(jìn)一步包括如下步驟：2d)分離得自步驟2b的反應(yīng)的固體和液體成分；2e)將得自步驟2d的液體成分的ph調(diào)節(jié)為大約14或更高；2f)從得自步驟2e的液體成分中除去水；及2g)回收尸胺。在步驟2d中，步驟2b的固體與液體成分的分離可以通過常規(guī)的離心和/或過濾方法實現(xiàn)。在步驟2e中，步驟2d的液體成分的ph可以通過加入堿例如naoh進(jìn)行調(diào)節(jié)。naoh可以作為固體和/或溶液(例如水溶液)形式加入。在步驟2f中，水可以通過在環(huán)境壓力或真空蒸餾而除去。在步驟2g中，尸胺可以通過在環(huán)境壓力或真空蒸餾而回收。在某些實施方案中，所述用于生產(chǎn)尸胺的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽可以是固定化的。在某些實施方案中，所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽可以局限于基質(zhì)上。在某些實施方案中，所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法固定。固定技術(shù)的例子包括但不限于吸附(例如通過離子或疏水性相互作用)、共價結(jié)合、親和性固定(例如將基質(zhì)與一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽的親和性配體偶聯(lián)，或者將所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽與對基質(zhì)具有親和性的分子綴合)，及捕獲(即通過與基質(zhì)共價或非共價相互作用鎖定所述一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽)?？捎米骰|(zhì)的材料的例子包括但不限于藻酸鹽、殼聚糖、殼多糖、膠原、角叉菜膠、明膠、纖維素、淀粉、果膠、瓊脂糖、沸石、陶瓷、硅藻土、二氧化硅、玻璃、活性炭及木炭。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明揭示的方法制備的生物基尸胺。如本文所用，“生物基”化合物是指在standardastmd6866下認(rèn)為化合物是生物基的。本發(fā)明的另一方面涉及具有如下結(jié)構(gòu)1的結(jié)構(gòu)的聚酰胺，包括其立體異構(gòu)體：其中m＝4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22；n＝4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22；j＝大約100-大約1000000；及所述聚酰胺是從碳原子數(shù)為m的一個或多個二胺及碳原子數(shù)目為n的一個或多個二羧酸制備的，至少一個所述二胺和二羧酸包含在standardastmd6866下的生物基碳，并且每個二胺或二羧酸的m或n可以相同或不同。在一個實施方案中，所述二胺是生物基尸胺，更優(yōu)選是根據(jù)本發(fā)明方法制備的生物基尸胺。二羧酸的例子包括但不限于c10二羧酸、c11二羧酸、c12二羧酸、c13二羧酸、c14二羧酸、c16二羧酸、c18二羧酸及其任意組合。在某些實施方案中，所有或部分cn二羧酸是生物基的。在另一實施方案中，所述聚酰胺具有上述結(jié)構(gòu)，其中：所述聚酰胺是通過生物基尸胺與一個或多個二羧酸反應(yīng)形成的，更優(yōu)選所述生物基尸胺是根據(jù)本發(fā)明的方法制備的；n＝4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22；j＝大約100-大約1000000、大約1000-大約100000，或者大約1000-大約10000；及所述二羧酸包含在standardastmd6866下的生物基碳。本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明揭示的聚酰胺的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的方法制備生物基尸胺如cm二胺。在一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括制備一種或多種生物基cn二羧酸。在另一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括通過將生物基尸胺與一種或多種生物基cn二羧酸反應(yīng)制備聚酰胺。本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明揭示的一種或多種聚酰胺的組合物。在一個實施方案中，所述二胺是生物基尸胺，優(yōu)選是根據(jù)本發(fā)明的方法制備的生物基尸胺。二羧酸的例子包括但不限于c10二羧酸、c11二羧酸、c12二羧酸、c13二羧酸、c14二羧酸、c16二羧酸、c18二羧酸及其任意組合。在某些實施方案中，所有或部分cn二羧酸是生物基的。在另一個實施方案中，所述聚酰胺具有上述結(jié)構(gòu)，其中：所述聚酰胺是通過將生物基尸胺與一種或多種二羧酸反應(yīng)形成的，優(yōu)選所述生物基尸胺是根據(jù)本發(fā)明的方法制備的；n＝4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22；j＝大約100-大約1000000、大約1000-大約100000，或者大約1000-大約10000；及所述二羧酸包含在standardastmd6866下的生物基碳。本發(fā)明的另一方面涉及一種制備1,5-二異氰酸戊烷的方法，包括：3a)制備本發(fā)明揭示的生物基尸胺；及3b)將得自步驟3a的生物基尸胺轉(zhuǎn)化為1,5-二異氰酸戊烷。步驟3b可包括使用任何已知方法將二胺轉(zhuǎn)化為異氰酸酯。