本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及靈芝孢子粉糖肽提取物及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞減少癥(簡(jiǎn)稱白減)是由多種病因引起的一組綜合癥。白細(xì)胞減少癥以周圍白細(xì)胞總數(shù)持續(xù)低于4.0×109/L為主要診斷依據(jù)，是目前臨床內(nèi)科常見的一種疾病，根據(jù)其發(fā)病原因可分為原因不明性和繼發(fā)性兩種。繼發(fā)于腫瘤化療、放療后的白細(xì)胞減少癥有別于繼發(fā)于其它感染性疾病(如：傷寒、副傷寒、黃熱病等)，這一嚴(yán)重毒副作用的發(fā)生常使腫瘤的放、化療被迫停止。近年來(lái)國(guó)內(nèi)許多醫(yī)療單位充分發(fā)揮中醫(yī)藥的特長(zhǎng)與優(yōu)勢(shì)，將中醫(yī)藥與化、放療綜合應(yīng)用，在防治惡性腫瘤化、放療中的毒副反應(yīng)方面取得了一定的療效和進(jìn)展。尤其是近年來(lái)在防治白細(xì)胞減少癥方面的研究十分活躍。
近年來(lái)，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增高，成為威脅人類身體健康的常見病。目前惡性腫瘤主要采取手術(shù)、化療、放療、生物治療等綜合治療?；熢谄渲姓純?yōu)舉足輕重的位置，但其毒副作用強(qiáng)烈，用于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間缺少根本性的代謝差異，所有的化療藥物都不能完全避免對(duì)正常細(xì)胞如骨髓造血細(xì)胞、消化道黏膜上皮細(xì)胞等的損害。因?yàn)榛熢跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，極易導(dǎo)致病人狀況的惡化甚至死亡。化療的毒副作用主要表現(xiàn)是對(duì)骨髓造血功能的抑制，骨髓是人體免疫中樞之一，骨髓受抑制，造成白細(xì)胞減少，抗病能力隨之下降，嚴(yán)重時(shí)紅細(xì)胞、血小板也同時(shí)下降。糾正化療后白細(xì)胞減少以往常用西藥生白藥碳酸鋰、利血生、肌苷、維生素B4等治療，藥物種類雖多，但療效不太滿意，而利血生、維生素B等促核酸代謝物升白作用同時(shí)也有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)作用。輸注白細(xì)胞治療，一方面價(jià)格較高，患者難以承受；另一方面在患者體內(nèi)因排異活動(dòng)存活時(shí)間短，而且有促進(jìn)癌腫復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能。目前已廣泛應(yīng)用集落細(xì)胞刺激因子(G-CSF)以預(yù)防和治療化療藥物所引起的白細(xì)胞減少癥，療效較好；還可以采用病人自體骨髓移植，但這些療法有較高的醫(yī)療與經(jīng)濟(jì)條件的要求，臨床上難以廣泛應(yīng)用。
近年來(lái)的研究表明，中醫(yī)藥升高白細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)了西醫(yī)療法的不足。中藥能扶正固本，減毒增效；療效穩(wěn)定、持久；提高機(jī)體免疫功能，調(diào)動(dòng)機(jī)體抗癌能力；加強(qiáng)機(jī)體對(duì)化療藥物的敏感性，有利于化療的順利完成；減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，盡可能雖短住院天數(shù)；延長(zhǎng)生存期，提高生存質(zhì)量。
