專利名稱：miR-145在制備治療炎癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種小分子RNA在制備藥物中的應(yīng)用，尤其涉及 miR-145在糖尿病等炎癥代謝性疾病治療中的作用。
背景技術(shù)：
隨著飲食和生活方式的改變，肥胖、糖尿病、高血脂、高血壓等代謝性疾病已成為 目前威脅人類健康的重要疾病。糖尿病及其慢性并發(fā)癥是常見的代謝性疾病之一，而糖尿 病大血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。以往大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大血管病 變主要是動(dòng)脈粥樣硬化病變，而高糖高脂是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變的主要因素。研究顯示， 高血糖、高血脂可致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，單核細(xì)胞粘附、遷移、移行進(jìn)入血管壁分化為巨噬細(xì)胞， 巨噬細(xì)胞一方面吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變成巨噬泡沫細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)、分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因 子一方面加劇了血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，同時(shí)也進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并促進(jìn)血管平 滑肌細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子，血管平滑肌細(xì)胞亦可吞噬脂質(zhì)而轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，后者是 糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)。近年來，研究提示天然免疫的激活在動(dòng)脈粥樣硬化的血管炎癥反應(yīng)過程中起主導(dǎo) 作用。天然免疫是機(jī)體針對(duì)各種理化損傷因素或周圍環(huán)境改變而啟動(dòng)的快速防御性的體 系。經(jīng)典的天然免疫系統(tǒng)包括巨噬細(xì)胞、抗原遞呈B細(xì)胞和樹狀突細(xì)胞。巨噬細(xì)胞激活后 可以分泌多種細(xì)胞因子，化學(xué)因子和生長因子，參與了動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病血管慢性炎 癥反應(yīng)的全過程。因此研究高糖高脂對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響，對(duì)闡明糖尿病血管 損傷的機(jī)制具有非常重要的意義。細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜。研究證實(shí)，微小RNAOiiicroRNAs，miRNAs)參 與了生命過程中的許多重要進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、脂肪代謝、胰島素代謝、免疫功能 等，并且還參與了諸如腫瘤、糖尿病的發(fā)生發(fā)展。miRNA是一種在進(jìn)化過程中高度保守的、內(nèi) 源性非編碼的約22個(gè)核苷酸左右的單鏈RNA小分子，它能以不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合到其靶 RNA的;T末端非翻譯區(qū)的某些特定區(qū)域，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用，抑制蛋白質(zhì)的合成。以往 的研究發(fā)現(xiàn)大約有哺乳動(dòng)物基因編碼miRNA，調(diào)控10%甚至更多的人類基因，然而絕大 部分miRNA的靶基因至今尚未明確，miRNA的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用對(duì)有關(guān)研 究基因表達(dá)的調(diào)控提供了重要的線索，能促使本領(lǐng)域更好的認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象的本質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種小分子RNA在制備藥物中的應(yīng)用，尤其涉及miR-145在 制備治療炎癥藥物中的應(yīng)用。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供miR-145在制備治療糖尿病等炎癥代謝性疾病藥物中的應(yīng)用。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供miR-145在制備檢測糖尿病制劑中的應(yīng)用。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供miR-145在制備治療糖尿病大血管病變的靶點(diǎn)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的miR-145還可作為炎癥性疾病的檢測監(jiān)督指標(biāo)，所述的miR-145的 抑制劑能用于促增殖藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案包括采用芯片技術(shù)研究觀察在高糖、高脂情況下，人巨噬細(xì)胞內(nèi)miRNA和細(xì)胞因子表 達(dá)的變化情況；并將miRNA芯片結(jié)果中下調(diào)的人miRNA和人細(xì)胞因子抗體芯片結(jié)果中上調(diào) 的人細(xì)胞因子基因通過生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行比較以預(yù)測miRNA可能的靶細(xì)胞因子基因；采 用相關(guān)的miRNA研究技術(shù)，了解miRNA在糖尿病大血管炎癥病變過程中的作用及其作用靶 點(diǎn)，并探索建立通過干預(yù)miRNA以防治糖尿病慢性并發(fā)癥的方法。