所述方法的一個實例是傳統(tǒng)光氣法，包括一步高溫光氣法(即在高溫下混合光氣與二胺以獲得異氰酸鹽/酯)、改良的兩步光氣法，及三光氣法，其中使用三光氣代替光氣。還有不使用光氣作為原料的其它方法。所述方法的一個實例是使用co2代替光氣的己二胺羰基化：將co2添加至伯胺和有機(jī)堿的溶液中，然后將適當(dāng)量的磷親電試劑添加至反應(yīng)溶液中以起始放熱的脫水反應(yīng)，獲得異氰酸鹽/酯。另一實例是氨基甲酸酯熱分解法，其中將伯胺轉(zhuǎn)化為氨基甲酸酯，然后將氨基甲酸酯加熱至分解并產(chǎn)生異氰酸鹽/酯。用于氨基酸、多肽、堿基序列和核酸的縮寫基于在iupac-iubcommunicationonbiochemicalnomenclature,eur.j.biochem.,138:9(1984),"guidelineforpreparingspecificationsincludingbasesequencesandaminoacidsequences"(unitedstatespatentandtrademarkoffice)中指定的縮寫及在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中常用的那些。除非上下文另有明確要求，在整個說明書和權(quán)利要求書中，單詞“包含”、“包括”等在包容的意義上解釋(即在“包括但不限于”的意義上)，與排他性或窮盡性意義相反。在本申請中使用時，單詞“本文”、“以上”、“以下”、“上文”和相似輸入的單詞指作為整體的本申請，不是指本申請的任何特定部分。在上下文允許時，上文詳細(xì)描述中使用單數(shù)或復(fù)數(shù)的單詞還可以分別包括復(fù)數(shù)或單數(shù)。關(guān)于兩個或更多個項目的列表的單詞“或”和“和/或”涵蓋單詞的所有以下解釋：列表中的任何項目，列表中的所有項目，以及列表中的項目的任何組合。以下實施例意圖說明本發(fā)明的多種實施方案。因此，討論的具體實施方案不應(yīng)當(dāng)理解為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會清楚可以進(jìn)行各種等價、改變和修改而不背離本發(fā)明的范圍，并且應(yīng)當(dāng)理解這類等價實施方案包括在本文中。此外，本公開中引用的所有參考文獻(xiàn)均以其全文加入本文參考，就如在本文中完整示出一樣。實施例實施例1：產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶在大腸桿菌中的過表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌基因組dna購自dsmz(dsm6673)。基因組dna在pcr反應(yīng)中用作模板，使用引物koldc-f和koldc-r(見圖1)。引物基于genbank登記號cp003683.1設(shè)計，其是產(chǎn)酸克雷伯氏菌e718基因組的一部分，含有野生型賴氨酸脫羧酶(ldc)基因。產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc核苷酸序列(seqidno:1)編碼賴氨酸脫羧酶蛋白產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc(seqidno:2)。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物使用限制酶saci和xbai克隆進(jìn)質(zhì)粒puc18中，產(chǎn)生puc18-koldc。在驗證賴氨酸脫羧酶序列之后，將puc18-koldc轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌mg1655k12(dsm18039)(k12)中，產(chǎn)生菌株ln18(見圖2)。將產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)(產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1；seqidno:3)。將密碼子優(yōu)化的基因(產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1)克隆進(jìn)入上述的puc18中，產(chǎn)生質(zhì)粒puc18-koldc-co1，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌k12中，產(chǎn)生菌株ln20(見圖2)。通過將野生型大腸桿菌cada克隆進(jìn)puc18中產(chǎn)生陽性對照pcib60，由此構(gòu)建含有野生型大腸桿菌cada的質(zhì)粒載體，其編碼賴氨酸脫羧酶多肽cada。將pcib60轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌k12中，產(chǎn)生菌株cib60(見圖2)。將每個菌株的三個菌落在具有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中在3ml培養(yǎng)物中在37℃生長過夜。第二天，將40μl每個過夜培養(yǎng)物接種于3ml具有氨芐青霉素的新鮮lb培養(yǎng)基中，至最終od600為～0.05，生長3小時至od600為～0.4，加入0.5mm異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)。將每個培養(yǎng)物在37℃再保溫8小時。為檢測活性，將0.9ml培養(yǎng)物與賴氨酸-hcl(15mg)和吡哆醛5-磷酸(plp)(0.1mm終濃度)混合，最終反應(yīng)體積為1ml。使每個反應(yīng)在37℃進(jìn)行2小時。通過將樣品煮沸5分鐘而終止反應(yīng)。使用nmr立即處理樣品。