靈芝孢子是靈芝發(fā)育后期釋放出來(lái)的擔(dān)孢子，其所含的化學(xué)成份與靈芝子實(shí)體相比，蛋白質(zhì)、氨基酸含量高于靈芝，多糖肽、腺嘌呤核苷、有機(jī)鍺、酸性B葡聚糖等成份不僅含量高于靈芝子實(shí)體，且在種類和結(jié)構(gòu)上均存在差異?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，靈芝孢子粉具有抗腫瘤、抗炎、保護(hù)肝臟、降低膽固醇、降血糖、抗輻射、增強(qiáng)免疫力功能和抗病毒作用。臨床觀察顯示靈芝孢子粉能減輕惡性腫瘤放化療的毒副反應(yīng)，改善臨床癥狀，改善患者生活質(zhì)量，幫助腫瘤患者順利完成放化療，延長(zhǎng)生存期提高了臨床療效。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的首要目的是提供靈芝孢子粉糖肽提取物的制備方法，以操作簡(jiǎn)便、綠色安全、成本低、提取效果好、不破壞提取物結(jié)構(gòu)、溶劑可以回收重復(fù)利用、易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
為實(shí)現(xiàn)此目的，在基礎(chǔ)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其依次包括濃醇提取、稀醇提取、合并濃醇提取液與稀醇提取液的乙醚脫脂、除雜脫色、樹脂純化步驟，
其中濃醇提取步驟是將靈芝孢子粉用85-95％乙醇(乙醇濃度為體積百分比濃度，以下相同)70-100℃下加熱回流提取2-5次，合并提取液；
稀醇提取步驟是將濃醇提取完畢的靈芝孢子粉藥渣用55-65％乙醇80-100℃下加熱回流提取1-5次，合并提取液，95％乙醇沉淀后取上清。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中濃醇提取步驟中每次提取時(shí)85-95％乙醇的量(L)為靈芝孢子粉量(kg)的2-10倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中濃醇提取步驟中每次提取時(shí)間為0.5-3小時(shí)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中濃醇提取步驟中進(jìn)一步將合并提取液減壓濃縮至無(wú)醇味。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中稀醇提取步驟中每次提取時(shí)55-65％乙醇的量(L)為靈芝孢子粉藥渣量(kg)的3-10倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中稀醇提取步驟中每次提取時(shí)間為0.5-3小時(shí)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中稀醇提取步驟中進(jìn)一步將合并提取液減壓濃縮至體積(L)為孢子粉質(zhì)量(kg)的0.05-2倍后再進(jìn)行95％乙醇沉淀。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中稀醇提取步驟中95％乙醇沉淀時(shí)95％乙醇的量(L)為靈芝孢子粉藥渣量(kg)的2-12倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中稀醇提取步驟中95％乙醇沉淀時(shí)加入95％乙醇后靜置4-48小時(shí)，抽濾，濾渣棄去取上清。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中稀醇提取步驟中進(jìn)一步將上清濃縮至無(wú)醇味。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中合并濃醇提取液與稀醇提取液的乙醚脫脂步驟是合并濃醇提取液和稀醇提取液，加水配制成藥液，向藥液中加入乙醚進(jìn)行萃取，共萃取5～12次，合并水層除乙醚后加水得藥液。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中合并濃醇提取液與稀醇提取液的乙醚脫脂步驟中加水配制成藥液時(shí)藥液體積(L)為孢子粉質(zhì)量(kg)的0.05-2倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中合并濃醇提取液與稀醇提取液的乙醚脫脂步驟中每次萃取時(shí)乙醚加入量