具體而言，本發(fā)明首先應(yīng)用芯片研究高糖高脂對(duì)人巨噬細(xì)胞miRNA基因表達(dá)的影 響，觀測miRNA在炎癥代謝性疾病中的作用。結(jié)果顯示高糖高脂下調(diào)83個(gè)miRNA基因的 表達(dá)，其中葡萄糖、AcLDL、葡萄糖+AcLDL及油酸共同下調(diào)的miRNA有7個(gè)，而高糖高脂上調(diào) 的miRNA僅1個(gè)。本發(fā)明將miRNA芯片結(jié)果中下調(diào)的人miRNA和人細(xì)胞因子抗體芯片結(jié)果中上調(diào)的 人細(xì)胞因子基因通過生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行比較，預(yù)測miRNA可能的靶細(xì)胞因子基因，結(jié)果 顯示，42個(gè)細(xì)胞因子的上調(diào)可能是因?yàn)楦咛歉咧抡{(diào)了相應(yīng)的miRNA所致。故，推測該些 miRNA有可能介導(dǎo)了高糖高脂影響巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)。OPG為腫瘤壞死因子受體超家族中的一個(gè)分泌蛋白，能與TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配 體(TRAIL)相互作用而廣泛調(diào)控細(xì)胞凋亡，研究表明OPG在糖尿病大血管病變中發(fā)揮重要 作用，其中，糖尿病患者的循環(huán)血中OPG水平上升，在粥樣斑塊中OPG也明顯上調(diào)。OPG還與 核因子-κ B受體活化因子(RANK)相互作用導(dǎo)致血管壁鈣化，而血管鈣化被認(rèn)為是糖尿病 心血管死亡率的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)及基礎(chǔ)的病理學(xué)變化之一。此外，OPG能通過其假受體(Decoy Receptor)中和促凋亡因子TRAIL的活性，因而能防止細(xì)胞凋亡。因此OPG在糖尿病AS的 發(fā)病過程中扮演著重要的角色。本發(fā)明利用數(shù)據(jù)庫通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測到miR-145能 負(fù)調(diào)控0PG，在糖尿病大血管病變中發(fā)揮作用。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)觀測miR-145在糖尿病大血管病變中的作用如下1.評(píng)估高糖、高脂對(duì)OPG表達(dá)的影響用人細(xì)胞因子抗體芯片觀測高糖、高脂對(duì)人巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響，結(jié)果 顯示，高糖、高脂可以上調(diào)OPG的基因表達(dá)，western bolt技術(shù)證實(shí)OPG蛋白表達(dá)也明顯增 加；同時(shí)，結(jié)果顯示，OPG在人動(dòng)脈粥樣硬化樣本平滑肌細(xì)胞中表達(dá)增加，表明OPG在糖尿病 大血管病變過程中發(fā)揮重要作用。2.評(píng)估高糖、高脂對(duì)人巨噬細(xì)胞miR-145表達(dá)的影響觀察糖耐量受損病人(IGT)、2型糖尿病人(2-DM)與正常對(duì)照組人群相比， miR-145的基因表達(dá)的差別采用miRCURYTM表達(dá)譜芯片觀察高糖、高脂對(duì)人巨噬細(xì)胞 miRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，高糖、高脂可下調(diào)83個(gè)miRNA基因的表達(dá)，通過生物信息學(xué)技 術(shù)預(yù)測顯示miR-145可負(fù)調(diào)控OPG ；同時(shí)本發(fā)明分組采集了 IGT、2_DM病人和正常對(duì)照組人群的外周靜脈血，分離出 外周血單個(gè)核細(xì)胞，抽提RNA，用realtime PCR方法檢測miR-145的表達(dá)，并進(jìn)行比較，結(jié)果 顯示，IGT和2-DM病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145的基因表達(dá)水平較對(duì)照組人群低，說明miR-145在IGT和2-DM中表達(dá)有下調(diào)，進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-145在糖尿病大血管中的作用。
3.證實(shí)miR-145負(fù)調(diào)控OPG實(shí)驗(yàn)分別將miR-145的抑制劑和前體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，通過Westernblot 檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了 miR-145抑制劑的細(xì)胞中OPG表達(dá)上調(diào)，而轉(zhuǎn)染了 miR-145前 體的細(xì)胞中OPG表達(dá)下調(diào)，強(qiáng)烈提示OPG的表達(dá)受到miR-145的負(fù)調(diào)控；為進(jìn)一步證明 miRNA-145可以與OPG基因序列3’末端非翻譯區(qū)(3’ -UTR)直接作用調(diào)控OPG表達(dá)，本發(fā) 明將OPG mRNA 3’ -UTR片段克隆到熒光素酶載體中，分別與miR-145的前體或抑制劑共轉(zhuǎn) 染HEK 293細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染了 miRNA-145抑制劑使得熒光素酶 活性明顯增加，而共轉(zhuǎn)染了 miR NA-145前體后熒光素酶活性減低，結(jié)果表明，miRNA-145可 以通過與OPG基因序列3’末端非翻譯區(qū)(3’ -UTR)直接作用調(diào)控OPG蛋白表達(dá)，在糖尿病 大血管炎癥病變中發(fā)揮重要作用。