表1：使用菌株cib60(包含大腸桿菌cada的大腸桿菌菌株)、菌株ln18(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的大腸桿菌菌株)及菌株ln20(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1的大腸桿菌菌株)生產(chǎn)尸胺如表1所示，表達(dá)由產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1dna編碼的產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白的細(xì)胞與表達(dá)由野生型產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcdna編碼的產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白的細(xì)胞(4.41g/kg)或者表達(dá)大腸桿菌cada蛋白的細(xì)胞(5.69g/kg)相比，產(chǎn)生最高產(chǎn)量的尸胺(6.63g/kg)。實施例2：使用包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌lcd-co1和plac啟動子的ln20菌株生產(chǎn)尸胺將包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和plac啟動子的三個ln20菌株菌落(見圖2)在具有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中在3ml培養(yǎng)物中在37℃生長過夜。第二天，將160μl每個過夜培養(yǎng)物接種于12ml具有氨芐青霉素的新鮮lb培養(yǎng)基中，至終od600為～0.05，生長3小時至od600為～0.4。在od600為～0.4時，將每12ml培養(yǎng)物分成四個單獨的3ml培養(yǎng)物，在每個培養(yǎng)物中加入iptg，終濃度為0、0.1、0.2和0.5mm。將每個培養(yǎng)物在37℃再保溫8小時。使用與實施例1描述的相同方案檢測尸胺生產(chǎn)。表2：使用ln20(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和plac啟動子的大腸桿菌菌株)生產(chǎn)尸胺iptg濃度(mm)尸胺(g/kg)03.35±0.50.15.96±0.40.26.68±0.10.56.82±0.3如表2示出，當(dāng)在iptg濃度為0.5mm誘導(dǎo)ln20細(xì)胞(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和plac啟動子的大腸桿菌菌株)時，產(chǎn)生最高產(chǎn)量的尸胺。實施例3：使用包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和pbad啟動子的ln22菌株生產(chǎn)尸胺接著，產(chǎn)生包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和pbad啟動子的菌株(ln22菌株，見圖2)。使用引物xhoi-f和xhoi-r，將xhoi限制位點插入puc18-koldc-co1質(zhì)粒中l(wèi)ac啟動子起始處上游的27個堿基對(見圖1)。進(jìn)行quickchangepcr，使用含有產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1基因的質(zhì)粒puc18-koldc-co1作為模板dna。含有插入的xhoi序列的所得質(zhì)粒稱作puc18-koldc-co1-xhoi。使用引物pbad-f和pbad-r從pkd46表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增pbad啟動子和上游arac基因(見圖1)，并使用限制酶xhoi和saci克隆進(jìn)puc18-koldc-co1-xhoi中，產(chǎn)生質(zhì)粒puc18-koldc-co1-pbad。將質(zhì)粒puc18-koldc-co1-pbad轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株k12中，產(chǎn)生菌株ln22(見圖2)。以與實施例2相同方式進(jìn)行尸胺生產(chǎn)和分析實驗，不同之處是加入阿拉伯糖代替iptg，終濃度為0、2.5、5.0和10.0mm。表3：使用菌株ln22(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和pbad啟動子的大腸桿菌菌株)生產(chǎn)尸胺阿拉伯糖濃度(mm)尸胺(g/kg)00.49±0.42.52.35±0.45.06.09±0.110.06.45±0.1如表3示出，當(dāng)在阿拉伯糖濃度為10mm誘導(dǎo)ln22細(xì)胞(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和pbad啟動子的大腸桿菌菌株)時，產(chǎn)生最高產(chǎn)量的尸胺。實施例4：使用ln24菌株(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和ptac啟動子的大腸桿菌菌株)生產(chǎn)尸胺接著，產(chǎn)生包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和ptac啟動子的菌株(ln24菌株，見圖2)。相似地，使用引物ptac-f和ptac-r從pgext43擴(kuò)增ptac啟動子和上游laciq基因(見圖1)，并克隆進(jìn)puc18-koldc-co1-xhoi中，產(chǎn)生質(zhì)粒puc18-koldc-co1-ptac。將puc18-koldc-co1-ptac轉(zhuǎn)化進(jìn)k12中產(chǎn)生菌株ln24(見圖2)。