(L)為藥液體積(L)的0.1-2倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中合并濃醇提取液與稀醇提取液的乙醚脫脂步驟中合并水層除乙醚后加水所得藥液的體積(L)為孢子粉質(zhì)量(kg)的0.05-2倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中除雜脫色步驟是在乙醚脫脂后的藥液中先后加入SM-A天然硅膠溶液、SM-B葡聚糖溶液進(jìn)行脫脂，離心后取上清。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中除雜脫色步驟中的操作溫度為30-90℃。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中除雜脫色步驟中SM-A天然硅膠溶液的濃度為0.5-5％(m/v)，其加入后保溫放置半小時(shí)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中SM-A天然硅膠溶液的具體配制方法為：
配制量：靈芝孢子粉(投料量):硅膠SM-A:純化水＝1kg:1g:50mL，
將SM-A用80-90℃純化水配制成2％(g/ml)的溶液，放置燒杯中，邊加入邊攪拌，直至所有SM-A固體粉末分散到水溶液中形成均勻無(wú)顆粒狀的白色膠體混懸溶液。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中除雜脫色步驟中SM-B天然硅膠溶液的濃度為0.5-4％(m/v)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中SM-B葡聚糖溶液的配制具體方法為：
配制量：靈芝孢子粉(投料量):SM-B:純化水:冰醋酸＝1kg:0.0167g:1.67mL:0.0167mL，
用燒杯將SM-B溶解在50-60℃的1％(ml/ml)冰醋酸溶液中，配制成含SM-B為1％(g/ml)的濃度，邊加入邊攪拌。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中除雜脫色步驟中進(jìn)一步將上清濃縮至藥液體積(L)為孢子粉質(zhì)量(kg)的0.05-2倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中樹脂純化步驟是將上清上HP-20大孔樹脂后先后以水、10-20％乙醇、95％乙醇沖洗，收集10-20％乙醇沖洗所得洗脫液，減壓濃縮除乙醇。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中樹脂純化步驟中水、10-20％乙醇、95％乙醇沖洗的體積各為1-7BV(BV為樹脂體積量)，沖洗流速均為0.5-4BV/小時(shí)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中樹脂純化步驟中進(jìn)一步將減壓濃縮除乙醇的洗脫液進(jìn)行干燥處理，得孢子粉糖肽(1)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其是將經(jīng)濃醇提取、稀醇提取后殘留的靈芝孢子粉藥渣進(jìn)一步進(jìn)行包括水提取、醇沉淀和精制步驟的處理，其中水提取步驟是將濃醇和稀醇提取過的靈芝孢子粉藥渣加水后80-100℃加熱回流提取1-5次，合并提取液。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中水提取步驟中每次水的加入量(L)為靈芝孢子粉藥渣量(kg)的3-12倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中水提取步驟中每次水提取的時(shí)間為0.5-3小時(shí)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中水提取步驟中進(jìn)一步將合并提取液濃縮至體積(L)為孢子粉質(zhì)量(kg)的0.05-3倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中醇沉淀步驟是在合并水提取液中加入1-8倍量的乙醇沉淀，干燥沉淀。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中醇沉淀步驟的沉淀時(shí)間為8-60小時(shí)