4.過表達(dá)的OPG對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響在THP-I細(xì)胞培液中加入重組人OPG蛋白，用XTT實(shí)驗(yàn)的方法，觀測OPG對(duì)細(xì)胞增 殖的影響，結(jié)果顯示，與未加入OPG蛋白的對(duì)照組相比，培液中加入OPG蛋白的細(xì)胞增殖明 顯增加；同時(shí)用Armexin V/propidium iodide標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞儀的方法發(fā)現(xiàn)加入OPG蛋 白抑制了 THP-I細(xì)胞的凋亡，而向培液中同時(shí)加入OPG蛋白及其生理配體核因子_ κ B受體 活化因子配體(RANKL)，可以逆轉(zhuǎn)OPG蛋白對(duì)THP-I細(xì)胞凋亡的抑制作用，結(jié)果表明，OPG能 促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、抑制凋亡，從而在糖尿病大血管動(dòng)脈粥樣硬化病變中發(fā)揮重要作用。5. miR-145對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響(l)miR-145對(duì)細(xì)胞增殖的影響基于上述實(shí)驗(yàn)已證實(shí)miR-145是OPG的調(diào)節(jié)因 子，而OPG對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡有影響，采用XTT實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞生長曲線等方法，檢測miR-145 也具有類似的生物學(xué)活性，結(jié)果證實(shí)，THP-I細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后，與過表達(dá)OPG蛋 白的結(jié)果一致，細(xì)胞增殖增加，而加入了 RANKL后，miR-145抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 減弱；另一方面，轉(zhuǎn)染了 miR-145前體的細(xì)胞增殖減緩，結(jié)果表明miR-145的抑制劑可通過 上調(diào)OPG部分促進(jìn)THP-I細(xì)胞的增殖。(2)miR_145對(duì)細(xì)胞凋亡的影響采用免疫印跡與免疫熒光等方法探討miR-145對(duì) 內(nèi)源性與外源性凋亡通路的影響，結(jié)果顯示miR-145可通過影響B(tài)ax，Bcl-2, Caspase-9, Caspase-3、poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)等多個(gè)凋亡因子，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；與現(xiàn) 有技術(shù)公開的，在外源性凋亡途徑激活后，Bax可由彌散分布的形式轉(zhuǎn)變成胞內(nèi)的點(diǎn)桿狀分 布比較，本發(fā)明結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了 miR-145前體的細(xì)胞中Bax呈點(diǎn)桿狀分布，同時(shí)用TUNEL 的方法證實(shí)了過表達(dá)miR-145增加原位細(xì)胞的凋亡；另外，轉(zhuǎn)染了 miR-145前體后，293細(xì) 胞和P53陰性的H1299細(xì)胞有凋亡增加，表明miR-145可以不通過p53誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而 miR-145抑制劑可以作為一種抑制細(xì)胞凋亡的因子。6.過表達(dá)miR-145可以導(dǎo)致染色體分離本發(fā)明進(jìn)一步研究miR-145對(duì)染色體分離的影響，分別用miR-145的前體和抑制 劑轉(zhuǎn)染HEK293及HeLa腫瘤細(xì)胞株，采用免疫熒光技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了 miR-145前體的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的染色體橋和落后染色體的異常染色體分離現(xiàn)象，結(jié)果表明 miR-145能引起染色體的異常排列，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。7.小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)miR-145抑制劑促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖
選用了 C57BL6/J小鼠，分為對(duì)照組、miR-145組和miR-145抑制劑組，分別向小鼠 體內(nèi)注射PBS、miR-145寡核苷酸和miR-145抑制劑寡核苷酸，注射三次后用免疫組化等方 法觀察小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的變化，結(jié)果顯示，注射miR-145抑制劑的小鼠體內(nèi)骨髓單個(gè)核 細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組和miR-145組明顯增加；小鼠組織石蠟切片結(jié)果顯示，注射miR-145 抑制劑組的小鼠肝臟組織巨噬細(xì)胞表面特異標(biāo)記分子⑶68染色明顯增加，增殖指標(biāo)PCNA 染色也明顯增加，說明抑制了體內(nèi)miR-145后，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞增多，引起炎癥免疫反應(yīng)，提 示miR-145在代謝性疾病的炎癥過程中的作用。