尸胺生產(chǎn)和分析實驗如實施例2同樣的方式進(jìn)行。表4：使用菌株ln24(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和ptac啟動子的大腸桿菌菌株)生產(chǎn)尸胺iptg濃度(mm)尸胺(g/kg)01.61±0.40.17.57±0.10.27.57±0.10.57.20±0.2如表4示出，當(dāng)在iptg濃度為0.1或0.2mm誘導(dǎo)ln24細(xì)胞(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和ptac啟動子的大腸桿菌菌株)時，產(chǎn)生最高產(chǎn)量的尸胺。實施例5：比較表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc或大腸桿菌cada的菌株在分批發(fā)酵期間生產(chǎn)尸胺使用表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白的細(xì)胞(菌株ln20，包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和plac啟動子的大腸桿菌細(xì)胞，見圖2)及表達(dá)大腸桿菌cada蛋白的細(xì)胞(菌株cib60，包含大腸桿菌cada和plac啟動子的大腸桿菌細(xì)胞，見圖2)進(jìn)行分批發(fā)酵。分批培養(yǎng)在37℃在含有7l發(fā)酵培養(yǎng)基(由20g/l葡萄糖、30g/l玉米漿、10g/l酵母提取物、5g/l硫酸銨、10g/lmgso4、0.05g/lfeso4、0.05g/lmnso4、5g/lcacl2和0.1g/l氨芐青霉素組成)的10-l罐式發(fā)酵器中進(jìn)行。將一個菌落接種于50mllb培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)搖床中在100rpm和37℃生長24小時。用50ml種子培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐，ph通過加入20％(w/v)naoh控制在大約7.0。維持3.5l/min通氣，攪拌速度為400rpm及壓力為0.05mpa。在指數(shù)期加入0.2mmiptg?？偘l(fā)酵時間為18小時。定期取樣品以測量生物量濃度及賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺的能力。數(shù)據(jù)在圖3中示出。在分批發(fā)酵條件下，表達(dá)大腸桿菌cada的細(xì)胞(菌株cib60)在18小時后達(dá)到最終od600為15.02(見圖3，黑色方框)。表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的細(xì)胞(菌株ln20)達(dá)到為14.26的更低od600(見圖3，白色方框)。葡萄糖利用率在這兩菌株之間相似(見圖3：ln20，白色圓形；cib60，黑色圓形)。然而，表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的細(xì)胞(菌株ln20)能將賴氨酸-hcl轉(zhuǎn)化為尸胺，速率為每分鐘0.43％，這比表達(dá)大腸桿菌cada的細(xì)胞(菌株cib60)高24％，后者的活性為每分鐘0.37％(見圖3，分別為白色三角形和黑色三角形)。實施例6：在補(bǔ)料分批發(fā)酵期間使用表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的菌株生產(chǎn)尸胺使用表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白的細(xì)胞(菌株ln24，包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和ptac啟動子的大腸桿菌細(xì)胞，見圖2)進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。補(bǔ)料分批培養(yǎng)在37℃在含有5l發(fā)酵培養(yǎng)基(由8g/l葡萄糖、30g/l玉米漿、10g/l酵母提取物、5g/l硫酸銨、10g/lmgso4、0.05g/lfeso4、0.05g/lmnso4、5g/lcacl2和0.1g/l氨芐青霉素組成)的10-l罐式發(fā)酵器中進(jìn)行。補(bǔ)料溶液含有在水中的50％葡萄糖以保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度為5-8g/l。加入25％氨水溶液以維持ph為大約7.0。維持3.5l/min通氣，攪拌速度為400rpm及壓力為0.05mpa。在指數(shù)期期間每10小時加入0.1mmiptg。總發(fā)酵時間為58小時。在58小時期間定期取樣品以測量生物量濃度及賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺的能力。數(shù)據(jù)在圖4中示出。在補(bǔ)料分批發(fā)酵條件下，表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白的細(xì)胞(菌株ln24)在58小時后達(dá)到od600為大約80(見圖4，白色方框)，針對10g樣品觀測到最大活性為每分鐘1.33％(0.133％/min/g)(見圖4，黑色菱形)。實施例7：對于增加的尸胺生產(chǎn)篩選核糖體結(jié)合位點文庫制備核糖體結(jié)合位點(rbs)dna文庫用于篩選導(dǎo)致增加的尸胺生產(chǎn)的用于產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc蛋白表達(dá)的最佳rbs序列。