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中精制步驟是將醇沉淀物加水后制成糖肽溶液，加氯仿-正丁醇溶液沉淀6-15次，每次取上清而棄沉淀，干燥最后得上清，即為孢子粉糖肽(2)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中精制步驟中加入氯仿-正丁醇溶液中氯仿與正丁醇的體積比為4:1。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中精制步驟中每次加入氯仿-正丁醇溶液的體積為糖肽溶液體積的0.1-0.6倍。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靈芝孢子粉糖肽的制備方法，其中精制步驟中每次沉淀時(shí)間為10-30分鐘。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供靈芝孢子粉糖肽提取物，其是根據(jù)前述方法制備，在用于升高白細(xì)胞時(shí)有更好的效果。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供根據(jù)本發(fā)明的方法制備獲得的靈芝孢子粉糖肽提取物在制備升高白細(xì)胞藥物中的用途。
利用如上基礎(chǔ)的實(shí)施方案和優(yōu)選的實(shí)施方案制備靈芝孢子粉糖肽，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明采用濃醇稀醇提取、乙醚脫脂、水提、醇沉等操作獲得孢子粉糖肽(1)和(2)，整個(gè)方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單易操作、生產(chǎn)成本低、提取效果好、可工業(yè)化生產(chǎn)、溶劑可回收重復(fù)利用等優(yōu)勢(shì)。
2、本發(fā)明采用硅膠和葡聚糖溶液進(jìn)行除雜脫色，與活性炭脫色相比較，具有不會(huì)破壞糖肽結(jié)構(gòu)、容易過濾，脫色完全、得率高的優(yōu)點(diǎn)，而且方法簡(jiǎn)單易行、綠色安全、便于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)。孢子粉多糖溶液經(jīng)活性炭脫色，糖肽得率0.13％(糖肽得率為所得糖肽與投料生藥的重量比值，以下相同)，經(jīng)硅膠和葡聚糖溶液除雜脫色，糖肽得率0.22％。
3、本發(fā)明采用HP-20大孔樹脂吸附藥液，先用水洗脫去除單糖、極性雜質(zhì)和大部分色素，再用15％乙醇洗脫獲得孢子粉糖肽(1)，得率為0.22％，多糖含量19.18％，酸水解氨基酸含量18.87mg/100mg。
4、醇提后孢子粉用水提醇沉工藝處理，經(jīng)過精制能得到純度高的孢子粉糖肽(2)，其得率能達(dá)到1.55％，多糖含量達(dá)到71.49％，酸水解氨基酸含量4.52mg/100mg。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作出進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1：靈芝孢子粉糖肽的提取方法一
將過80目篩的靈芝孢子粉1kg置圓底燒瓶中，加入5倍量95％乙醇，加熱80℃，回流提取第一遍，提取時(shí)間為2小時(shí)，抽濾，得提取液1，藥渣加入4倍量95％乙醇，加熱80℃，回流提取第二、三遍，提取時(shí)間為1小時(shí)，抽濾，得提取液2、3，合并提取液1、2、3，減壓濃縮至無(wú)醇味，得濃醇提取濃縮液。
繼續(xù)向靈芝孢子粉藥渣中加入4倍量60％乙醇，加熱90℃，回流提取3次，每次1小時(shí)。抽濾，得提取液4、5、6，合并提取液4、5、6，減壓濃縮得300ml藥液，加入7倍量(2.1L)95％乙醇進(jìn)行醇沉，攪拌均勻，靜置24小時(shí)。抽濾，濾渣棄去，濾過的醇沉液減壓濃縮至無(wú)醇味，得稀醇提取濃縮液。
合并濃醇提取濃縮液和稀醇提取濃縮液，減壓濃縮至400ml藥液，向藥液中加入250ml乙醚，進(jìn)行萃取，共萃取8次，脫脂后的藥液(水層)加熱蒸至無(wú)乙醚味，加入純化水配制成400ml的藥液。
水浴加熱藥液，藥液溫度控制在50-60℃。先將2％SM-A天然硅膠溶液50ml加入到上述藥液中，攪拌均勻，保溫放置半小時(shí)；再將1％SM-B葡聚糖溶液1.67ml緩慢加入藥液中，邊加邊攪拌，放置至室溫，待藥液沉淀完全，離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速控制在3000轉(zhuǎn)左右，每次20分鐘，沉淀物舍棄，取上清液，減壓濃縮至100ml。