本發(fā)明用microRNA芯片和細(xì)胞因子抗體芯片研究了在高糖、高乙?；疞DL等情 況下人巨噬細(xì)胞的microRNA和細(xì)胞因子的表達(dá)譜。結(jié)果表明，miR-145表達(dá)下調(diào)，而骨保 護(hù)素0PG表達(dá)上調(diào)；在未服用口服降糖藥物的口服糖耐量受損(IGT)和2型糖尿病的患者 中，miR-145表達(dá)較正常對(duì)照組人群下調(diào)；在糖尿病動(dòng)脈粥樣斑塊中，0PG表達(dá)上調(diào)，并且 0PG的水平與冠心病的嚴(yán)重程度與血糖的控制情況相關(guān)；另外，結(jié)果還顯示，miR-145能負(fù) 調(diào)控0PG，轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后，0PG的表達(dá)上調(diào)，而過表達(dá)miR-145后，0PG的表達(dá)下調(diào)； 進(jìn)一步采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-145可以與0PG的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合負(fù)調(diào)控0PG的蛋 白表達(dá)；結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)染了 miR-145抑制劑可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，而過表達(dá) miR-145可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、引起異常的染色體分離現(xiàn)象；小鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，體內(nèi)注 射miR-145抑制劑可以引起小鼠肝臟組織巨噬細(xì)胞明顯增加，小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖能 力增加，說明在體內(nèi)抑制了 miR-145的表達(dá)可以導(dǎo)致體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的增殖浸潤，導(dǎo)致 體內(nèi)炎癥反應(yīng)，換言之，miR-145在抗炎反應(yīng)中發(fā)揮作用。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，在高糖、高脂情況下，microRNA參與糖尿病血管病變等代謝疾 病的炎癥病變發(fā)生發(fā)展，可用于制備治療炎癥藥物，尤其是制備治療糖尿病等炎癥代謝性 疾病藥物及制備檢測糖尿病制劑。所述的miR-145可成為糖尿病病人檢測指標(biāo)之一，并作 為糖尿病大血管病變等炎癥性疾病的治療靶點(diǎn)。


圖1是細(xì)胞因子抗體芯片結(jié)果表明，其中，高糖、高脂上調(diào)骨保護(hù)素0PG的表達(dá)，并 通過western的方法驗(yàn)證了芯片的結(jié)果。圖2是MicroRNA芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中，高糖、高脂下調(diào)miR-145表達(dá)，并通過 real-time PCR的方法進(jìn)一步證實(shí)了芯片結(jié)果。圖3是體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-145，0PG表達(dá)下調(diào)，抑制細(xì)胞內(nèi) miR-145, 0PG表達(dá)上調(diào)。圖4是熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-145直接與0PG 3’末端非翻譯區(qū)相互作用，其中， 負(fù)調(diào)控0PG表達(dá)，0PG是miR-145的靶蛋白。圖5是體外試驗(yàn)結(jié)果，其中細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染了 miR-145抑制劑可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而 過表達(dá)miR-145可以抑制細(xì)胞增殖。圖6體外試驗(yàn)結(jié)果，其中過表達(dá)miR-145可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡、引起異常的染色體分 離現(xiàn)象。圖7小鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，其中顯示，體內(nèi)注射miR-145抑制劑可以引起小鼠肝臟組 織巨噬細(xì)胞明顯增加，小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖能力增加。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所涉及的實(shí)驗(yàn)用生物材料和試劑均可市購。實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng)THP-1人巨噬細(xì)胞細(xì)胞株，培養(yǎng)在含10% FBS的RPMI 1640 (Gibco)培養(yǎng)液中，至 于37°C溫箱，5% C02,當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，在培養(yǎng)液中加入200nM 12-0-tetradecan oylphorbol-13-acetate (TPA, Cell Signaling Technology)，48 小時(shí)后分化成巨噬細(xì)胞。 HeLa和HEK 293腫瘤細(xì)胞株，培養(yǎng)在含10% FBS的高糖DMEM(Gibco)培養(yǎng)液中，至于37°C 溫箱，5% C02。2.