在puc18-koldc-co1-ptac中使用引物rbs-f和rbs-r(見圖1)修飾產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1中rbsdna區(qū)域(seqidno:3)中的核苷酸。設(shè)計rbs-f以使得在相對于產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1的第一個核苷酸的核苷酸位置-7至-12產(chǎn)生隨機(jī)核苷酸序列。將五個pcr反應(yīng)集合在一起，用限制酶dpni處理以除去任何模板dna，及進(jìn)行pcr清除。將1μg純化的dna轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌mg1655k12中，將轉(zhuǎn)化體鋪板以使得可以篩選單一菌落。篩選1000個菌落，標(biāo)記為ln100-1099。將使用菌株ln100-1099的尸胺生產(chǎn)情況與ln24菌株(包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和ptac的大腸桿菌菌株，見圖2)尸胺生產(chǎn)情況進(jìn)行比較。得自篩選文庫的5個菌株(ln140、ln301、ln499、ln637和ln770)證實在這1000個篩選的菌株中具有最高尸胺產(chǎn)量。純化來自這些菌株的質(zhì)粒并標(biāo)記為pln140、pln301、pln499、pln637和pln770。使用引物rbs-out-f(見圖1)對所述質(zhì)粒進(jìn)行測序以確定產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1的rbsdna區(qū)域中的新rbsdna序列。將來自最高產(chǎn)量的5個生產(chǎn)菌株的5個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌mg1655k12中，產(chǎn)生菌株ln1100、ln1101、ln1102、ln1103和ln1104(見圖2)。將使用具有突變的rbsdna序列的菌株(ln1100、ln1101、ln1102、ln1103和ln1104)的尸胺生產(chǎn)與使用野生型rbsdna序列的菌株(菌株ln24，包含產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1和ptac啟動子的大腸桿菌菌株，圖2)的尸胺生產(chǎn)進(jìn)行比較。如實施例1所述進(jìn)行尸胺生產(chǎn)和分析，不同之處是使用0.1mmiptg和25mg賴氨酸-hcl。表5：使用菌株ln24和得自rbsdna篩選文庫的菌株的尸胺生產(chǎn)如表5所示，與具有野生型rbsdna序列的菌株(ln24)相比，具有突變的rbsdna序列的質(zhì)粒當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌k12(ln1100、ln1101、ln1102、ln1103和ln1104)中時產(chǎn)生更高產(chǎn)量的尸胺。尸胺的最高產(chǎn)量在菌株ln1103中產(chǎn)生(即10.0±0.6g/kg)，其具有rbsdna-5序列(即tggagg；seqidno:18)。實施例8：對于增加的尸胺生產(chǎn)篩選eppcr文庫使用易錯pcr(eppcr)，將在實施例7中產(chǎn)生最高產(chǎn)量尸胺的菌株的質(zhì)粒(質(zhì)粒pln637，菌株ln1103)用于在產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1多核苷酸序列(seqidno:3)中導(dǎo)入隨機(jī)突變。基于pln637的測序結(jié)果，設(shè)計引物eppcr-f(見圖1)以擴(kuò)增產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1上游區(qū)域。使用eppcr，使用引物eppcr-f和eppcr-r(圖1)從pln637擴(kuò)增產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1序列。eppcr根據(jù)廠商指導(dǎo)使用genemorphii隨機(jī)誘變試劑盒完成。將5個pcr反應(yīng)集合在一起，用限制酶dpni處理以除去任何模板dna，并純化。使用限制酶saci和xbai，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)puc18-koldc-co1-ptac中置換產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1多核苷酸序列。將純化的dna轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌mg1655k12中，將轉(zhuǎn)化體鋪板以使得可以針對增加的尸胺生產(chǎn)篩選單一菌落。篩選來自轉(zhuǎn)化的1000個單一菌落，鑒別與ln1103相比具有增加的將賴氨酸-hcl轉(zhuǎn)化為尸胺的能力的菌株。從eppcr產(chǎn)生的這1000個突變體標(biāo)記為ln2000-2999。得自eppcr的5個菌株(即ln2377、ln2453、ln2768、ln2888和ln2964)證實在經(jīng)篩選通過eppcr產(chǎn)生的1000個突變體中產(chǎn)生最高的尸胺產(chǎn)量。純化這些菌株的質(zhì)粒，標(biāo)記為pln2377、pln2453、pln2768、pln2888和pln2964。使用引物ldc-out-f和ldc-out-r，對這些質(zhì)粒每個上的賴氨酸脫羧酶基因均進(jìn)行測序(圖1)。將這5個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌mg1655k12中，產(chǎn)生菌株ln3010、ln3011、ln3012、ln3013和ln3014(圖2)。