取除雜脫色的藥液，用HP-20大孔樹脂吸附至飽和，先用5BV的水以2BV/小時(shí)的流速?zèng)_洗，得A部分洗脫液；再用5BV的15％的乙醇以2BV/小時(shí)的流速?zèng)_洗，得B部分洗脫液；接著再用5BV的95％乙醇以3BV/小時(shí)的流速?zèng)_洗，得C部分洗脫液；三份洗脫液分別在-0.09MPa、70℃條件下，減壓濃縮回收乙醇，B部分(15％乙醇洗脫部分)干燥得2.2g靈芝孢子粉糖肽(1)，得率為0.22％，多糖含量19.18％，酸水解氨基酸含量18.87mg/100mg。
將濃醇和稀醇提取過的靈芝孢子粉藥渣風(fēng)干，向風(fēng)干后的藥渣中加入8倍量的純化水，加熱100℃，回流提取3次，每次2小時(shí)。抽濾，合并水提取液；靜置、過濾、減壓濃縮0.5L。向水提取濃縮液中加入5倍量的乙醇沉淀糖肽，攪拌均勻，靜置24小時(shí)。抽濾，濾出糖肽后干燥得粗孢子粉糖肽，加純化水配制成500ml溶液，加入125ml的氯仿-正丁醇(4:1)振搖20分鐘，離心除去沉淀，上層溶液同法操作12次得精制的靈芝孢子粉糖肽溶液，干燥得15.5g靈芝孢子粉糖肽(2)，得率1.55％，多糖含量為71.49％，酸水解氨基酸含量4.52mg/100mg。
實(shí)施例2：靈芝孢子粉糖肽的提取方法二
將過80目篩的靈芝孢子粉1kg置圓底燒瓶中，加入6倍量95％乙醇，加熱80℃，回流提取第一遍，提取時(shí)間為2小時(shí)，抽濾，得提取液1，藥渣加入5倍量95％乙醇，加熱80℃，回流提取第二、三遍，提取時(shí)間為1.5小時(shí)，抽濾，得提取液2、3，合并提取液1、2、3，減壓濃縮至無(wú)醇味，得濃醇提取濃縮液。
繼續(xù)向靈芝孢子粉藥渣中加入5倍量60％乙醇，加熱90℃，回流提取3次，每次1.5小時(shí)。抽濾，得提取液4、5、6，合并提取液4、5、6，減壓濃縮得300ml藥液，加入8倍量(2.4L)95％乙醇進(jìn)行醇沉，攪拌均勻，靜置24小時(shí)。抽濾，濾渣棄去，濾過的醇沉液減壓濃縮至無(wú)醇味，得稀醇提取濃縮液。
合并濃醇提取濃縮液和稀醇提取濃縮液，減壓濃縮至400ml藥液，向藥液中加入250ml乙醚，進(jìn)行萃取，共萃取8次，脫脂后的藥液(水層)加熱蒸至無(wú)乙醚味，加入純化水配制成400ml的藥液。
水浴加熱藥液，藥液溫度控制在50-60℃。先將2％SM-A天然硅膠溶液50ml加入到上述藥液中，攪拌均勻，保溫放置半小時(shí)；再將1％SM-B葡聚糖溶液1.67ml緩慢加入藥液中，邊加邊攪拌，放置至室溫，待藥液沉淀完全，離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速控制在3000轉(zhuǎn)左右，每次20分鐘，沉淀物舍棄，取上清液，減壓濃縮至100ml。
取除雜脫色的藥液，用HP-20大孔樹脂吸附至飽和，先用4BV的水以2BV/小時(shí)的流速?zèng)_洗，得A部分洗脫液；再用5BV的15％的乙醇以2BV/小時(shí)的流速?zèng)_洗，得B部分洗脫液；接著再用4BV的95％乙醇以3BV/小時(shí)的流速?zèng)_洗，得C部分洗脫液；三份洗脫液分別在-0.09MPa、70℃條件下，減壓濃縮回收乙醇，B部分(15％乙醇洗脫部分)干燥得1.92g靈芝孢子粉糖肽(1)，得率0.192％，多糖含量為19.04％，酸水解氨基酸含量17.85mg/100mg。
將濃醇和稀醇提取過的靈芝孢子粉藥渣風(fēng)干，向風(fēng)干后的藥渣中加入6倍量的純化水，加熱100℃，回流提取3次，每次1.5小時(shí)。抽濾，合并水提取液；靜置、過濾、減壓濃縮0.5L。向水提取濃縮液中加入5倍量的乙醇沉淀糖肽，攪拌均勻，靜置24小時(shí)。抽濾，濾出糖肽后干燥得粗孢子粉糖肽，加純化水配制成0.5L溶液，加入150ml的氯仿-正丁醇(4:1)振搖20分鐘，離心除去沉淀，上層溶液同法操作10次得精制的靈芝孢子粉糖肽溶液，干燥得13.8g靈芝孢子粉糖肽(2)，得率1.38％，多糖含量為70.82％，酸水解氨基酸含量4.35mg/100mg。
實(shí)施例3：靈芝孢子粉糖肽提取物的分子量檢測(cè)
將制備的靈芝孢子粉糖肽，采用高效凝膠色譜法測(cè)定分子量：
儀器：Agilent1260高效液相色譜儀
色譜柱：
預(yù)柱：TOSOH TSK-GUARDCOLUMN PWXL 6.0*40mm