分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，real-time PCR檢測miR-145在簽署知情同意書情況下，分別取5個(gè)正常對(duì)照組、新發(fā)現(xiàn)口服糖耐量受損人群、 新診斷2型糖尿病患者各2ml外周靜脈血，用聚蔗糖/泛影鈉密度梯度離心的方法分離外 周血，獲取單個(gè)核細(xì)胞。使用mirVana mi RNA Isolation Kit (Ambion) RNA提取試劑盒按說 明書步驟抽提純化外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)進(jìn)行定量并檢測RNA純度。各個(gè) 樣品各取30ng總RNA為模板，使用Amibion提供的針對(duì)miR-145的逆轉(zhuǎn)錄引物及mirVana qRT-PCR mi RNA detection kit (Ambion)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用針對(duì) miR-145 的 PCR 引物及 mirVana qRT-PCR mi RNA detection kit (Ambion)提供的熒光定量 PCR體系，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，測各個(gè)樣品的Ct值，用U6基因作為內(nèi) 參校正各組樣品上樣量的差別后，使用2_ACT方法比較各組之間miR-145表達(dá)的差異。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用電穿孔的方法轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞miR-145的前體和抑制劑。為了獲取最大的轉(zhuǎn) 染效率，本發(fā)明優(yōu)化了電壓，電容和有效的RNA濃度。具體電穿孔步驟如下首先用無血清 的RPMI 1640重新懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為5 X 106/250 iil，然后向0. 4-cm電穿孔杯內(nèi)加 入THP-1細(xì)胞懸浮液和6. 75 ill miRNA(50nM)的前體或抑制劑，冰上放置lOmin。使用BTX ECM 630電穿孔儀，電壓和電容分別為170V和2000 u F。電穿孔后冰上放置15min，放入6 孔板中，加入含10% FBS的培液到2. 5ml，48小時(shí)后收集蛋白用western blot技術(shù)檢測。使用siPORT neoFX (Ambion)轉(zhuǎn)染HEK 293 cells和Hela細(xì)胞，分為對(duì)照組、轉(zhuǎn)染 miR-145的抑制劑組、轉(zhuǎn)染miR-145的前體組、轉(zhuǎn)染miR-145的前體和加入0PG組這四組，具 體轉(zhuǎn)染方法參照說明書要求進(jìn)行，miRNA工作濃度為50nmol/L，48小時(shí)收集蛋白用western blot技術(shù)檢測。4.熒光素酶實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建0PG 3’ UTR的克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)包含miR-145的結(jié)合位點(diǎn)。然后將帶熒 光素酶的質(zhì)粒和mina的抑制劑或者前體用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，以半乳糖苷酶質(zhì)粒作為校正。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測熒光素酶的強(qiáng)度。5.蛋白印跡分析用RIPA裂解細(xì)胞，提取總蛋白，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量。在蛋白樣品中加入上樣緩 沖液，100°C煮沸5分鐘后，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓100V。電泳完后，將蛋白轉(zhuǎn) 移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，后用所要檢測的蛋白一抗4°C孵育過夜，二抗 室溫孵育2小時(shí)，發(fā)光液顯色。用actin做對(duì)照校正上樣量差別后，對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行分析。
6.免疫細(xì)胞化學(xué)先在24孔板內(nèi)放入已預(yù)先泡酸、滅菌的蓋玻片，然后將細(xì)胞種植到24孔板內(nèi)，分 別轉(zhuǎn)染miR-145前體或抑制劑。待板上鋪滿一層細(xì)胞后，用PBS洗細(xì)胞兩次后加入含0. 1% Triton X-100的PHEM緩沖液透化lmin，然后在4%低聚甲醛和0. 05%戊二醛PHEM中固定。 用的牛血清白蛋白(Sigma)封閉細(xì)胞，一抗室溫孵育1-2小時(shí)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗室溫孵 育1小時(shí)。用DAPKChemicon)復(fù)染細(xì)胞核，然后用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察， 記錄圖像分析。7.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用XTT比色法(Sigma-Aldrich Chemicals)檢測細(xì)胞的增殖。電穿孔轉(zhuǎn)染THP-1 細(xì)胞miR-145前體或抑制劑后，將細(xì)胞加入96孔板中，放入37°C溫箱，72小時(shí)后檢測細(xì)胞 的增殖情況進(jìn)行比較。用siPORT neoFX(Ambion)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞miR-145前體或抑制劑后，連續(xù)四天計(jì)數(shù) 細(xì)胞數(shù)變化，做細(xì)胞生長曲線。8.