如實施例7所述進(jìn)行尸胺生產(chǎn)和分析。表6：使用菌株ln1103和得自eppcr篩選文庫的菌株的尸胺生產(chǎn)如表6所示，與在產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1序列中無突變的菌株(即菌株ln24)相比，用在產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc-co1序列中具有突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌k12(即菌株ln3010、ln3011、ln3012、ln3013和ln3014)產(chǎn)生更高產(chǎn)量的尸胺。尸胺的最高產(chǎn)量產(chǎn)自菌株ln3014，其表達(dá)突變產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l蛋白(seqidno:11)，獲得的產(chǎn)量為11.2±1.0g/kg尸胺。實施例9：在分批發(fā)酵期間對比表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc或產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的菌株的尸胺生產(chǎn)如實施例5所述相同方式進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的細(xì)胞(菌株ln24，圖2)或者表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的細(xì)胞(菌株ln3014，圖2)的分批發(fā)酵。數(shù)據(jù)在圖5中示出。在分批發(fā)酵條件下，表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的細(xì)胞(菌株ln24)和表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的細(xì)胞(菌株ln3014)在18小時后達(dá)到相似的最終od600，為大約13.6±0.1(見圖5，分別為黑色方框和白色方框)。在表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的細(xì)胞(菌株ln24)中與表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的細(xì)胞(菌株ln3014)相比，葡萄糖利用率略高(見圖5，分別為黑色圓形和白色圓形)。然而，表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的細(xì)胞(菌株ln3014)與表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的細(xì)胞(菌株ln24)相比，賴氨酸-hcl轉(zhuǎn)化為尸胺的轉(zhuǎn)化率高25％(見圖5，分別為白色三角形和黑色三角形)。表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc的細(xì)胞(菌株ln24)達(dá)到活性為每分鐘0.58％，而表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的細(xì)胞(菌株ln3014)達(dá)到活性為每分鐘0.72％(見圖5，在18小時時間點，分別為黑色三角形和白色三角形)。實施例10：在補(bǔ)料分批發(fā)酵期間表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的菌株的尸胺生產(chǎn)如實施例6提供的相同方式進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的細(xì)胞(菌株ln3014，圖2)的補(bǔ)料分批發(fā)酵。數(shù)據(jù)在圖6中示出。表達(dá)產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldcf507l的細(xì)胞(菌株ln3014)在補(bǔ)料分批發(fā)酵中檢測58小時。在58小時后，od600達(dá)到大約82，對于測定的10g樣品觀測到最大活性，為每分鐘1.56％(0.156％/min/g)(見圖6，在58小時時間點，分別為方框和三角形)。參考文獻(xiàn)下文列舉的參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請及上文說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)在此均以其全部內(nèi)容并入作參考，就如在本文示出一樣。1.wertzetal.chimericnatureoftwoplasmidsofh.alveiencodingthebacteriocinsalveicinsaandb.journalofbacteriology,(2004)186:1598-1605.2.datsenkoka&wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.pnas,(2000)6640-6645.3.papadakisetal.promotersandcontrolelements:designingexpressioncassettesforgenetherapy.currentgenetherapy,(2004)4:89-113.