TOSOH TSK-GEL G5000PWXL 7.8*300mm
TOSOH TSK-GEL G3000PWXL 7.8*300mm
預(yù)柱、G5000PWXL、G3000PWXL串聯(lián)
流動(dòng)相：0.2mol/L的氯化鈉水溶液
流速：0.6ml/min
柱溫：40℃
檢測(cè)器：Agilent示差折光檢測(cè)器40℃
色譜工作站：Agilent色譜工作站(帶GPC軟件)
Dextran標(biāo)準(zhǔn)分子量多糖：分子量范圍180-2000000，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所
取制備的靈芝孢子粉糖肽粉末1和2加水溶解，制成3mg/ml的溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，取20μl注入色譜柱，記錄色譜圖，GPC軟件計(jì)算兩者重均分子量為1000-2000。
實(shí)施例4：靈芝孢子粉糖肽提取物的動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn)
本試驗(yàn)例用于說(shuō)明靈芝孢子粉糖肽(由上述實(shí)施例1得到)對(duì)環(huán)磷酰胺所致小白鼠白細(xì)胞減少癥模型白細(xì)胞總數(shù)的影響。
動(dòng)物：昆明種小鼠，SPF級(jí)，雄性，20-22g。
實(shí)驗(yàn)第一天開始分組給藥。環(huán)磷酰胺注射液給藥體積為每10g小鼠腹腔注射0.2ml。環(huán)磷酰胺單用及聯(lián)合用藥均于實(shí)驗(yàn)第一天注射環(huán)磷酰胺1次。靈芝孢子粉糖肽(1)和(2)注射液給藥體積為每10g小鼠腹腔注射0.2ml，GM-CSF注射液給藥體積為每10g小鼠皮下注射給藥0.2ml，每日1次，連續(xù)給藥8天。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分7組，陰性對(duì)照組、環(huán)磷酰胺100mg/kg單用給藥組、環(huán)磷酰胺100mg/kg與GM-CSF 100μg/kg劑量組，環(huán)磷酰胺100mg/kg與靈芝孢子粉糖肽(1)-200mg/kg聯(lián)合用藥組，環(huán)磷酰胺100mg/kg與靈芝孢子粉糖肽(1)-400mg/kg聯(lián)合用藥組，環(huán)磷酰胺100mg/kg與靈芝孢子粉糖肽(2)-200mg/kg聯(lián)合用藥組，環(huán)磷酰胺100mg/kg與靈芝孢子粉糖肽(2)-400mg/kg聯(lián)合用藥組。每組12只動(dòng)物。于給予環(huán)磷酰胺前眼眶靜脈叢取血1次，于給予環(huán)磷酰胺后第3、5、7、9天眼眶靜脈叢取血，使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類。血細(xì)胞數(shù)量用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x(_)±SD)表示，并進(jìn)行各給藥組與陰性對(duì)照組之間，聯(lián)合用藥組與環(huán)磷酰胺單用組之間的t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺可使外周血白細(xì)胞數(shù)量明顯降低，與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異。靈芝孢子粉糖肽兩個(gè)劑量組白細(xì)胞總數(shù)明顯回升。具體結(jié)果見表1。
上述實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的舉例說(shuō)明，本發(fā)明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式實(shí)施，而不偏離本發(fā)明的要旨或本質(zhì)特征。因此，描述的實(shí)施方式從任何方面來(lái)看均應(yīng)視為說(shuō)明性而非限定性的。本發(fā)明的范圍應(yīng)由附加的權(quán)利要求說(shuō)明，任何與權(quán)利要求的意圖和范圍等效的變化也應(yīng)包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。