凋亡實(shí)驗(yàn)在THP-1細(xì)胞培液中加入重組人0PG蛋白，24小時(shí)后用Annexin V/ propidiumiodide (BioVision)標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞儀的方法評(píng)估凋亡的情況。用免 疫印跡的方法檢測過表達(dá)miR-145后凋亡因子Bax，Bcl-2, Caspase-9，Caspase_3、 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)的變化。用TUNEL的方法檢測過表達(dá)miR-145對(duì)原位 細(xì)胞的凋亡的影響。9.小鼠體內(nèi)試驗(yàn)選用12周的雄性C57BL/6小鼠實(shí)施體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，先對(duì)小鼠行頸靜脈插管，待插管小 鼠情況穩(wěn)定后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-145組和miR-145抑制劑組，分別向小鼠體內(nèi) 注射PBS、miR-145寡核苷酸和miR-145抑制劑寡核苷酸，連續(xù)三日，三日后將小鼠麻醉后處 死進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-145表達(dá)下調(diào)，而骨保護(hù)素0PG表達(dá)上調(diào)；在未服用口服降糖 藥物的口服糖耐量受損(IGT)和2型糖尿病的患者中，miR-145表達(dá)較正常對(duì)照組人群下 調(diào)；在糖尿病動(dòng)脈粥樣斑塊中，0PG表達(dá)上調(diào)，并且0PG的水平與冠心病的嚴(yán)重程度與血糖 的控制情況相關(guān)；另外，結(jié)果還顯示，miR-145能負(fù)調(diào)控0PG，轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后，0PG的 表達(dá)上調(diào)，而過表達(dá)miR-145后，0PG的表達(dá)下調(diào)；進(jìn)一步采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-145 可以與0PG的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合負(fù)調(diào)控0PG的蛋白表達(dá)；結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)染了 miR-145抑 制劑可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)miR-145可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、引起異常的 染色體分離現(xiàn)象；小鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，體內(nèi)注射miR-145抑制劑可以引起小鼠肝臟組 織巨噬細(xì)胞明顯增加，小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖能力增加，說明在體內(nèi)抑制了 miR-145的 表達(dá)可以導(dǎo)致體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的增殖浸潤，導(dǎo)致體內(nèi)炎癥反應(yīng)，換言之，miR-145在抗炎 反應(yīng)中發(fā)揮作用。SEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院<120>miR_145在抗炎癥治療中的應(yīng)用<130>42
8
<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>88<212>RNA<213>Homo sapiens<400>1caccuugucc ucacggucca guuuucccag gaaucccuua gaugcuaagauggggauucc60uggaaauacu guucuugagg ucaugguu 88<210>2<211>23<212>RNA<213>Homo sapiens<400>2guccaguuuu cccaggaauc ccu2權(quán)利要求
miR-145在制備治療炎癥藥物中的應(yīng)用。
2.miR-145在制備治療炎癥代謝性疾病藥物中的應(yīng)用。
3.按權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述的藥物是糖尿病大血管病變的靶點(diǎn)藥物。
4.按權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述的代謝性疾病是糖尿病。
5.miR-145在制備檢測糖尿病制劑中的應(yīng)用。
6.miR-145在制備炎癥性疾病的檢測監(jiān)督指標(biāo)中的應(yīng)用。
7.一種含有miR-145的抑制劑。
8.按權(quán)利要求1的抑制劑在制備促增殖藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種小分子RNA在制備藥物中的應(yīng)用，尤其涉及miR-145在糖尿病等炎癥代謝性疾病治療中的作用。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，在高糖、高脂情況下，microRNA參與糖尿病血管病變等代謝疾病的炎癥病變發(fā)生發(fā)展，可用于制備治療炎癥藥物，尤其是制備治療糖尿病等炎癥代謝性疾病藥物及制備檢測糖尿病制劑。所述的miR-145可成為糖尿病病人檢測指標(biāo)之一，并作為糖尿病大血管病變等炎癥性疾病的治療靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101843632SQ20091004810
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者張偉偉, 楊志紅, 梁文昌, 胡仁明 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院