序列表seqidno:1(產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc核苷酸序列)atgaacgttatcgcaatcatgaatcacatgggtgtctacttcaaagaagaacccatccgtgaactgcatcgcgccctcgaacgcctggacttccgtattgtctacccgaacgaccgtgaagacttattaaaacttatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgtgatcttcgact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列seqidno:24(aai核苷酸序列)>gb|ay271828.1|:1734-2069h.alvei質(zhì)粒palva，完整序列seqidno:25(abt核苷酸序列)>gb|ay271829.1|:384-1566h.alvei質(zhì)粒palvb，完整序列seqidno:26(abi核苷酸序列)>gb|ay271829.1|:1583-1918h.alvei質(zhì)粒palvb，完整序列序列表<110>上海凱賽生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司凱賽生物產(chǎn)業(yè)有限公司<120>參與賴氨酸脫羧作用的產(chǎn)酸克雷伯氏菌多肽的表達(dá)及其方法和應(yīng)用<130>77705-8007.wo00<160>26<170>patentinversion3.5<210>1<211>2148<212>dna<213>klebsiellaoxytoca<400>1atgaacgttatcgcaatcatgaatcacatgggtgtctacttcaaagaagaacccatccgt60gaactgcatcgcgccctcgaacgcctggacttccgtattgtctacccgaacgaccgtgaa120gacttattaaaacttatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgtgatcttcgactgggat180aaatataatctcgaactgtgcgaagacatcagcaaaatgaacgaatacatgccgctgtac240gcctttgcgaacacttactcaacgctggacgtgagcctcaacgatctgcggatgcaggtt300cgcttcttcgaatatgcgctgggcgcagcggaagacattgccaacaaaatcaaacagaat360accgacgagtatatcgacaccattctgccgccgctgaccaaagcgctgtttaaatacgtg420cgtgaaggcaaatacaccttctgtaccccaggccatatgggcggtaccgcgttccagaaa480agcccagtcggcagcatcttctacgatttctttggttccaataccatgaaatccgatatc540tcgatttcggtttctgaactcggttctctgctggaccacagcggcccgcacaaagaagcg600gaagagtacatcgcccgcgtcttcaacgcggaacgcagctacatggtgaccaacgggacc660tctaccgccaacaaaattgtcggcatgtattccgccccggccggtagcaccgtgctgatt720gaccgtaactgccataaatcgctgacccatctgatgatgatgagcgacattacgccaatc780tacttccgcccgacccgcaacgcctacggtatcctcggcggtatcccgcagagcgaattc840cagcatgcgaccatcgcgaagcgcgtgaaagaaaccccgaacgcgacctggccggtgcac900gcggttatcaccaactccacctatgacggtctgctgtacaacacggactacatcaagaaa960accctggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctcg1020ccgatttatgaaggcaaatgcgggatgagcggcggccgcgtcgaagggaaagtgatttac1080gaaacccagtccacgcacaaactgctggcggcgttctctcaggcctcgatgattcacgtt1140aaaggcgacgtgaacgaagagacctttaacgaagcctacatgatgcacaccaccacttct1200ccgcactacggcgtggtggcctcgacggaaaccgcggcggcgatgatgaaaggcaacgcc1260ggtaagcgcctgattgacggctctatcgaacgttcaatcaagttccgtaaagagatcaaa1320cgtctgaaaggcgagtccgacggctggttcttcgacgtctggcagccggaacatatcgat1380ggcgctgaatgctggccgctgcgctccgacagcgcgtggcacggcttcaaaaacatcgat1440aacgagcacatgtatctcgacccgattaaagtcacgctgctgactccggggatgaagaaa1500gacggcaccatggatgagttcggtattccggcgagcatcgtggcgaagtatctcgacgag1560cacggtatcgtggtcgaaaaaaccggtccgtacaacctgctgttcctgttcagtatcggt1620atcgacaaaaccaaagcgctgagcctgctgcgtgcgctgaccgatttcaaacgcgcgttc1680gacctgaacctgcgggtgaaaaacatgctgccgtcgctgtatcgtgaagatccggaattc1740tacgaaaacatgcgcgttcaggaactggcgcagaacattcataaactgattgagcaccac1800aacctgccggatctgatgttccgcgcgttcgaagtgctgccgaccatgatgatcacgccg1860tacgccgcgttccagaaagagctgcacggtcagaccgaagaggtgtatctcgaagagatg1920gtgggccgcgtcaacgccaatatgatcctgccgtatcctccgggagtgccgctggtgatg1980ccgggtgaaatgatcaccgaagagagccgtccggtgctggagttcctgcagatgctgtgc2040gaaatcggcgcccactatccgggcttcgaaaccgatatccacggcgcctatcgtcaggcg2100gatggtcgttacaccgttaaagtgctgaaagaagaaaataacaaataa2148<210>2<211>715<212>prt<213>klebsiellaoxytoca<400>2metasnvalilealailemetasnhismetglyvaltyrphelysglu151015gluproilearggluleuhisargalaleugluargleuaspphearg202530ilevaltyrproasnasparggluaspleuleulysleuilegluasn354045asnalaargleucysglyvalilepheasptrpasplystyrasnleu505560gluleucysgluaspileserlysmetasnglutyrmetproleutyr65707580alaphealaasnthrtyrserthrleuaspvalserleuasnaspleu859095argmetglnvalargphepheglutyralaleuglyalaalagluasp100105110ilealaasnlysilelysglnasnthraspglutyrileaspthrile115120125leuproproleuthrlysalaleuphelystyrvalarggluglylys130135140tyrthrphecysthrproglyhismetglyglythralapheglnlys145150155160serprovalglyserilephetyraspphepheglyserasnthrmet165170175lysseraspileserileservalsergluleuglyserleuleuasp180185190hisserglyprohislysglualagluglutyrilealaargvalphe195200205asnalagluargsertyrmetvalthrasnglythrserthralaasn210215220lysilevalglymettyrseralaproalaglyserthrvalleuile225230235240aspargasncyshislysserleuthrhisleumetmetmetserasp245250255ilethrproiletyrpheargprothrargasnalatyrglyileleu260265270glyglyileproglnserglupheglnhisalathrilealalysarg275280285vallysgluthrproasnalathrtrpprovalhisalavalilethr290295300asnserthrtyraspglyleuleutyrasnthrasptyrilelyslys305310315320thrleuaspvallysserilehispheaspseralatrpvalprotyr325330335thrasnpheserproiletyrgluglylyscysglymetserglygly340345350argvalgluglylysvaliletyrgluthrglnserthrhislysleu355360365leualaalapheserglnalasermetilehisvallysglyaspval370375380asnglugluthrpheasnglualatyrmetmethisthrthrthrser385390395400prohistyrglyvalvalalaserthrgluthralaalaalametmet405410415lysglyasnalaglylysargleuileaspglyserilegluargser420425430ilelysphearglysgluilelysargleulysglygluseraspgly435440445trpphepheaspvaltrpglnprogluhisileaspglyalaglucys450455460trpproleuargseraspseralatrphisglyphelysasnileasp465470475480asngluhismettyrleuaspproilelysvalthrleuleuthrpro485490495glymetlyslysaspglythrmetaspglupheglyileproalaser500505510ilevalalalystyrleuaspgluhisglyilevalvalglulysthr515520525glyprotyrasnleuleupheleupheserileglyileasplysthr530535540lysalaleuserleuleuargalaleuthraspphelysargalaphe545550555560aspleuasnleuargvallysasnmetleuproserleutyrargglu565570575aspprogluphetyrgluasnmetargvalglngluleualaglnasn580585590ilehislysleuilegluhishisasnleuproaspleumetphearg595600605alaphegluvalleuprothrmetmetilethrprotyralaalaphe610615620glnlysgluleuhisglyglnthrglugluvaltyrleu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